專利名稱：培養(yǎng)和包被的胰腺干細胞的制作方法
相關申請的交叉參照本申請要求2001年12月21日提交的臨時申請第60/342,250號的優(yōu)先權，其內(nèi)容在此全文引為參考。
關于由聯(lián)邦政府資助的研究和進展所作的有關發(fā)明權利的聲明不適用對“序列表”、表格或以光盤提交的計算機程序列表附件的參照不適用發(fā)明領域本發(fā)明涉及到發(fā)現(xiàn)存在的中間的、分化階段的胰腺干細胞，該干細胞能在可形成穩(wěn)定細胞培養(yǎng)物的環(huán)境下原位包被并成熟，該培養(yǎng)物可產(chǎn)生葡萄糖反應性的胰島素。這些細胞的價值在于它們在培養(yǎng)過程中既能擴增而且穩(wěn)定，并能向后期階段發(fā)展。本發(fā)明避免了在體外將這些中間分化階段的細胞培養(yǎng)成末期階段的胰腺細胞的步驟。
背景技術：
哺乳動物的胰腺是由胚胎的前腸芽發(fā)展而來的，在胚胎的前腸芽生長過程中，通過形態(tài)分化形成導管系統(tǒng)。在腹部與背原基融合后，新的組織生長并成熟形成兩連鎖結構外分泌系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)。胰腺主要是由產(chǎn)生消化酶的腺泡細胞組成。內(nèi)分泌系統(tǒng)包括產(chǎn)生胰島素的β-細胞，產(chǎn)生胰高血糖素的α-細胞，產(chǎn)生生長激素抑制素的δ-細胞。這些內(nèi)分泌細胞聚集在一起形成所謂的胰島。
動物研究表明，β-細胞的形成至少有兩種機制由導管前體細胞再生和由成熟β-細胞復制，分化的β-細胞形成后就一直復制而形成成熟體。對胰島素的需求增加會加速β-細胞的復制，例如，由于高葡萄糖輸入、部分胰切除及懷孕期間導致的胰島素需求增加。在這些情況下，β-細胞群通過細胞膨大(增大單個細胞的體積)和細胞增生(增加β-細胞的數(shù)量)而迅速增加。
在I型或胰島素依賴型糖尿病(IDDM)中，由于針對β-細胞的自體免疫攻擊，β-細胞的數(shù)量明顯減少。Eisenbarth，N.Eng.J.Med.3141360-1386(1986)。I型糖尿病的治療包括增加患I型糖尿病患者中β-細胞的數(shù)量。Bonner-Weir，Endocrin.1411926-1929(2000)。
用胰島細胞對糖尿病進行治療的另一方法包括將免疫匹配的供者胰腺組織移植到移植受者中。一般地，需要對移植受者進行免疫抑制治療以防止移植器官的排斥。近來，成熟的免疫抑制方案已經(jīng)改善了人臨床胰島移植的效果。然而，該技術只是試驗性的，如果胰島細胞移植能實現(xiàn)與整個胰腺器官移植一樣的功能，那么這種更加簡單的治療方法將會在糖尿病治療中發(fā)揮重要作用。
雖然人胰島的移植有望成為治療糖尿病的有效方法，但是目前還存在許多困難而限制了該方法的應用。其主要困難是不能產(chǎn)生足夠量的用來使用的胰島細胞。目前，獲得用于移植胰島的方法一般包括分離胰腺組織，酶消化胰腺組織以從周圍組織中釋放出單個細胞，及使用梯度離心純化技術。梯度離心純化技術是本領域已知的并被多個胰島移植中心采用的方法。不幸地是用該標準方法處理單個胰腺的胰島產(chǎn)量通常不夠用于移植。因此，人們已經(jīng)尋求并設計出這種方法的替換方法。
一種選擇性地使中間階段的胰腺干細胞增殖的方法已經(jīng)形成。簡言之，從供者的胰腺中分離細胞后，將細胞在高血清培養(yǎng)液中復性，然后轉到低血清培養(yǎng)液中以促進中間階段胰腺干細胞的生長。通過在條件培養(yǎng)皿中生長成融合單層，這些細胞能成熟形成胰島素分泌細胞集落。但是，這些聚集的細胞在臨床使用中受到限制，因為如果直接移植的話，這些細胞可能會導致宿主產(chǎn)生有害的免疫反應。


圖1圖1顯示了移植前包被的增殖的P3集落。這些細胞針對(A)CK19-1，(B)胰島素，(C)胰高血糖素，(D)生長激素抑制素進行免疫染色，放大倍數(shù)為60×。
圖2圖2顯示了200個液態(tài)膠囊中的P3細胞，105HD394i移植前和移植后SCID小鼠的血液葡萄糖水平。
圖3圖3顯示了從動物中切除之后包被的增殖的P3集落。這些細胞用胰島素特異性抗體染色，放大倍數(shù)如下(A)區(qū)域1，4×；(B)區(qū)域1，10×；(C)區(qū)域1，60×；(D)區(qū)域2，10×；(E)區(qū)域2，60×；(F)區(qū)域2，60×。
圖4圖4顯示了對(A)CK19-1，(B)PDX-1，(C)胰島素，(D)胰高血糖素，(E)生長激素抑制素免疫著色，培養(yǎng)6個月后的包被的分離島，放大倍數(shù)為60×。
圖5圖5顯示了對(A)CK19-1，(B)PDX-1，(C)胰島素，(D)胰高血糖素，(E)生長激素抑制素和(F)淀粉酶免疫染色，培養(yǎng)28個月后的包被的分離胰島，放大倍數(shù)為60×。
圖6圖6顯示了持續(xù)培養(yǎng)9個月以上的4,000個包被的HD357胰島(在200個膠囊中)移植前和移植后裸鼠的血液葡萄糖水平。在第118天回收100個移植的膠囊。
圖7圖7顯示了4,000個包被的HD357胰島(在200個膠囊中)受者的口服葡萄糖耐量試驗的結果，該檢查在移植35天后進行。
圖8圖8顯示了人固有胰腺的蛋白表達，針對下列蛋白(A)CK19-1，(B)PDX-1，(C)胰島素，(D)胰高血糖素，(E)淀粉酶對樣品進行免疫染色。放大倍數(shù)為60×。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過包被用于繁殖胰腺細胞的細胞培養(yǎng)物來原位向哺乳動物提供胰島素的方法，其中該細胞培養(yǎng)物具有如下屬性(i)具有能夠以約180個細胞/平方厘米的初始濃度從一個培養(yǎng)容器傳代到另一個容器并擴增到約1800個細胞/平方厘米的能力，及(ii)在擴增和未擴增的細胞中90％是PDX-1陽性，且胰島素肌動蛋白mRNA比率為1∶100～1000∶1。包被后，將該細胞移植或植入到哺乳動物中以使細胞成熟成胰島素分泌細胞。
在一個實施方案中，上述細胞成熟成細胞集落，該細胞集落包括CK19-陽性細胞覆蓋層和50-5000個胰腺細胞形成的內(nèi)細胞團，其直徑為50-300微米。在本發(fā)明的另一實施方案中，哺乳動物是糖尿病人。
在本發(fā)明的一個方面中，上述細胞培養(yǎng)物的胰島素肌動蛋白mRNA比率為1∶10～100∶1。
在另一實施方案中，包被包括如下步驟用藻酸鹽包裹細胞以形成膠囊，用二價陽離子交聯(lián)藻酸鹽，及提供多聚賴氨酸膜密封該膠囊。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了包被的胰腺細胞，該包被的胰腺細胞具有如下屬性(i)擴增的能力，及(ii)在擴增和未擴增的細胞中90％是PDX-1陽性，且胰島素∶肌動蛋白mRNA比率為1∶100～1000∶1。
定義“包被”是指將細胞用生物相容性非細胞材料，如藻酸鈉和多聚賴氨酸包裹的過程。優(yōu)選地，小分子，如糖和低分子量蛋白質能從包被細胞的周圍環(huán)境中吸收或分泌到包被細胞的周圍環(huán)境中，同時，大分子和免疫細胞進入包被細胞受到限制。
“原位”是指細胞在包被狀態(tài)下成熟或生長。原位生長或成熟可以在培養(yǎng)容器中或在植入到哺乳動物后發(fā)生。
“成熟的”或“成熟”是指細胞從未分化狀態(tài)發(fā)展成為分化狀態(tài)的過程。例如，未分化的胰腺細胞能增生并表達特征標記，如PDX-1。成熟的胰腺細胞不能增生，能分泌高水平的胰腺內(nèi)分泌激素，如成熟的β-細胞高水平分泌胰島素。細胞相互作用和成熟的改變包括細胞丟失未分化細胞的標記或獲得分化細胞的標記。單個標記的丟失或獲得能表明細胞已經(jīng)“成熟”。
細胞的“集落”在本文中是指三維結構。
“CK-19”是40Kd的酸性角蛋白，即細胞角蛋白19。
用凝膠掃描儀掃描條帶密度或對不同標記的胰島素和肌動蛋白進行實時PCR檢測，分析“胰島素∶肌動蛋白mRNA比率”，其是一個細胞群的平均數(shù)。
“植入”是細胞向受者的移植或接入。其包括包被的細胞和未包被的細胞。該細胞能用本領域已知的方法皮下、肌肉內(nèi)、口內(nèi)(intraportally)或腹腔內(nèi)(interperitoneally)植入。
