專利名稱：：重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域，具體涉及一種靶向性抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制備方法。
背景技術(shù)：
：心腦血管系統(tǒng)疾病是一類危害人類健康的重要疾病，每年約有1700萬人死于該疾病，因此多年來人們一直致力于研制有效的治療血栓的藥物。水蛭素是存在于醫(yī)用水蛭唾液腺中的單鏈多肽，由65個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為7KD，是最有效的天然凝血酶抑制劑，可作為抗栓藥物用于治療血栓性疾病。與肝素、阿司匹林等傳統(tǒng)的抗凝藥物相比，水蛭素用量小，療效高，無毒性，有又無明顯抗原性。同時(shí)水蛭素也存在一些問題，極大地影響了水蛭素的臨床應(yīng)用①過量的水蛭素會(huì)容易引起非溶栓部位出血，發(fā)生明顯的全身出血現(xiàn)象，并且水蛭素所致的全身出血沒有良好的對(duì)抗藥物；②水蛭素只有特異的抗凝血酶活性，功能單一，不能從多個(gè)途徑阻斷血栓的形成，僅能有效地防治靜脈血栓，而不能防治動(dòng)脈血栓。(D傳統(tǒng)方法從醫(yī)用水蛭中提取獲得天然水蛭素，產(chǎn)量很低，價(jià)格非常曰蟲卬貝o凝血因子FXa在凝血途徑中處于關(guān)鍵和核心位置。FXa在游離狀態(tài)下活性很低，但在血栓部位活性將顯著提高，可特異地識(shí)別FXa識(shí)別序列l(wèi)ie-Glu-Gly-Arg并將其全部切下。如果在水蛭素N端融合FXa識(shí)別序列，在非血栓部位，水蛭素N端被封閉而喪失其抗凝活性；在血栓部位，活化的FXa會(huì)將FXa識(shí)別序列特異地全部切下，釋放出水蛭素抗凝活性，使水蛭素靶向性地在血栓部位體現(xiàn)出抗凝的功能而減少出血副作用。糖蛋白(GP)IIb2IIIa是血小板膜上含量最豐富的一種蛋白質(zhì)，其與血纖維蛋白原的結(jié)合被認(rèn)為是血小板聚集的最終共同途徑。在血小板被活化后，GPIIb2IIIa能通過識(shí)別配體上的RGD序列(Arg-Gly-A印)與血纖維蛋白原相結(jié)合。因此利用RGD肽競(jìng)爭(zhēng)性的阻斷它們的相互作用，從而抑制血小板的聚集就成為治療血栓性疾病的一種有效手段。將RGD三肽序列引入水蛭素3235位突變位點(diǎn)，能在保留水蛭素抗凝活性的同時(shí)，也增加了抗血小板聚集的活性(ZhangYG,YueL，SongHY.DesignofaNovelPlasminogenActivatorBasedontheStructureofHirudin.ActaBiochimicaetBiophysicaSinica,2006,38:531-536.)因此，將抗凝血酶藥物和抗血小板聚集藥物組合形成融合抗栓劑已成為抗血栓藥物發(fā)展的新方向。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種高效的表達(dá)系統(tǒng)，和其它原核、真核表達(dá)系統(tǒng)相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)具有強(qiáng)有力的醇氧化酶基因(AOX)啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)，外源蛋白表達(dá)量高；畢赤酵母無內(nèi)源型載體，外源目的基因需整合到宿主染色體上實(shí)現(xiàn)整合型表達(dá)，穩(wěn)定性高；畢赤酵母可分泌表達(dá)外源蛋白，自身分泌的蛋白非常少，因此非常有利于目的蛋白的純化；畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；⒌鞍琢姿峄确g后修飾加工功能；發(fā)酵工藝成熟，易放大，培養(yǎng)基不含蛋白，較廉價(jià)，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的，是提供一種重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白(FXa-RGD-HV)。它由抗凝血酶活性和抗血小板聚集的RGD-HV及其N端的FXa識(shí)別序列組成。本發(fā)明的重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白包括兩個(gè)主體部分，一個(gè)是在融合蛋白N端的FXa識(shí)別序列(lie-Glu-Gly-Arg)，增加融合蛋白的耙向性而降低出血的副作用；另一個(gè)是含有64個(gè)氨基酸殘基的抗凝血酶活性和抗血小板聚集的雙功能水蛭素變異體(命名為RGD-HVX序列表SEQIDNO:1)，其氨基酸序列是在天然水蛭素的3235位突變位點(diǎn)引入RGD三肽序列所組成的，從而在抗凝血酶活性的基礎(chǔ)上增加抗血小板聚集作用。為了便于融合蛋白的分離純化，本發(fā)明在融合蛋白N端引入9XHis-tag用于蛋白親和層析，并在9XHis-tag和融合蛋白之間加入腸激酶(EK)酶切位點(diǎn)(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，以便于去除親和層析純化后融合蛋白的9XHis-tag。本發(fā)明所述的融合蛋白的氨基酸序列從N端依次為9XHis-tag、EK酶切位點(diǎn)、FXa識(shí)別序列和RGD-HV(序列表SEQIDNO:2)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列(序列表SEQIDNO:3)和攜帶該DNA序列的重組表達(dá)載體。根據(jù)融合蛋白的氨基酸序列，參照畢赤酵母密碼子偏好性，確定融合蛋白的編碼基因序列。并且根據(jù)基因序列以及畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K上的多克隆位點(diǎn)的特征，在基因序列兩端增加^5bo7n:和7V"i酶切位點(diǎn)，以便于構(gòu)建入表達(dá)載體，設(shè)計(jì)其基因序列。本發(fā)明根據(jù)設(shè)計(jì)的基因序列，合成了六條引物，經(jīng)三輪pcr拼接獲得目的基因。將目的基因與畢赤酵母載體pPIC9K質(zhì)粒重組構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。為保證重組融合蛋白能形成正確的空間構(gòu)像，所表達(dá)的重組融合蛋白最好是以可溶性形式存在。本發(fā)明的融合蛋白的重組表達(dá)載體為pPIC9K/FXa-RGD-HV質(zhì)粒。表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的宿主可以是細(xì)菌、酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，優(yōu)選地，真核表達(dá)的宿主是畢赤酵母。本發(fā)明的又一個(gè)目的，是提供制備一種重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白的方法。電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115宿主菌，經(jīng)G418篩選得到高表達(dá)的陽(yáng)性克隆，鑒定為甲醇利用快型(Mut+)。在搖瓶中實(shí)現(xiàn)融合蛋白的高效、穩(wěn)定和分泌性表達(dá)。培養(yǎng)液上清經(jīng)超濾離心、親和層析純化到單一的FXa-RGD-HV融合蛋白。對(duì)于分泌表達(dá)的FXa-RGD-HV融合蛋白可以通過多種方法從菌液上清中進(jìn)行提取、純化，這些方法包括粗提、透析、超濾及液相層析等本領(lǐng)域常用的技術(shù)，其中液相層析又包括了離子交換、親和、疏水等層析技術(shù)。本發(fā)明主要是用His-tag親和層析柱進(jìn)行純化。因此，制備本融合蛋白的方法，包括以下步驟1.FXa-RGD-HV基因的拼接克?。?.pPIC9K/FXa-RGD-HV表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；3.FXa-RGD-HV融合蛋白的純化。本發(fā)明的融合蛋白可用于預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病，這些疾病包括深層靜脈血栓、急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛、急性或慢性血管內(nèi)凝血、肝素引起的血小板減少癥、血栓溶解后再栓塞等。此外還能防止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，配合化學(xué)治療和放射治療，可促進(jìn)腫瘤中的血流量從而增強(qiáng)療效；還有抑制凝血酶在急性腦出血時(shí)對(duì)腦組織的損傷作用；減輕凝血酶所致的腦組織水腫和離子含量的變化，阻斷凝血酶對(duì)血腦屏障的破壞作用；抑制凝血酶介導(dǎo)的神經(jīng)胞凋亡和刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化、增生、分泌細(xì)胞因子等作用。還能夠降低蛋白尿，改善腎功能，降低血脂，具有抗凝抗血栓形成、改變血液流變性、抗炎、抗增殖和抗纖維化等多種藥理活性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是水蛭素是凝血酶的特異性抑制劑，能有效地防止纖維蛋白和血細(xì)胞結(jié)合形成血凝塊，并抑制游離的和凝血塊上的凝血酶，所以可防止各類血栓的形成及延伸。