以單層附著在表面生長的細胞的“傳代”是指被接種的培養(yǎng)容器從部分融合單層狀態(tài)向融合單層狀態(tài)的轉變，這時細胞能從該培養(yǎng)容器中移出，以低密度再接種到培養(yǎng)容器中。然而，在達到融合單層之前也可傳代。在它們生長成融合單層時，傳代通常能使細胞數(shù)量擴增，細胞群落的擴增依賴于初始接種密度，但一般以1-10、1-5、1-3、1-2倍擴增。因此，傳代通常要求培養(yǎng)的細胞大多數(shù)是能夠分裂的細胞。
細胞“群”是指通過特定的分離或培養(yǎng)步驟獲得的多個細胞。當本發(fā)明的選擇步驟產(chǎn)生具有相對均一特性的細胞群時，在檢測標記表達或其它表型時，細胞群可以是異質的。細胞群的特性通常用具有特定特性的單個細胞的百分率(如對特定標記染色陽性的細胞的百分率)或對整個細胞群進行檢測時的該特性的大多數(shù)平均值(如細胞群產(chǎn)生的細胞裂解產(chǎn)物中mRNA的量)來定義。
“90％ PDX-1陽性的”是指隨意挑選的細胞的統(tǒng)計學抽樣。采用標準免疫化學技術，在顯微鏡下對陽性染色細胞進行觀察計數(shù)。通過與合適的對照樣品進行比較來測定百分率，如制備同樣的細胞和使用相似種型但對PDX-1無特異性的抗體。
“血清”是指從血液中獲得的非血細胞材料。血清一般是通過凝結或通過離心和脫纖維蛋白來物理分離血細胞來獲得。如本文所述，可以用其生物學活性對血清進行功能限定當加入到培養(yǎng)液時，血清一般能支持培養(yǎng)液中哺乳動物細胞的生長。血清可以從不同種物種(如人、牛、綿羊、馬、豬、兔、雞等)或不同發(fā)展階段(胎兒、幼年或成年)中獲得。在某些實施方案中，“血清”也可從成分血清或其它來源獲得，如SelectSoytone(Becton Dickinson)或其它商業(yè)可獲得的產(chǎn)品中獲得的血清代用產(chǎn)品或替代產(chǎn)品。這些血清等同物應完全或部分地定義。
“包膜”是指包裹內(nèi)細胞群三維的細胞外殼。
詳細說明本發(fā)明涉及到發(fā)現(xiàn)存在的中間的、分化階段的胰腺干細胞，在包被時該胰腺干細胞能成熟形成產(chǎn)生胰島素的集落。這些胰腺干細胞能再現(xiàn)包被的直接從胰腺中分離的胰島細胞的結構和功能。該胰腺干細胞具有在培養(yǎng)液中擴增的優(yōu)點，同時包被步驟能控制集落的大小和細胞數(shù)量。
I、分離胰腺細胞的方法本發(fā)明提供了誘導中間階段胰腺干細胞群成熟形成胰島素分泌細胞集落的方法。一般地，起始步驟是從胰腺中分離出中間階段的胰腺干細胞，從胰腺中收集的細胞是可以產(chǎn)生具有外和內(nèi)分泌功能的分化細胞的不同細胞群。這些分化細胞表達胰腺內(nèi)分泌分子，如胰島素、生長激素抑制素、胰高血糖素和其它體內(nèi)分泌激素，及胰腺外分泌分子，如淀粉酶。另外，一部分培養(yǎng)細胞群能在培養(yǎng)液中復制和擴增。因此，在本發(fā)明中使用的這種中間階段的胰腺干細胞群能從供者的胰腺中分離出來，然后新分離的胰腺細胞在條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)以促進中間階段的胰腺干細胞生長。
A.供體的來源上述供體的來源可以是一個或多個供者的胰腺，可以來源于培養(yǎng)的胰腺細胞或能產(chǎn)生胰腺內(nèi)和外分泌激素的細胞的其它來源。在優(yōu)選實施方案中，用于后續(xù)培養(yǎng)的分離細胞是從一個或多個供者的胰腺中獲得。本發(fā)明所描述的方法不依賴于供者胰腺的年齡。因此，從胚胎到成年年齡范圍的供者中分離的胰腺材料都可以使用。
在另一實施方案中，胰腺細胞是從培養(yǎng)源中分離得到。例如，可以將用Soon-Shiong等題為“Microencapsulation of cells”的美國專利第5,762,959號中的微包被方法而制備的細胞收集作為供體細胞的來源。
B.胰腺細胞群的分離一旦從供者中收集到胰腺，一般就用不同的方法處理胰腺以產(chǎn)生單個細胞或小群的細胞用于培養(yǎng)。這種方法的一種是洗凈收集的胰腺組織并預備用酶消化。用酶處理以消化連接組織從而使收集組織的腺細胞組織裂解成更小的胰腺細胞材料單元。用一種或多種酶處理收集的胰腺組織以使胰腺細胞材料、亞結構和單個胰腺細胞與收集器官的整個結構分離。膠原酶、脫氧核糖核酸酶、釋放制劑(參見美國專利第5,830,741和5,753,485號)和其它的酶預期可用于本發(fā)明所揭露的方法。
可以進一步處理分離的原材料以富集一種或多種目的細胞群。然而，未做成分分離的胰腺組織一旦分離培養(yǎng)，其也可直接用本發(fā)明的培養(yǎng)方法培養(yǎng)而不需要進一步分離，并能產(chǎn)生中間細胞群。在一個實施方案中，該分離的胰腺細胞材料通過密度梯度(如Nycodenz，F(xiàn)icoll或Peroll)離心純化，例如，在美國專利第5,739,033號中描述的梯度方法可以用作富集胰島中處理后的胰腺材料的方法。從供者源中收集的混合細胞一般是異質的，因此含有α-細胞、β-細胞、δ-細胞、導管細胞、腺泡細胞、兼性祖細胞和其它的胰腺細胞型。
一般的純化方法會使分離的細胞材料分離成許多層或界面。一般地形成兩個界面。上層界面是胰島富集的，含有10-100％胰島細胞的懸液；第二層界面一般是混合細胞群，含有胰島細胞、腺泡細胞和導管細胞。底層是沉淀物，其在梯度的底部形成。這一層一般主要(＞80％)含有腺泡細胞、一些殘余胰島(entrapped islets)和一些導管細胞?？梢苑謩e收集導管樹組分(ductal tree component)以用于進一步的處理。
根據(jù)挑選的梯度部分和每個分離的最后結果，用于進一步處理的所挑選部分的候選細胞將會不同。當胰島細胞是目標細胞型時，分離部分中合適的富集胰島細胞群將含有10％-100％的胰島細胞。通過富集，也能收集到其它胰腺細胞型。例如，根據(jù)所用的純化梯度，本發(fā)明所描述的培養(yǎng)方法可以用來培養(yǎng)從第二界面、從沉淀物或從其它部分中分離出的細胞。
在一個實施方案中，從胰島富集(上層)部分中產(chǎn)生中間胰腺細胞培養(yǎng)物。另外，一般含有胰島細胞、腺泡細胞和導管細胞的混合細胞群的更異質的第二層界面或一般含有導管樹組分、腺泡細胞和一些殘余胰島的底層部分也能用于培養(yǎng)。因這兩層都含有本發(fā)明所描述的能產(chǎn)生中間階段的細胞群，所以每一層對于使用本發(fā)明所揭露的方法都可能具有特定的優(yōu)點。
II、中間階段胰腺干細胞群的產(chǎn)生和繁殖A.常規(guī)細胞培養(yǎng)步驟一旦獲得并分離出胰腺細胞，就將它們在選擇中間階段細胞群為目的繁殖條件下培養(yǎng)，或在其它實施方案中，在分化更成熟細胞型的條件下培養(yǎng)。常規(guī)的細胞培養(yǎng)方法在Freshney，Culture of Animal CellsAManual of Basic Technique 4th ed.，John Wiley & Sons(2000)中可以找到。一般地，胰腺細胞在適于其它哺乳動物細胞培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)，例如在37℃，含5％CO2空氣的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞可以在本領域已知的不同基質材料上培養(yǎng)，如硼硅酸鹽玻璃管、瓶、盤、帶有陰性表面電荷的克隆環(huán)、塑料的組織培養(yǎng)管、盤、瓶、多孔板、帶有增加生長表面積(GSA)或食管多普勒監(jiān)測器(EDM)的容器、帶有多個內(nèi)薄層以增加GSA的瓶、Fenwal包和其它的培養(yǎng)容器。