本發(fā)明在保證天然水蛭素抗凝血酶功能的基礎(chǔ)上，將FXa(Ile-Glu-Gly-Arg)識(shí)別序列融合到水蛭素N端，使其在被切割前封閉水蛭素，被特異識(shí)別切割后釋放水蛭素的抗凝功能，增加耙向性而降低出血的副作用；將RGD(Arg-Gly-Asp)三肽序列融合在水蛭素32-35突變位點(diǎn)，增強(qiáng)抗血小板聚集作用而增加其防治動(dòng)脈血栓的活性而使其抗栓功能更全面。融合后的蛋白分子量增加很少，因此在理論上不會(huì)增加其免疫原性和毒性。因此，本發(fā)明融合蛋白能夠靶向性地抑制血栓的形成，具有抗凝血酶活性和血小板聚集活性雙功能，副作用小，適用于預(yù)防和治療各種靜脈性和動(dòng)脈性血栓性疾病，效果良好。圖1為FXa-RGD-HV基因的克隆；圖2為pPIC9K/FXa-RGD-HV重組質(zhì)粒的構(gòu)建；圖3為FXa-RGD-HV融合蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果；圖4為FXa-RGD-HV融合蛋白的Westernblot鑒定結(jié)果。具體實(shí)施方式材料1.PyrobestTMDNAPolymerasePCR試劑盒(Takara公司產(chǎn)品，中國(guó)大連)2.pMD18-T載體克隆試劑盒(Takara公司產(chǎn)品，中國(guó)大連)3.T4DNA連接酶(Takara公司產(chǎn)品，中國(guó)大連)4.￡boW、船rt、&/[等內(nèi)切酶(Takara公司產(chǎn)品，中國(guó)大連)5.質(zhì)粒載體pPIC9K(Invitrogen公司產(chǎn)品，美國(guó))6.質(zhì)粒小量制備試劑盒(百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，中國(guó)北京)7.DNA凝膠回收試劑盒(上海博亞公司產(chǎn)品，屮國(guó)上海)8.HiTrapprepackedcolumns(Pharmacia公司產(chǎn)品，美國(guó))9.大腸桿菌JM109(Takara公司產(chǎn)品，中國(guó)大連)10.酵母菌GS115(Invitrogen公司產(chǎn)品，美國(guó))11.BCA蛋白定量試劑盒(北京天泰生物公司產(chǎn)品，中國(guó)北京)12.G418、氨節(jié)青霉素(Roche公司產(chǎn)品，德國(guó))13.天然水蛭素、纖維蛋白原、(Sigma公司產(chǎn)品，美國(guó))14.酵母提取物、胰蛋白胨、右旋糖、無氨基酸酵母氮源(Oxford公司產(chǎn)品，美國(guó))15.LB培養(yǎng)基酵母提取物5g胰蛋白胨10gNaCl10g溶于1000ml去離子水中，并用lmol/L的Na0H調(diào)節(jié)pH值至7.0，高壓蒸汽滅菌。16.YPD培養(yǎng)基酵母提取物2g胰蛋白胨4g溶于180ml去離子水中，高壓滅菌。冷卻后加入20ml經(jīng)濾器除菌后的2TO的右旋糖和0.2ml濃度為100mg/ml的氨芐青霉素。17.磷酸鹽緩沖液NaCl8gKC10.2g歸PO.!1.44gKH2P040.24g溶于水1000ml，并用HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4，高壓滅菌。18.BMGY培養(yǎng)基酵母提取物2g胰蛋白胨4g溶于140ml去離子水中，高壓滅菌。冷卻后加入20ml濾器除菌后濃度為13.4%的無氨基酸酵母氮源貯存液、20mllmol/L磷酸鹽緩沖液、20ml10%甘油、0.4ml0.02%生物素和0.2ml100mg/ml的氨芐青霉素。19.畫MY培養(yǎng)基酵母提取物2g胰蛋白胨4g溶于140ml去離子水中，高壓滅菌。冷卻后加入20ml濾器除菌后濃度為13.4%的無氨基酸酵母氮源貯存液、20mllmol/L磷酸鹽緩沖液、20ml5%甲醇、Q.4ml0.02°/。生物素和0.2ml100mg/ml的氨芐青霉素。20.腸激酶(重慶科潤(rùn)生物醫(yī)藥公司產(chǎn)品，中國(guó)重慶)21.FXa(Promega公司產(chǎn)品，美國(guó))實(shí)施例1:FXa-RGD-HV的克隆根據(jù)FXa-RGD-HV融合蛋白序列和酵母密碼子偏好性確定FXa-RGD~HV基因序列，設(shè)計(jì)六條引物，經(jīng)過三輪PCR擴(kuò)增得到FXa-RGD^HV基因片斷。擴(kuò)增所用的六條引物堿基序列如下Hvl:Hv2:Hv4:5'-AACGCATTGGTTCTTATCACCACGACCAAGAATGCACTT-3，Hv5:-3,三輪PCR的反應(yīng)體系均為50ul，其屮含引物各5Opmo1，40服o1的dNTP，10XPCR反應(yīng)緩沖液5ul，taq酶2U。PCR的反應(yīng)條件為第一階段95。C預(yù)變性5分鐘；第二階段94'C變性1分鐘，55。C退火1分鐘，72。C延伸1分鐘，循環(huán)32次；第三階段72。C延伸5分鐘。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)可見約250bp大小電泳帶，將PCR產(chǎn)物回收、純化后與pMD18-T載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素篩選后，挑取LB平板上的克隆于LB液體培養(yǎng)基中37"C振蕩過夜，次日提取質(zhì)粒DNA，用PCR鑒定，對(duì)于有250bp大小DNA片段出現(xiàn)的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明陽(yáng)性重組質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)中插入的DNA片段即是完整的FXa-RGD^HV，該重組質(zhì)粒命名為pMD-FXa-RGD-HV。參見圖1，經(jīng)三輪PCR拼接后，1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示，有一條與目的基因(269bp)大小基本相符的清晰條帶。實(shí)施例2:融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定參見圖2，為了把融合蛋白基因連接入表達(dá)載體pPIC9K中，設(shè)計(jì)了兩條引物A、B，在上游引物A上引入&oM酶切位點(diǎn)和9XHis序列，在下游引物B上引入vfert酶切位點(diǎn)，并且分別加上保護(hù)堿基，這兩條引物可以使目的基因定向插入到表達(dá)載體pPIC9K中。兩條引物A、B如下A:A-3，B:5'-TTGCGGCCGCTTATTGAAGGTAATCCTCAG-3,用引物A和引物B，以克隆載體為模板，PCR的擴(kuò)增條件同上。擴(kuò)增到5，端引入^oM酶切位點(diǎn)和9XHis序列，3，端引入7Vbd酶切位點(diǎn)的目的基因，所獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)為270bp左右，純化PCR產(chǎn)物。對(duì)目的基因和pPIC9K進(jìn)行fcoAI和yfert雙酶切，純化回收片斷后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。篩選出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后送到上海英駿生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明在pPIC9K質(zhì)粒的和油tl位點(diǎn)之間插入有與序列信息表SEQIDN03堿基序列一致的DM片段。該重組質(zhì)粒命名為pP工C9K/FXa-RGD-HV。對(duì)測(cè)序正確的pPIC9K/FXa-RGD-HV質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶線性化后，電穿孔轉(zhuǎn)化畢赤酵母，如表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化并整合到畢赤酵母中，轉(zhuǎn)化子則可以在不含His的MDS平板上正常生長(zhǎng)，否則就不能生長(zhǎng)。經(jīng)過His營(yíng)養(yǎng)缺陷平板的初篩，獲得了大量陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。在MDS平板上，3ug的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化總共得到了250多個(gè)轉(zhuǎn)化子。在不含組氨酸的MDS培養(yǎng)基上完成初篩后，選取MDS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌落150個(gè)，接種到G418抗性平板上完成復(fù)篩。將所選菌落接種到G418抗性平板上的同時(shí)，接種到MD和MM平板對(duì)應(yīng)的位置上完成表型Mut+鑒定。菌落PCR鑒定FXa-RGD-HV融合基因DNA片段的存在(方法同前)，結(jié)果選出在MD和MM平板上都能正常生長(zhǎng)，并能在G418抗性平板上生長(zhǎng)的抗G418、Mut+轉(zhuǎn)化子5個(gè)。將篩選出來的5個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集上清液。各取lml培養(yǎng)96h的上清液，超濾離心至50u1，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)這5個(gè)轉(zhuǎn)化子的蛋白表達(dá)量，并做Westernblot驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)。