一旦收集并挑選了用于培養(yǎng)的胰腺細胞材料，或如果細胞群發(fā)生融合可將其轉移到新的基質材料，那么細胞群就被接種入合適的組織培養(yǎng)容器中來培養(yǎng)。接種密度對于用本發(fā)明所揭露的方法而培養(yǎng)的胰腺細胞的生存能力有影響，可以通過以不同范圍的密度接種細胞并監(jiān)測最終細胞存活和擴增的比率來試驗性地測定特定培養(yǎng)條件的最優(yōu)接種密度。經(jīng)證實，接種密度的范圍對于分泌激素的培養(yǎng)細胞是有影響的，一般地，細胞的濃度范圍為大約102-108個細胞/100mm培養(yǎng)皿，如102、103、104、105、106、107或108個細胞/100mm培養(yǎng)皿，雖然更低的細胞濃度也可以用于克隆步驟。其它培養(yǎng)容器的細胞濃度可以通過計算不同容器的相對的基質材料表面積和/或培養(yǎng)液氣體交換表面積來調(diào)整。例如，常規(guī)的100mm培養(yǎng)皿的基質材料表面積為55平方厘米(參見Freshney，見上文)，細胞濃度為10,000個細胞/皿，相應于每平方厘米約180個細胞，當細胞濃度為100,000個細胞/皿時，則相應于每平方厘米約1,800個細胞。通過在每培養(yǎng)表面積上使用合適體積的培養(yǎng)液(對于靜止培養(yǎng)液的常用范圍是0.2-0.5ml/cm2)，可以將根據(jù)培養(yǎng)容器表面積確定的細胞濃度與根據(jù)培養(yǎng)液體積確定的細胞濃度建立比例關系。為了測定是否發(fā)生10倍的擴增，通過酶消化除去細胞，在已知體積的液體中顯微鏡下計數(shù)。細胞還可以在預包被了確定的細胞外基質成分的培養(yǎng)表面生長以促進其生長和分化(如纖維連接蛋白、膠原I、Engelbreth-Holm-Swarm基質和優(yōu)選的膠原IV或層粘連蛋白)。
標準細胞培養(yǎng)繁殖技術適于實施本發(fā)明。當細胞附著在培養(yǎng)液表面生長時，單層生長一般達到80％-90％融合，這時采用蛋白水解消化使細胞從表面釋放，將其以1∶2或1∶3稀釋在新的容器中培養(yǎng)。對細胞進行更高稀釋也適用，一般的稀釋范圍為1∶4到1∶10，雖然更低的細胞濃度也適合于克隆步驟。當將細胞傳代到無血清培養(yǎng)液中時，通常降低蛋白水解酶和螯合劑的濃度(如0.025％胰島素和0.53mM EDTA)。一般每星期更換兩次培養(yǎng)液，或者當培養(yǎng)液的pH表明需要新鮮的培養(yǎng)液時更換培養(yǎng)液。
本發(fā)明的胰腺細胞可以在不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。如本發(fā)明所述，含有或缺乏特定成分的培養(yǎng)基，特別是血清在分離或繁殖方法的某些步驟中是優(yōu)選的。例如，從胰腺中新鮮分離的細胞可以維持在高血清培養(yǎng)液中以使細胞從分離步驟中恢復；相反地，中間階段細胞群的挑選和繁殖需要低濃度血清培養(yǎng)液。因此，許多種培養(yǎng)液配方都可用于實施本發(fā)明。本申請所揭露的培養(yǎng)液配方僅是舉例的目的，使用本申請描述的檢測方法，通過分析檢測變化對細胞群復制或分化的影響，該培養(yǎng)液的非關鍵成分可以省略、替換、改變。參見如Stephan等，Endocrinology 1405841-54(1999))。
培養(yǎng)液通常包括基本培養(yǎng)液，其含有無機鹽、緩沖液、氨基酸、維生素和能量源，在一些情況下，還含有其它的與蛋白質、核苷酸、碳水化合物或脂代謝有關的有機中間體和前體形式的附加營養(yǎng)物?；九囵B(yǎng)液包括F12、Eagle’s MEM、Dulbecco’s改性的MEM(DMEM)、RPMI 1640、F12和DMEM的1∶1混合物等。參見Freshney，見上文。為了支持細胞生長，基本培養(yǎng)液通常補充有生長因子、其它蛋白、激素和痕量元素，這些補充物促進了細胞的生長、維持和/或分化，抵消了培養(yǎng)液其它成分的雜質或毒性，并提供了基本培養(yǎng)液中缺乏的微量營養(yǎng)素。在許多培養(yǎng)液中，血清是這些補充物的來源，血清可以從不同哺乳動物源中得到，如人、牛、綿羊、馬等，可以從成年、幼年或胎兒中得到。參見Freshney，見上文。胎兒牛血清通常用作補充物，血清的濃度用血清的體積占整個培養(yǎng)液體積的百分比來表示，一般的范圍是0.1-25％，如0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25％。在一些應用中，基本培養(yǎng)液中補充入除血清以外的確定的或半確定的生長因子、激素和微量營養(yǎng)素的混合物。血清替代補充物的配方在此處有揭露。其它的配方是本領域已知或從商業(yè)源中能得到的(參見Freshney，見上文)。在一些實施方案中，降低了血清的濃度，但并不消除，并向基本培養(yǎng)液中加入確定或半確定的補充混合物。此處描述了含有高或低濃度血清的培養(yǎng)液的優(yōu)選應用。
B.分離的胰腺細胞在高血清中的維持和繁殖在供者死亡之后分離步驟開始之前，從供者的胰腺中收集到的細胞，通常要經(jīng)受一段時間的熱或冷缺血。此外，在分離過程中，胰腺細胞通常會遭受蛋白水解消化及機械和剪切應力作用。盡管不希望限制于特定的理論，但這些細胞所經(jīng)受的各種損傷可能會正向調(diào)節(jié)各種細胞過程而使胰腺干細胞群如兼性祖細胞群擴增。分離或純化后，將細胞直接置于低血清培養(yǎng)液中可以非常有效地產(chǎn)生中間細胞群。但是，由于細胞在分離步驟中所經(jīng)受的損傷可能對細胞的生存和對培養(yǎng)液的適應性會有副作用，所以有時需要將新分離的細胞維持在含有高濃度血清(如大于4％)的穩(wěn)定培養(yǎng)液中以提高培養(yǎng)效率。該維持的期間可以是短暫的(如過夜)?？蛇x擇地，細胞在擴增繁殖期間都維持在高血清培養(yǎng)液中。
起穩(wěn)定作用的高血清培養(yǎng)液一般地含有至少4％的血清，在一些實施方案中含有更高濃度的血清，如10％或20％。用于穩(wěn)定或繁殖作用的培養(yǎng)液可以源于基本培養(yǎng)液，如RPMI 1640，其可從多種商業(yè)途徑得到，并被Moore等在J Am Med Assoc 199519-524(1967)中所公開。用于維持和繁殖的高血清培養(yǎng)液的例子有培養(yǎng)液3(RPMI 1640+10mM HEPES、2mM谷氨酸鹽、5μM ZnSO4和10％的胎牛血清(FBS))和培養(yǎng)液7(RPMI1640+10mM HEPES、2mM谷氨酸鹽、5μM ZnSO4和20％FBS)。還可以通過將一定體積的高血清培養(yǎng)液，如培養(yǎng)液3或培養(yǎng)液7與一定體積的無血清培養(yǎng)液，如SM95、SM96或SM98(如本文所述)混合以達到所需要的血清濃度(如4％-9％)而得到高血清培養(yǎng)液。
收集后為了達到穩(wěn)定，通常將細胞以高密度培養(yǎng)在含有高血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中(如在70ml培養(yǎng)液7(20％FBS)中培養(yǎng)109個細胞)。但是，也可以使用低細胞密度和低血清濃度。一般在最初的容器中維持細胞相對短的時間(如過夜)以使其從收集步驟中恢復。
在維持期間之后，可以將細胞轉移到低血清培養(yǎng)液中用來挑選和繁殖如本文所述的中間細胞群?？蛇x擇地，可將細胞培養(yǎng)在高血清培養(yǎng)液中以使混合細胞群擴增。在典型實施方案中，將從維持培養(yǎng)液中獲得的細胞重新接種到含有培養(yǎng)液3(10％FBS)、培養(yǎng)液7(20％FBS)或培養(yǎng)液3和培養(yǎng)液7的混合物的新培養(yǎng)容器中，細胞在這種培養(yǎng)液中一般培養(yǎng)7-10天，此期間它們可生長成融合狀態(tài)。一旦細胞達到融合狀態(tài)時，可以將它們傳代到低血清培養(yǎng)液中來選擇性地擴增本文所述的中間細胞群。