最終獲得一個(gè)高表達(dá)的重組菌株。加甘油于-8(TC凍存。根據(jù)凝血酶滴定法("凝血酶滴定法測(cè)定水蛭素活性的改進(jìn)"陳華友，刑自力，李媛媛，《生物技術(shù)》，2002，12:24-25)，測(cè)定此高表達(dá)重組菌株在各誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)的單位抗凝活性，確定較合適的誘導(dǎo)時(shí)間為48小時(shí)，重組菌株搖瓶表達(dá)的上清液?jiǎn)挝豢鼓钚圆恍∮?80ATU/ml。實(shí)施例3:工程酵母的培養(yǎng)及融合蛋白的表達(dá)與純化取-8(TC保存的含有pPIC9K/FXa-RGD-HV的酵母工程菌種接種于YPD平板活化，挑取外觀優(yōu)良的單個(gè)菌落接種于BMGY培養(yǎng)基，28"C3(TC恒溫?fù)u床280rpm振蕩培養(yǎng)1618小時(shí)至0D600"1，將所得的菌液置于1L三角瓶中，用雙層滅菌紗布封口，300rpm，30°C震蕩培養(yǎng)，每24h向培養(yǎng)基中添加無菌甲醇至終濃度為1.0。/。，48h后停止培養(yǎng)，離心菌液收集上清液。對(duì)搖瓶培養(yǎng)的菌液離心得到的上清液進(jìn)行超濾離心，將100ml上清液濃縮為10ml，去除培養(yǎng)基成分，同時(shí)更換為親和層析進(jìn)樣緩沖液。用AKTA層析儀和HiTrapChelatingHPColumns(Pharmacia)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行親和層析純化，經(jīng)二次重復(fù)上樣，柱洗脫時(shí)出現(xiàn)一個(gè)蛋白洗脫峰，說明有帶His-tag的蛋白被親和層析純化出來。對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳(如圖3)，樣品O為純化上樣前總蛋白，樣品0'為純化過柱后未親和吸附的產(chǎn)物，樣品1-4為依次洗脫的目的蛋白。純化結(jié)果表明，依次洗脫的純化產(chǎn)物中第3號(hào)產(chǎn)物的雜蛋白較少，有一條單一明亮的目的蛋白條帶，純化效果好。根據(jù)常用的BCA法，取純化后的蛋白溶液，測(cè)定溶液中總蛋白的濃度為1.54mg/ml。實(shí)施例4:重組FXa-RGD-HV融合蛋白的鑒定融合蛋白的N端有9XHis-tag，因此可以用Anti-HisAntibody對(duì)目的蛋白進(jìn)行WesternBlot鑒定。分離純化的重組FXa-RGD-HV融合蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，通過電轉(zhuǎn)移將PAGE膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。尼龍膜用高濃度蛋白質(zhì)進(jìn)行封閉，然后用His抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，用洗液漂洗尼龍膜，加顯色試劑進(jìn)行顯色。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果如圖4所示，樣品1為親和層析純化后產(chǎn)物，樣品2為親和層析純化前的超濾產(chǎn)物，樣品0為未誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)照。結(jié)果表明，目的蛋白在甲醇誘導(dǎo)前無表達(dá)，甲醇誘導(dǎo)能使重組菌株表達(dá)外源蛋白，經(jīng)超濾離心和親和層析純化后，在菌液上清中分離出單一的目的蛋白。分別用蛋白酶EK和FXa切割鑒定融合蛋白。結(jié)果表明，目的蛋白可以分別被兩種蛋白酶切割開，切開的片段基本符合預(yù)期，這說明目的蛋白可以進(jìn)行下一步的活性實(shí)驗(yàn)，并還證明純化出的蛋白為目的蛋白。實(shí)施例5:重組FXa-RGD^HV融合蛋白的抗凝血酶活性測(cè)定根據(jù)凝血酶滴定法方法("凝血酶滴定法測(cè)定水蛭素活性的改進(jìn)"陳華友，刑自力，李媛媛，《生物技術(shù)》，2002,12:24-25)，對(duì)待測(cè)蛋白的抗凝血酶活性進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算抗凝血酶比活性。待測(cè)樣品A為帶有9XHis-tag的FXa-RGD-HV融合蛋白；待測(cè)樣品B為經(jīng)EK完全切割后的FXa-RGD-HV，即是本發(fā)明中的目的融合蛋白；待測(cè)樣品C為經(jīng)FXa完全切割后的RGD-HV，即是模擬體內(nèi)被靶向性切割活化的雙功能水蛭素；待測(cè)樣品D為標(biāo)準(zhǔn)水蛭素0.1mg/ml。