C.低血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)的中間階段胰腺干細胞群的擴增與繁殖一旦分離出胰腺干細胞，就將該細胞轉移到選擇性培養(yǎng)液中以促使產(chǎn)生繁殖的中間階段群，該選擇性培養(yǎng)液有利于細胞的繁殖，其中這些細胞保留有分泌胰腺內(nèi)分泌激素的能力或保留有進一步分化成熟為高水平分泌胰腺內(nèi)分泌激素的增生細胞的潛力。雖然本發(fā)明方法中沒有要求純化的上皮培養(yǎng)物來更好的發(fā)揮胰腺細胞的有利作用，但一般來說選擇性培養(yǎng)液有利于上皮或類上皮細胞的繁殖，同時抑制纖維原細胞和間質細胞。一般地，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，如根據(jù)每次傳代擴增的細胞數(shù)量進行的2、3、4或5次傳代后，上皮選擇性培養(yǎng)液會產(chǎn)生出接近純化的細胞群(如纖維原細胞或間質細胞小于10％)。
所使用的一種選擇性培養(yǎng)液是無血清培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液有利于來自胚胎組織的上皮細胞的生長(參見如Stephan等，見上文；Peehl和Ham，InVitro 16526-40(1980))。上皮特異性培養(yǎng)液、更優(yōu)選地含有生長激素源的低血清培養(yǎng)液可以用來選擇性繁殖特定的胰腺細胞群，其中這些胰腺細胞來自成年哺乳動物，保留有胰腺細胞發(fā)育標記(如PDX-1)，但在合適條件下能進一步分化而高水平表達胰腺內(nèi)分泌激素。本申請公開了適于培養(yǎng)胰腺細胞的具體的上皮選擇性培養(yǎng)液，但是有利于上皮或類上皮細胞優(yōu)先擴增的本領域已知的其它培養(yǎng)液配方也可以使用。
可以在高血清培養(yǎng)液中維持一段時間后再轉移到上皮選擇性低血清培養(yǎng)液中(“禁食(weaning)”)，或者在分離和分開步驟后直接將細胞轉移到低血清培養(yǎng)液中(“休克(shock)”)，這兩種方法都適于產(chǎn)生目標中間細胞群。
1.選擇性低血清培養(yǎng)液的制備本文所使用的“低血清培養(yǎng)液”是指含有血清少于約1％的培養(yǎng)液，因此，無血清培養(yǎng)液是一類低血清培養(yǎng)液。血清濃度在0％-1％之間，如約0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％的培養(yǎng)液可以通過將合適濃度的血清加入到無血清培養(yǎng)液中或通過將無血清培養(yǎng)液與含血清的培養(yǎng)液混合使其達到合適的血清濃度來制備。
向基本培養(yǎng)液(如SM96或1∶1的F12/DMEM)中補加入取代血清生物學功能的生長因子、其它蛋白、激素和微量營養(yǎng)素的混合物來制備完全無血清的培養(yǎng)液。無血清培養(yǎng)液的優(yōu)點在于能容易地操縱補加的混合物組分從而促進目標細胞群(如中間細胞群)的增生并抑制非目標細胞(如腺泡細胞或結締組織細胞，如纖維原細胞)的生長。還可以操縱該補加的混合物以促使干細胞群分化成更成熟細胞，或防止干細胞群的分化以維持高增殖率。
a)生長激素使用含有生長激素(GH)的上皮選擇性培養(yǎng)液來促使產(chǎn)生可利用的中間分化的胰腺細胞群。盡管不希望限制于特定的理論，只是猜測GH能代替通常在血清中發(fā)現(xiàn)的可支持細胞生長的有絲分裂物質，但是血清中含有能促使非必需細胞群(如成纖維細胞和間質細胞)過度生長的其它有絲分裂因子。因此，用含有GH的補加混合物替代血清對分化的中間階段的細胞群的繁殖產(chǎn)生選擇性。而在本發(fā)明可選擇的具體實施方案中，無血清培養(yǎng)液中的GH的功能可以用其它的補加成分來代替，在天然提取物中的或作為重組蛋白的GH的應用使含有GH的培養(yǎng)液適于本申請所公開方法的上皮選擇性培養(yǎng)液。
生長激素(growth hormone，也被稱為somatotropin)是在垂體前葉合成的多肽激素，其能促進正常個體的生長和哺乳并影響細胞代謝的各個方面。GH能直接作用細胞，也能通過IGF-I和相似分子介導間接作用細胞。在完整胰腺中，胰島細胞的生長與GH、同源激素催乳素和催乳激素的表達有關(參見如Nielsen等，J Mol Med 77(1)62-6(1999))。在人體中，成熟的GH含有191個氨基酸殘基，分子量為22kDa。然而，除了常見的二硫二聚體外，在血清中已經(jīng)檢測到部分人GH由兩個肽組成(殘基1-43和44-191)，其對成人的胰島組織具有不同的作用(參見Lewis等，Endocr J 47SupplS1-8(2000))。人GH的各種天然存在的衍生物、變體、代謝產(chǎn)物和構建的衍生物是已知的，包括糖基化GH、甲硫氨酸GH、20kDa GH、乙酰化的GH、蛋白水解GH、酰胺GH、亞砜GH和截短形式的GH。
GH是激素保守家族的一員，包括人中的GH-V1和GH-V2，來自于其它脊椎動物的絨毛膜催乳素、催乳素和蛋白，如嚙齒動物胎盤催乳激素I和II和其它的牛和羊催乳激素，鼠增殖素I、II和III和增殖素相關蛋白I、II和III，鼠類催乳素蛋白A和B，和來自各種魚的生長催乳激素(somatolactin)。這個家族的成員的特征是具有相同序列C-x-[ST]-x(2)-[LIVMFY]-x-[LIVMSTA]-P-x(5)-[TALIV]-x(7)-[LIVMFY]-x(6)-[LIVMFY]-x(2)-[STA]-W或C-[LIVMFY]-x(2)-D-[LIVMFYSTA]-x(5)-[LIVMFY]-x(2)-[LIVMFYT]-x(2)-C。
適于實施本發(fā)明的生長激素可以從各種天然或人工的來源獲得。與常需要同一物種來源的治療用GH相比，在培養(yǎng)胰腺細胞的低血清培養(yǎng)液的配方中，可以使用來源于靈長類動物、哺乳動物或脊椎動物種的GH。生長激素的常規(guī)來源是牛垂體提取物(BPE)，其富含天然GH。培養(yǎng)液中可以含有BPE(75μg/ml蛋白)，濃度為大約0.1-100μl/ml，優(yōu)選為0.5-50μl/ml，更優(yōu)選為5μl/ml或37.5mg/l。來源于其它物種(如豬、羊等)的垂體提取物也可以以相似濃度使用。垂體提取物中存在的其它因子可以增強其效果，但使用純的GH和使用重組GH也能達到令人滿意的效果。重組的牛和人GH可以廣泛使用，并是GH活性的合適來源?？梢詫⒅亟MGH加到培養(yǎng)液中，其濃度為0.01-100mg/l，優(yōu)選為0.1-10mg/l，更優(yōu)選為約0.2、0.5、0.75、1、1.25、2或5mg/l，更優(yōu)選為約1.25mg/l，其中1mg重組蛋白約相當于3IU的GH。
b)其它的補加物為制備完全無血清培養(yǎng)液而加入基本培養(yǎng)液中的成分一般包括重組人胰島素(0.1-100μg/ml)、轉鐵蛋白(0.1-100μg/ml)、表皮生長因子(0.1-100ng/ml)、乙醇胺(0.1-100μg/ml)、抑肽酶(0.1-100μg/ml)、葡萄糖(0.1-100mg/ml)、磷酸乙醇胺(0.1-100μM)、三碘甲狀腺氨酸(0.1-100pM)、硒(0.1-100nM)、氫化可的松(0.01-100μM)、黃體酮(0.1-10nM)、佛司可林(forskolin)(0.1-100μM)、B細胞生長因子(heregulin)(0.1-100nM)和牛垂體提取物(0.1-500μg/ml)。并不需要所有的補加組分都支持細胞生長，對于具體補加物，其最佳濃度或必要性可以通過去除或減少單一組分的濃度并觀察對細胞增殖的效果試驗來確定(參見Stephan等，見上文)。
一般而言，可以用天然或合成的具有同樣生物學屬性的產(chǎn)品來替代補加的成分。例如，三碘甲狀腺氨酸、氫化可的松和黃體酮都可以用天然或合成的激活同一細胞內(nèi)受體(甲狀腺受體、糖皮質激素受體和黃體酮受體)的已知激素代替。胰島素是用重組DNA技術生產(chǎn)的典型人蛋白，但是可以用從天然來源中純化或來源于其它物種的多肽或其它的胰島素和EGF受體的激動劑來代替。在某些情況下，可以用其它的GH受體拮抗劑來代替GH。同樣，ErbB3受體的配體B細胞生長因子可以用B細胞生長因子異構體和其它ErbB3激動劑，如Ebp-1、B細胞生長因子α、B細胞生長因子β、B細胞生長因子γ、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-1α、NRG-1β、NRG-2α和NRG-2β)來代替。