測(cè)定結(jié)果如表l:表i目的蛋白抗凝血酶活性測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N端帶有9XHis、EK識(shí)別序列和FXa識(shí)別序列的融合蛋白抗凝活性極低，說明水蛭素的N端如有較長(zhǎng)氨基酸封閉會(huì)喪失絕大部分抗凝活性；去除9XHis、EK識(shí)別序列后，融合蛋白的N端仍有FXa識(shí)別序列，不能完全封閉水蛭素的抗凝功能；經(jīng)FXa完全切割后的融合蛋白釋放出了水蛭素的抗凝活性，與天然水蛭素基本相同。表明純化出的蛋白抗凝血酶活性較高，基本上達(dá)到天然水蛭素的抗凝效果。經(jīng)過體外酶切融合蛋白并測(cè)定其抗凝活性，顯示融合蛋白具有耙向型，能在一定程度上減小水蛭素出血的副作用。實(shí)施例6:重組FXa-RGD-HV融合蛋白抗血小板聚集活性測(cè)定采用比濁法測(cè)定抗血小板聚集活性。基本實(shí)驗(yàn)過程為(l)健康成人男性靜脈取血3ml，3.8%枸櫞酸鈉1:9抗凝，700rpm離心10min,分離富含血小板血漿(PRP)。4000rpm離心15min，分離貧血小板血漿(PPP)。用PPP稀釋PRP,使血小板數(shù)量為25-30萬個(gè)/ul.(2)取200ulPPP加入比色杯中，插入檢測(cè)孔，調(diào)零。(3)取200ulPRP加入比色杯中，插入檢測(cè)孔，加入37"預(yù)熱的ADP(200uM)5ul(終濃度5uM)。(4)觀察5分鐘聚集率變化，打印聚集曲線。以最大聚集率(PAG(M))為觀察指標(biāo)，此最大聚集率為空白對(duì)照，應(yīng)大于50%(小于50%，應(yīng)重新取血)。(5)取200ulPRP加入比色杯中，分別加入FXa-RGI^HV融合蛋白溶液5ul(濃度為0.04mg/ml;終濃度為0.001mg/ml)，室溫放置15min，加入37"C預(yù)熱的ADP(200uM)5ul(終濃度5uM)，測(cè)定最大血小板聚集率。血小板聚集抑制率(％)=(對(duì)照血小板聚集％-重組蛋白血小板聚集%)/對(duì)照血小板聚集％X100%。測(cè)定結(jié)果如表2:表2目的蛋白抗血小板凝集活性測(cè)定結(jié)果待測(cè)樣品ADP(5uM)生理鹽水FXa-RGD-HV(0.00lmg/ml)最大血小板聚集率PAG(M)92.7%94.2%74.7%抗血小板聚集率——20.7%實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以生理鹽水為對(duì)照，重組FXa-RGD-HV融合蛋白濃度為0.001mg/ml時(shí)抗血小板聚集活性為20.7%，說明重組FXa-RGD-HV融合蛋白具有很好的抗血小板聚集功能。結(jié)論由于凝血酶和血小板聚集誘發(fā)的血液凝固是誘導(dǎo)血管血栓形成的重要因素，因此，從實(shí)施例5和實(shí)施例6的結(jié)果可以表明，重組融合蛋白中的水蛭素成分能有效地防止纖維蛋白和血細(xì)胞結(jié)合形成血凝塊，并抑制游離的和凝血塊上的凝血酶，所以可防止各類血栓的形成及延伸，將FXa識(shí)別序列融合到水蛭素N端可以增強(qiáng)水蛭素的靶向性而減少出血副作用，將RGD三肽序列融合在水蛭素的合理部位可以增強(qiáng)抗血小板聚集作用而增加其防治動(dòng)脈血栓的活性。可以用于預(yù)防和治療各種靜脈及動(dòng)脈血栓疾病，效果良好。本發(fā)明為采用重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集融合蛋白在臨床上預(yù)防和治療血栓性疾病提供了新的途徑。序列表<110>重慶大學(xué)<120>重組耙向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制備方法〈130〉<160〉4<170>Patentlnversion3.2〈210>1<211>192〈212>腿<213>氨基酸序列在天然水蛭素HV2的3235位突變位點(diǎn)引入RGD三肽序列組成<400〉1valvaltyrthraspcysthrgluserglyglnasnleucysleucysgluglyserasn60valcysglyglnglyasnlyscysileleuglyargglyasplysasnglncysvalthr120glygluglythrprolysproglnserhisasnaspglyasppheglugluileproglu180'asptyrleugIn192〈210〉2〈211〉246<212〉DNA<213>融合蛋白的氨基酸序列從N端依次為9XHis-tag、EK酶切位點(diǎn)、FXa識(shí)別序列和RGD-HV〈400>2hishishishishishishishishisaspaspaspasplysilegluglyargvalval60tyrthraspcysthrgluserglyglnasnleucysleucysgluglyserasnvalcys120glyglnglyasnlyscysileleuglyargglyasplysasnglncysvalthrglyglu180glythrprolysproglnserhisasnaspglyasppheglugluileprogluasptyr240leugln246<210〉3<211〉269〈212〉DNA<213>融合蛋白的基因序列兩端增加EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)，以便于構(gòu)建入表達(dá)載體<400〉3gaattccaccaccaccaccaccaccaccaccacggatccgatgatgatgataagattgag60ggtcgtgttgtttacsctgattgcaccgsgtctggtcasaacctttgcctttgcgagggt120tccaacgtttgcggtcaaggtaacaagtgcattcttggtcgtggtgataagaaccaatgc180gttactggtgaaggtactcctaagcctcaatctcstaacgatggtgacttcgsagaaatt240'cctgaggstta_ccttca_a_tsagcggccgc269權(quán)利要求1.一種重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白，其特征在于由靶向的FXa識(shí)別序列和抗凝血酶活性和抗血小板聚集的RGD-HV組成，所述融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO2所述。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白，其特征在于RGD-HV的氨基酸具有SEQIDNO:1序列，RGD序列位于水蛭素32-35突變位點(diǎn)；FXa識(shí)別序列為人FXa凝血因子的識(shí)別序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白，其特征在于FXa識(shí)別序列位于融合蛋白的N-末端，RGD-HV位于融合蛋白的C-末端。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白，其特征在于所述重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白的N端融合有一個(gè)9XHis-tag。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組靶向雙功能水蛭素的融合蛋白，其特征在于所述重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白與9XHis-tag之間有一個(gè)腸激酶酶切位點(diǎn)。6.編碼權(quán)利要求1-5中重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白的DNA序列，具有SEQIDNO:3的DNA序列。7.包含權(quán)利要求5所述的DM序列的重組表達(dá)載體pPIC9K/FXa-RGD-HV。8.制備重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白的方法，包括用權(quán)利要求6重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，分離、純化所述重組靶向雙功能水蛭素的融合蛋白。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白的方法，其特征在于表達(dá)系統(tǒng)的宿主為畢赤酵母GS115。10.權(quán)利要求1所述的重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的的融合蛋白用于制備靜脈和動(dòng)脈血栓性疾病的藥物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的抗血栓的融合蛋白，它包括靶向的FXa識(shí)別序列和抗凝血酶活性和抗血小板聚集的RGD-HV，本發(fā)明還公開了重組靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的抗血栓的融合蛋白制備方法和用途。本發(fā)明融合蛋白可防止各類血栓的形成及延伸，能夠靶向性地抑制血栓的形成，具有抗凝血酶活性和血小板聚集活性雙功能，副作用小，適用于預(yù)防和治療各種靜脈性和動(dòng)脈性血栓性疾病，效果良好。文檔編號(hào)A61P7/02GK101284877SQ20081006978公開日2008年10月15日申請(qǐng)日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日發(fā)明者候曉姝,寧張,勇李,胡宗利,陳國(guó)平,峰顧申請(qǐng)人:重慶大學(xué)