無血清培養(yǎng)液的例子包括基本培養(yǎng)液SM96和完全培養(yǎng)液SM95，SM95由SM96補加下表中的物質組成。SM98由1∶1的F12/DMEM補加改性的培養(yǎng)液補加物14F(由Stephan等描述，見上文)組成。SM98含有的B細胞生長因子比14F少(1ng/ml v.8ng/ml)。因此，SM98由1∶1的F12/DMEM組成，其補加有10μg/ml的重組人胰島素、10μg/ml的轉鐵蛋白、10ng/ml的表皮生長因子、61ng/ml的乙醇胺、3.365pg/ml的三碘甲狀腺氨酸、4.325ng/ml的硒、181ng/ml的氫化可的松、3.15ng/ml的黃體酮、410ng/ml的佛司可林、1ng/ml的B細胞生長因子和75μg/ml的牛垂體提取物。SM95和SM98中的EGH來源的例子有重組人EGF(SigmaE9644)和人B細胞生長因子-β1的EGF區(qū)域(氨基酸176-246)(R&D系統(tǒng)369-HB/CF)。
RPMI 1640培養(yǎng)液(Moore等，A.M.A.，199519(1967))無機鹽Mg/L氨基酸 Mg/LCa(NO3)2-4H2O 100L-賴氨酸·HCl 40.00KCl 400.00 L-甲硫氨酸 15.00MgSO4(無水) 48.84 L-苯丙氨酸 15.00NaCl 5850.00L-脯氨酸 20.00Na2HPO4(無水) 800.00 L-絲氨酸 30.00L-蘇氨酸 20.00L-色氨酸 5.00其它組分 Mg/LL-酪氨酸·2Na2H2O 29.00D-葡萄糖 2000.00L-纈氨酸 20.00谷胱甘肽(減少的) 1.0HEPES 5958.00維生素 Mg/L酚紅 5.00 生物素 0.20D-泛酸鈣0.25氯化膽堿3.00氨基酸Mg/L葉酸1.00L-精氨酸 200.00 i-肌醇 35.00L-天冬酰胺(自由基)50.00 煙酰胺 1.00L-天冬氨酸20.00 維生素B6·HCl 1.00L-胱氨酸·2HCl65.00 核黃素 0.20L-谷氨酸 20.00 硫胺·HCl 1.00L-谷氨酸鹽300.00 胸苷0.005甘氨酸10.00 維生素B121.04L-組氨酸(自由基) 15.00L-異亮氨酸50.00L-亮氨酸 50.00
SM95無機鹽 Mg/L其它組分 Mg/LCaCl278.3 D-葡萄糖 3000CuSO4·5H2O 0.00165 HEPES 1787.25Fe(NO3)3·9H2O 0.025 鈉次黃嘌呤 3.2FeSO4·7H2O 0.61亞油酸 0.066KCl 271 硫辛酸 0.1525MgCl228.36酚紅 4.675MgSO439.06腐胺鈉·2HCl 0.191KH2PO434 丙酮酸鈉 137.5NaCl7262.75NaHCO31600Na2HPO4101.5NaH2PO4·H2O31.25ZnSO4·7H2O 0.416維生素 Mg/L生物素 0.037抗壞血酸維生素C22.5氨基酸 Mg/LD-泛酸鈣 1.37L-丙氨酸 11.225 氯化膽堿 11.49L-精氨酸·HCl 283.75 葉酸 1.826L-天冬酰胺·H2O 18.75L-肌醇 24.3L-天冬氨酸 16.325 煙酰氨 1.03L-半胱氨酸·H2O(非動物) 43.78維生素B6·HCl 1.046L-胱氨酸·2HCl 15.65核黃素 0.13L-谷氨酸 18.675 硫胺·HCl 1.23L-Glutamax I 328.5胸苷 0.5325甘氨酸 89.375 維生素B121.04甘氨酸-組氨酸-賴氨酸 0.000005L-組氨酸HCl·H2O 38.69L-異亮氨酸 31.24補充物 Mg/LL-亮氨酸 42.5 Selenous酸鈉 0.0034L-賴氨酸·HCl 82.125 上皮生長因子 0.005L-甲硫氨酸 13.12乙醇胺 0.03L-苯丙氨酸 22.74磷酸乙醇胺 0.07L-脯氨酸 43.625 抑肽酶 12.5L-絲氨酸 23.625 黃體酮 0.0016L-蘇氨酸 38.726 佛司可林 0.205L-色氨酸 6.51 B細胞生長因子 0.004L-酪氨酸·2Na2H2O(非動物) 35.9 牛垂體提取物 37.5L-纈氨酸 38.125 氫化可的松 0.0923r.h.胰島素 5.05T3 0.0000015L-T4甲狀腺素鈉 0.00002牛轉鐵蛋白APG 7.5
SM96無機鹽 Mg/L其它組分 Mg/LCaCl278.3 D-葡萄糖 3000CuSO4·5H2O 0.00165HEPES 1787.25Fe(NO3)3·9H2O 0.025 鈉次黃嘌呤 3.2FeSO4·7H2O 0.61 亞油酸 0.066KCl271 硫辛酸 0.1525MgCl228.36 酚紅 4.675MgSO439.06 腐胺鈉·2HCl 0.191KH2PO434 丙酮酸鈉 137.5NaCl 7262.75NaHCO31600Na2HPO4101.5NaH2PO4·H2O 31.25維生素Mg/LZnSO4·7H2O 0.416 生物素0.037抗壞血酸維生素C 22.5D-泛酸鈣 1.37氨基酸 Mg/L氯化膽堿 11.49L-丙氨酸 11.225 葉酸 1.826L-精氨酸·HCl 283.75 L-肌醇24.3L-天冬酰氨·H2O 18.75 煙酰氨1.03L-天冬氨酸 16.325 維生素B6·HCl 1.046L-半胱氨酸·H2O(非動物) 43.78 核黃素0.13L-半胱氨酸·2HCl 15.65 硫胺·HCl 1.23L-谷氨酸 18.675 胸苷 0.6325L-Glutamax I 328.5 維生素B121.04甘氨酸 89.375甘氨酸-組氨酸-賴氨酸 0.000005L-組氨酸HCI·H2O 38.69L-異亮氨酸 31.24L-亮氨酸 42.5L-賴氨酸·HCl 82.125L-甲硫氨酸 13.12L-苯丙氨酸 22.74L-脯氨酸 43.625L-絲氨酸 23.625L-蘇氨酸 38.726L-色氨酸 6.51L-酪氨酸·2Na2H2O(非動物) 35.9L-纈氨酸 38.1261
2.細胞向低血清培養(yǎng)液中的轉移將胰腺細胞的培養(yǎng)物轉移到低血清培養(yǎng)液中可促進明確分化為中間階段細胞群的挑選。如果傳代培養(yǎng)，這些細胞將會繼續(xù)擴增，且保持高水平表達胰腺標記，如PDX-1。如果不經(jīng)刺激，這些群就分泌相對低水平的胰腺內(nèi)分泌激素，如胰島素，但根據(jù)本發(fā)明的方法能使其成熟產(chǎn)生高分泌細胞。為了將胰腺細胞的培養(yǎng)物轉移到低血清培養(yǎng)液中，可以將細胞在由高血清轉移到低血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，也可以在分離后直接將細胞置于低血清培養(yǎng)液中。諸如SM95和SM98等培養(yǎng)液是合適的培養(yǎng)液，雖然SM95對于成熟的胰腺細胞有輕微促胰島素分泌作用。
中間細胞群一般保留有增生的能力和進一步分化為高分泌內(nèi)分泌細胞的能力。增生的能力可以用由一個密度接種培養(yǎng)擴增到另一個密度的能力來衡量，如在一次傳代中180個細胞/平方厘米的細胞可以擴增到1,800個細胞/毫升。通過繁殖和傳代的重復循環(huán)，分離的胰腺細胞的起始群可以擴增約10,000倍或更多(如約100倍、500倍、1000倍、5000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍、500,000倍或1,000,000倍)且保留有內(nèi)分泌標記，如表達PDX-1和胰島素mRNA，和保留有分化為成熟的高分泌的內(nèi)分泌細胞的能力。
III、適應性細胞培養(yǎng)作為成熟方法的預備步驟，中間階段的胰腺干細胞在適應性培養(yǎng)條件下生長。簡單地，該中間階段的胰腺干細胞在條件性培養(yǎng)皿或新的培養(yǎng)皿中生長，仔細看護使細胞不達到融合狀態(tài)。混合上述兩種類型培養(yǎng)皿中的細胞，或者如下文所描述的那樣進行包被，或再接種到培養(yǎng)皿上。
A.條件性培養(yǎng)皿條件性培養(yǎng)皿是事先已用來生長中間階段胰腺干細胞的培養(yǎng)皿。一旦該細胞形成了單層(一般約5天，根據(jù)最初的傳代接種密度)，通過胰蛋白酶化作用將其移出。制備條件性培養(yǎng)皿并不需要100％的融合細胞培養(yǎng)物，優(yōu)選使用更低濃度的胰島素(一般為標準細胞培養(yǎng)方法中使用濃度的1/2或1/4)來防止基質發(fā)生大范圍的降解?？蛇x擇地，上述細胞單層可以通過用去污劑分離底物來移出，其中的去污劑會移出細胞而留下分泌基質(參見Gospodarowicz等，Proc Natl Acad Sci USA 774094-8(1980))。
方便地，可以將以前生長在底物或培養(yǎng)皿上的上述移出細胞分成幾份，并再接種在同樣的、條件性培養(yǎng)皿中。但是，對底物有條件要求的培養(yǎng)及接種在底物上的培養(yǎng)并不要求是一樣的培養(yǎng)。因此，一種細胞培養(yǎng)可以是生長在底物上，而使底物、移出細胞及接種在條件性底物中的另一培養(yǎng)細胞條件化。作為后續(xù)的培養(yǎng)細胞，該條件細胞可以來源于同一或不同的供者或物種。
B.使用適應性培養(yǎng)液的細胞的生長將中間階段的胰腺干細胞分開到條件性的和新的培養(yǎng)皿中，只要該細胞仍然能夠增殖，培養(yǎng)的時間長度并不重要。在優(yōu)選實施方案中，使用從胰腺中最近分離的細胞(如僅傳代過1或2次)。如前所述，為了促進中間階段胰腺干細胞群的生長，將細胞置于低血清培養(yǎng)液中生長。細胞以其互不接觸的密度接種，優(yōu)選在達到融合狀態(tài)之前收集。本領域所屬技術人員能夠理解接種的細胞的數(shù)量會影響培養(yǎng)到融合狀態(tài)的時間。
從條件性和新的培養(yǎng)皿中收集細胞后，將其合并。只要有一些細胞在條件性培養(yǎng)皿中生長，生長在新培養(yǎng)皿中的細胞與生長在條件性培養(yǎng)皿中的細胞的比例對于本發(fā)明就不重要。
然后將收集的細胞如下文所述進行包被，或者接種到新的組織培養(yǎng)板上。經(jīng)過適應性培養(yǎng)，然后在培養(yǎng)液中生長過的細胞能增殖并以葡萄糖調(diào)節(jié)的方式分泌高水平胰島素。胰島素與肌動蛋白的比率與適應性培養(yǎng)之前的比率相似。
IV、中間增殖的胰腺細胞的包被適應性培養(yǎng)后，對中間的增生干細胞進行包被從而在膠囊內(nèi)形成細胞集落，該集落具有與從胰腺中新分離的包被胰島集落相似的細胞結構和蛋白表達表型。
包被使胰腺細胞能移植到糖尿病宿主中，而產(chǎn)生最小的宿主動物免疫反應。挑選的包被膜的多孔性能允許生物物質，如胰島素從膠囊中分泌，同時限制針對外源細胞的宿主免疫系統(tǒng)的介入。
包被方法是本領域已知的，在下列參考文獻中有披露vanSchelfgaarde & de Vos，J.Mol.Med.77199-205(1999)，U1udag等，Adv.Drug Del Rev.4229-64(2000)和美國專利第5,762,959、5,550,178和5,578,314號。下面是對中間階段胰腺干細胞包被的一般性描述，在本發(fā)明的實施例部分有具體例子。
A.包被材料用水凝膠包裹包被的細胞。水凝膠可由各種材料制成如藻酸鹽、瓊脂糖、聚乙二醇(PEG)。這些材料在水中離子或共價地交聯(lián)而形成水凝膠。
用于包被胰腺細胞的優(yōu)選材料是藻酸鹽(一種由甘露糖醛(M)酸和葛羅(G)酸組成的多聚糖)。藻酸鹽與二價陽離子如鈣或鋇交聯(lián)從而形成水凝膠。
B.膠囊的形成作為細胞包被的實例，描述了含有多聚賴氨酸膜的藻酸鹽膠囊的形成，本領域所屬技術人員能夠理解還可以利用藻酸鹽和多聚賴氨酸的變體或其它材料來制備膠囊，對制備方法可以進行不影響該包被細胞的功能的相似性改進。在本申請中關于包被細胞植入的IV部分和關于表型檢測的VI部分中公開了細胞功能的測試方法。
在微滴形成裝置如氣體驅動微滴生成器或高壓靜電脈沖系統(tǒng)中制備含有細胞和藻酸鹽的微滴，利用重力也可以形成微滴。通過將微滴溶液在含有離子交聯(lián)劑如鈣的溶液中孵育可使藻酸鹽溶液形成凝膠。
為了形成膜，將上述微滴懸浮在含有多聚賴氨酸的溶液中，從而使多陰離子藻酸鹽被多陽離子多聚賴氨酸包被。本領域所屬技術人員能夠理解，改變多聚賴氨酸的分子量和濃度以及孵育時間會影響膜的多孔性。
一旦在水凝膠周圍形成膜，使用者可以通過去掉鈣離子，通常是在檸檬酸鈉溶液中浸泡膠囊來使凝膠液化。本領域所屬技術人員能夠理解液化的合適條件。為促進生物適應性的最后步驟是將膠囊懸浮在與帶正電的多聚賴氨酸結合的藻酸鹽或其它的帶電分子中。
C.將微膠囊合并成大膠囊本領域所屬技術人員能夠理解，在一些情況下可以采用附加步驟來降低宿主對植入的包被的胰腺細胞所產(chǎn)生的反應。優(yōu)選的方法是將微膠囊整合成大膠囊，該技術在美國專利第5,545,423號中有描述，在此將該專利引為參考。
簡言之，微膠囊基本按照上述部分的描述制備，雖然可以使用液化內(nèi)核的微膠囊，但是使用膠體內(nèi)核的膠囊是優(yōu)選的。然后用厚層的凝膠材料覆蓋多個微膠囊，因而微膠囊的多陽離子層是更有效的免疫系統(tǒng)保護罩。
覆蓋微膠囊的大膠囊層可以是任何厚度，但至少是約1微米厚，優(yōu)選為至少約50微米厚。該大膠囊可以由適于形成上文所述的用于微膠囊的水凝膠的任何聚合物組成，并可以用離子或共價方法使其交聯(lián)。大膠囊可制作成不同的形狀，包括但不限于圓柱形、球形或圓盤形。本領域所屬技術人員能夠理解大膠囊的具體組分并不影響包被細胞的功能，而且根據(jù)本申請的教導能夠檢測包被細胞的功能。
D.包被細胞的聚集和培養(yǎng)維持包被后，中間增殖的干細胞形成集落?？梢愿鶕?jù)本申請VI部分所述的免疫染色方法來分析該集落的細胞結構和蛋白表達方式。細胞集落一般具有如下表型單層細胞環(huán)繞在集落的周圍且表達CK-19，而集落內(nèi)部的細胞表達胰島素、生長激素抑制素和胰高血糖素。該CK-19表達細胞可能是未分化細胞，位于中心的激素表達細胞可能是成熟細胞。
包被的細胞可以與包被胰島一樣在培養(yǎng)液中生長，因此，包被的中間增殖干細胞能以與包被胰島相似的方式在培養(yǎng)液中維持，可以將二價陽離子加到培養(yǎng)液中以維持其液體狀態(tài)。例如，當水凝膠是鈣交聯(lián)的藻酸鹽時，可以向培養(yǎng)液中加入0.03mM CaCl2·2H2O。
V、包被胰腺細胞的植入按照胰島移植所使用的一般方法，進行向哺乳動物的植入或移植以及后續(xù)的內(nèi)分泌功能監(jiān)測，參見如Ryan等，Diabetes 50710-19(2001)；Peck等，Ann Med 33186-92(2001)；Shapiro等，N Engl J Med 343(4)230-8(2000)；Carlsson等，Ups J Med Sci 105(2)107-23(2000)和Kuhtreiber，WM，Cell Encapsulation Technology and Therapeutics，Birkhauser，Boston，1999。優(yōu)選的植入位點包括腹膜腔、肝和腎被膜。
A.微膠囊的劑量本領域所屬技術人員能夠測定目的受者的合適的微膠囊劑量，該劑量依賴于受體的胰島素需求，可以通過免疫學或生物活性量來測定微膠囊分泌的胰島素水平。當測量該劑量時還應考慮受者的體重。如果需要，在監(jiān)測受者對包被細胞的反應時可以進行多個植入。因此，對植入的反應可以作為確定包被細胞劑量的指導。(Ryan等，Diabetes 50710-19(2001))。
B.監(jiān)測包被細胞在動物中的功能包被細胞在受體中的功能可以通過監(jiān)測受體對葡萄糖的反應來檢測，植入包被細胞可以產(chǎn)生控制血糖水平的效果。另外，胰腺內(nèi)分泌激素、胰島素、胰高血糖素和生長激素抑制素的水平增加也能證實移植的包被細胞的功能。
本領域所屬技術人員能夠理解可以用不同的方法來監(jiān)測血糖調(diào)控。例如，就象檢測體重和胰島素需求一樣可以直接檢測血糖，也可以使用口服葡萄糖耐量試驗。腎功能也可以象檢測代謝參數(shù)那樣來檢測。(Soon-Shiong，P等，PNAS USA 905843-5847(1993)；Soon-Shiong，P等，Lancet 343950-951(1994))。
VI、表型檢測為了弄清楚什么時候出現(xiàn)成熟的胰腺細胞，檢測培養(yǎng)的特定階段和包被后胰腺細胞的表型是有用的，而不論是在體內(nèi)還是在體外生長。因為特定蛋白的表達與細胞特征或分化階段有關，因此可以分析細胞標記基因或蛋白的表達來測定其特征或分化階段。例如，在新分離的胰腺組織中，淀粉酶表達就能確定該細胞為外分泌胰腺細胞，胰島素表達就能確定該細胞為內(nèi)分泌胰島細胞。同樣，在分化的早期階段胰島細胞通常是細胞角蛋白CK-19陽性，而成熟胰島細胞表達很少的CK-19。
可以基于逐一細胞(cell-by-cell)或作為一群細胞的平均數(shù)來分析表型特征，檢測方式將依賴于檢測技術的特定需要和方法。因此，可用免疫組織化學分析固定細胞，用FACS分析懸浮細胞的標記表達，檢測單個細胞表達給定標記的頻率和強度。另一方面，可以檢測整個細胞群的特性，如胰島素與肌動蛋白mRNA的平均表達比率。在這種情況下，一般是通過收集細胞群中的mRNA并測量胰島素和肌動蛋白轉錄本的總豐度來進行測試。許多表型屬性既可以在細胞，也可在群的基礎上測定。例如，胰島素的表達可以通過單個細胞染色來測定是否產(chǎn)生胰島素分泌顆粒，或通過裂解細胞群并測量總胰島蛋白來測定。相似地，mRNA豐度可以通過裂解細胞并收集mRNA來針對細胞群進行測量或通過原位雜交在單個細胞的基礎上進行測量。
A.細胞分化標記有許多細胞標記可以用來鑒定胰腺細胞群。分離和培養(yǎng)的供體細胞開始就表現(xiàn)出分化胰腺細胞的不同表型和基因型標記，可以認為，無論是最初增生階段之后或分離和就在分離和純化后，這些標記的改變與胰腺細胞轉移到無血清環(huán)境下有關。表型或基因型標記的例子包括在經(jīng)調(diào)節(jié)(如上調(diào)或下調(diào))的兼性祖細胞群中存在的各種分子標記，這些分子標記包括CK-19，其可能是胰腺兼性干細胞的標記。
一般地，當哺乳動物干細胞成熟到它們的最終發(fā)育終點時，它們要經(jīng)過許多發(fā)育階段，通?？梢酝ㄟ^鑒定發(fā)育細胞中存在或缺乏的標記來鑒定發(fā)育階段。由于人內(nèi)分泌細胞以相似的方式發(fā)育，因此它們從干細胞樣表型轉變?yōu)榧僖葝u表型時可以使用各種標記來鑒定細胞。
本發(fā)明方法中細胞誘導增生和分化的標記表達與正常人胰腺發(fā)育中的標記表達序列具有一些相似之處。在發(fā)育的早期，原始上皮細胞表達PDX-1，是同源區(qū)核因子(homeodomain nuclear factor)的早期細胞標記。當細胞發(fā)育時，它們開始出芽并形成導管，這些細胞表達上皮導管細胞的標記細胞角蛋白19，短暫表達的PDX-1引導其發(fā)育為內(nèi)分泌細胞。當細胞繼續(xù)發(fā)育時，它們獲得表達胰島素、生長激素抑制素或胰高血糖素的能力。最終的分化細胞僅能表達其中一種并成為α細胞(胰高血糖素)、β細胞(胰島素)和δ細胞(生長激素抑制素)。此處所用的中間細胞群被認為低于完全分化發(fā)育階段，保留有增生的能力和分化成成熟內(nèi)分泌細胞的潛能。如果該細胞確實是發(fā)育途徑或體外簡單操作所獲得的前體，那么該中間階段的細胞就能增生并表達內(nèi)分泌激素，因此具有用來改正任何類型的胰島細胞的缺陷的潛能。
理想的標記是在胰腺中時間性-和組織-特異性表達的分子(參見Hollingsworth，Ann N Y Acad Sci 88038-49(1999))，這些分子標記分成三大類轉錄因子、notch信號路徑標記和中間纖維標記。轉錄因子標記的例子包括PDX-1、NeuroD、Nkx-6.1、Isl-1、Pax-6、Pax-4、Ngn-3和HES-1，notch信號路經(jīng)標記的例子包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1、Jagged2、D111和RBPjk，中間纖維標記的例子包括ck19和Nestin。
檢測培養(yǎng)液或分離細胞中的蛋白質和核酸表達的方法是本領域的標準方法，包括定量逆轉錄酶多聚酶鏈反應(RT-PCR)、Northern印跡和原位雜交(參見如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，eds.2001supplement))和免疫檢測，如切片材料的免疫組織化學分析、Western印跡、全細胞標記的流式細胞計分析(FACS)(參見如Harlow和Lane，UsingAntibodiesA Laboratory Manual，New YorkCold Spring HarborLaboratory Press(1998))?？梢允褂贸Ｒ?guī)的內(nèi)分泌細胞分化的組織化學標記，用免疫組織化學檢測的細胞可以培養(yǎng)在小室中的玻片上以進行顯微鏡觀察?？蛇x擇地，在常規(guī)組織培養(yǎng)的細胞可以通過手工從培養(yǎng)物中移出，包埋在石蠟中用于切片。按照Leonard J等，Mol.Endocrinol，1993，Oct7，(10)1275-83的教導可以制備PDX-1抗體。
細胞分化標記是不同的，可以用常規(guī)的免疫組織化學方法檢測，一般的可用方案如下。
移出小室中玻片時開始染色處理，在緩沖液中非常輕柔地漂洗細胞，在多聚甲醛溶液中固定。然后室溫下在含有正常血清的封閉溶液中孵育細胞，用含非離子去污劑的封閉溶液增加細胞通透性，一抗如下表所示，在封閉溶液中進行適當稀釋制備這些抗體，將其加到細胞中孵育。在用一抗孵育后，用緩沖液漂洗細胞，再用封閉溶液封閉。
將用封閉溶液適當稀釋而制備的二抗加到細胞中，黑暗條件下孵育，孵育后，漂洗細胞并用Hoechst染料重染色核，除去過量液體，用蓋玻片蓋住玻片。干燥玻片并將其保藏在黑暗中。
可選擇地，可以使用ABC免疫組織化學方法制備細胞。簡言之，將細胞包埋在石蠟中，37℃過夜染色含有石蠟切片的玻片。將細胞去石蠟化，浸泡在過氧化氫甲醇溶液中以抑制內(nèi)源過氧化酶活性。將玻片在0.01的檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中煮沸30分鐘以修復特定抗原決定基。用緩沖液漂洗玻片，在濕盒中室溫下正常血清封閉。
將封閉溶液制備的一抗加到樣品中，在濕盒中孵育。沖洗玻片，與在封閉溶液中制備的二抗一起孵育，在用緩沖液漂洗，與商業(yè)試劑盒(如Dako Corporation)中的Avidin-House Reddish過氧化試劑或ABC復合體一起孵育。再漂洗玻片并用二氨基對二氨基聯(lián)苯(diaminobenzidin)展開液及包裹在金中的尿素過氧化氫一起孵育。在用蒸餾水沖洗后，將玻片浸泡在Mayer’s Hematoxylin中5分鐘，然后放在自來水中沖洗直到水無色，核變藍。將玻片脫水并放置蓋玻片用于觀察。
B.胰島素mRNA表達可以用來鑒定胰島細胞特性、分化或成熟的一個標記是胰島素mRNA的水平。例如，本發(fā)明的中間細胞群的胰島素mRNA在一定范圍內(nèi)顯現(xiàn)出表達，對胰島素mRNA定量的方法包括Northern印跡、核酶保護、引物延伸。在一個實施方案中，從培養(yǎng)的細胞群中提取mRNA，用定量逆轉錄PCR測量前胰島素轉錄的量。逆轉錄后，用與胰島素cDNA序列雜交的引物特異性地、定量地擴增胰島素cDNA，在擴增條件下，擴增產(chǎn)物的量與樣品中存在的mRNA的量有關(參見如Zhou等，J Biol Chem27225648-51(1997))。為了精確，動力學定性步驟是優(yōu)選的，利用其能測定起始mRNA的水平。
通常，使胰島素mRNA的量標準化為組成性表達的mRNA，如肌動蛋白，其能利用肌動蛋白特異性引物特異性地從同一RNA樣品中擴增。因此，胰島素mRNA表達的水平可以表示為胰島素mRNA擴增產(chǎn)物與肌動蛋白mRNA擴增產(chǎn)物的比例或簡單地表示為胰島素∶肌動蛋白mRNA比例。編碼其它胰腺激素(如生長激素抑制素或胰高血糖素)的mRNA的表達可以用同樣的方法定量。
C.葡萄糖刺激的胰島素分泌β細胞的重要功能之一是根據(jù)葡萄糖水平調(diào)節(jié)其胰島素的分泌。一般對增殖粘附的胰腺細胞進行靜態(tài)葡萄糖刺激(SGS)分析以鑒定它們是否能分泌與不同水平葡萄糖水平相應的胰島素，細胞通常培養(yǎng)在合適的底物中直到接近融合。SGS測試前3天，將培養(yǎng)液用缺乏胰島素和僅含1g/L的葡萄糖的相似性質的培養(yǎng)液替換，每天更換培養(yǎng)液一次，連續(xù)三天，在第四天進行SGS測試。
測試之前，可以收集培養(yǎng)液以進行葡萄糖和胰島素分析。為了制備用于檢測的細胞，用Dulbecco’s磷酸緩沖鹽(DPBS)+0.5％ BSA沖洗細胞兩次，每次沖洗孵育5分鐘，然后單獨用DPBS沖洗一次，也孵育5分鐘。沖洗后，用10ml(在100mm的培養(yǎng)皿中)或5ml(在60mm培養(yǎng)皿中)含60mg/dl葡萄糖(KRB-60)的Krebs-Ringers SGS溶液在37℃的培養(yǎng)箱中孵育細胞30分鐘，然后重復該培養(yǎng)。
為了進行SGS檢測，37℃下在3ml(在100mm的培養(yǎng)皿中)或2ml(在60mm培養(yǎng)皿中)KRB-60中孵育20分鐘，向培養(yǎng)液中吹氣并使其快速旋轉。收集培養(yǎng)液用于胰島素檢測作為LG-1(低葡萄糖刺激步驟)。然后加入等體積的KRB-450+theo(KRB和450mg/dl葡萄糖和10mM茶堿)，在如上相同的條件下孵育細胞。收集上清液用于胰島素分析作為HG(高葡萄糖刺激步驟)。然后再用KRB-60培養(yǎng)細胞，收集培養(yǎng)液作為LG-2，再一次作為LG-3。收集的培養(yǎng)液用于胰島素分析，可在-20℃下保藏，直到用放射免疫測定(RIA)或其它合適方法來測定胰島素含量。
SGS測試結果通常表示為刺激指數(shù)，定義為HG胰島素值除以LG-1胰島素值。一般地，認為SGS檢測中刺激指數(shù)大于或約等于2是陽性結果，雖然其它的值(如1.5、2.5、3.0、3.5等)也可用來定義特定的細胞群。
實施例下面的實施例是用來舉例說明，而不是用來限定要求保護的發(fā)明。
實施例1可原位成熟的中間階段胰腺干細胞群的產(chǎn)生中間階段的胰腺干細胞一般從供者的胰腺中分離，在促進中間階段的胰腺干細胞生長的條件下培養(yǎng)分離胰腺的混合細胞群。
器官的獲得從尸體的胰腺中分離胰腺細胞，該胰腺收集自多器官供者，59歲的男性白種人。器官收集由器官共享聯(lián)合網(wǎng)(UNOS，United Network forOrgan Sharing)和當?shù)氐钠鞴倬栀浗M織協(xié)調(diào)組織。
為了取出胰腺，首先在與腎動脈連接處的下面進行腹主動脈插管，通過下腸系膜靜脈插管進行門靜脈灌注(portal perfusion)，將該管向上插入到門靜脈和脾靜脈連接處的上面，在與門靜脈的連接處的脾靜脈上系上2-0結，同時在脾動脈上系上另一個2-0結。
結扎脾靜脈，沿脾一側切開血管，然后立即開始灌輸。這種方法能使灌輸更有效而不產(chǎn)生損傷胰島的高壓。這也能避免灌輸液從脾和胰腺排出到肝中。更少的囊得到開放，并在胰腺上使用了生理鹽水，在對主動脈進行了1升的灌注后，結扎脾動脈。
當肝和腎小組將脾靜脈和下面的胃部血管切開時將胰腺很好地保護。沿十二指腸邊緣分離胰腺，以減小損傷胰腺的風險，同時減小污染。
將器官保藏在充有UW溶液的塑料包中，放置在裝有無菌生理鹽水的Nalgene罐運輸。
從供者的胰腺中分離人胰島通過機械破碎和HBSS(1.5mg/ml)中溶解的消化酶(Liberase)消化裂解胰腺組織。將240ml Liberase溶液通過導管灌輸?shù)揭认僦校?00ml耐熱燒杯中37℃孵育該器官，直到組織變軟，大約要10-20分鐘。
除去組織塊中的主要導管，然后將其轉移到金屬裂解室中，開始自動循環(huán)分解。當在樣品中出現(xiàn)游離胰島時，收集200ml的裂解物，向系統(tǒng)中加入120ml(0.75mg/ml)新鮮Liberase溶液用于進一步消化。
在大多數(shù)胰島從周圍組織中釋放出來后，收集裂解物，用培養(yǎng)液A10(溶于RPMI的10％ FBS)稀釋，用A10沖洗細胞3次，4℃下以1,000rpm離心2分鐘。
在如美國專利第5,739,033號中所述的PIPS(溶于UW溶液的Nycodenz(Nycomed AS，Norway))溶液中用三層密度梯度分離法從腺泡細胞中分離胰島。
將沖洗過的胰腺細胞沉淀與320ml PIPS(密度為1.114)混合，在冰上孵育10分鐘。在8個250ml的平底離心管中裝入70ml PIPS(密度為1.090)，向每管的底部裝入40ml的細胞/PIPS懸液，將60ml含有2％ FBS的RPMI裝入到PIPS的上層，用帶有05，ARC轉頭的Sorvall RC-3C Plus在1500rpm下不間斷地離心6分鐘。
分別收集最上層界面(413，400IEQ，純度為67％)、較低層的界面(殘余胰島、胰島碎片、腺泡和導管細胞的混合物)和沉淀(主要指腺泡和導管細胞)。
用培養(yǎng)液A10沖洗細胞超過兩次，然后用于臨床移植(75％)或擴增研究(25％)。
中間階段胰腺干細胞的優(yōu)化培養(yǎng)分離出胰島后，立即將含有大約57％胰島的細胞部分置于組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)以使其擴增，最初的培養(yǎng)物稱作0代(p0)細胞。開始將細胞在由87％的無血清SM95和13％的含20％ FCS的培養(yǎng)液#7組成的混合培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液組分列在本申請的IIIA2部分中。在第四天第一次更換培養(yǎng)液，將p0細胞轉移到100％的無血清SM95培養(yǎng)液中。在整個培養(yǎng)過程中每星期更換培養(yǎng)液2次，漂浮的細胞與用完的培養(yǎng)液一起丟棄。
培養(yǎng)12天后，p0細胞達到融合狀態(tài)，在培養(yǎng)皿的底部用胰蛋白酶/EDTA消化細胞約10分鐘，然后用10％ FBS HBSS培養(yǎng)液沖洗，一分為二地將p0細胞接種到新的組織培養(yǎng)皿中，形成第1代(p1)細胞。在該次或后續(xù)的細胞傳代中，細胞接種的密度為每平方厘米培養(yǎng)皿表面約12,000個細胞。
實施例2中間階段胰腺干細胞的適應性培養(yǎng)作為成熟的預備步驟，中間階段胰腺干細胞同時在條件性培養(yǎng)皿和新培養(yǎng)皿中生長。
p1細胞培養(yǎng)7天后接種，形成第2代(p2)細胞，將大約2/3的從p1收集的細胞接種到條件性細胞培養(yǎng)皿中，該條件性細胞培養(yǎng)皿曾用于培養(yǎng)過來自另一移植體HD386i的胰腺細胞。剩余的1/3的細胞接種到新的非條件性組織培養(yǎng)皿中。在條件性培養(yǎng)皿和新培養(yǎng)皿中的細胞都持續(xù)擴增。
培養(yǎng)p2細胞7天，估計第1和2代的細胞合起來擴增了大約10倍，收集新的和條件培養(yǎng)皿中的細胞并將其合并，將這些增生的細胞部分接種到新的組織培養(yǎng)皿中，形成培養(yǎng)的第3代(p3)細胞。將細胞的另一部分包被在藻酸鹽-多聚賴氨酸微膠囊中，稱之為包被的p3細胞。
實施例3來包被的在培養(yǎng)液中生長的p3細胞的特征將p3細胞種在新的培養(yǎng)皿上，讓其在標準培養(yǎng)條件下在無血清SM95培養(yǎng)液中生長。與p1和p2細胞相比，該細胞的體外分析表明胰島素和胰高血糖素mRNA以穩(wěn)定水平表達。但是，培養(yǎng)液中的p3細胞以葡萄糖調(diào)節(jié)的方式高水平分泌胰島素，這表明p3細胞具有正常的胰島類功能。
胰島素和胰高血糖素mRNA水平分析用PT-PCT測定由培養(yǎng)的P0、P2和P3細胞表達的胰島素和胰高血糖素，用RNeasy mini試劑盒根據(jù)制造商的說明書分離RNA。簡言之，向細胞中加入裂解緩沖液(每10cm的培養(yǎng)皿中加650μl)，用一次性細胞刮片(Fisher #087732)收集細胞，然后用QIAshredder(QIAGEN #79654)裂解。從裂解液中分離總RNA，然后利用RiboGreen RNA定量檢測法(分子探針為#R-11490)進行定量。將RNA樣品在-80℃下貯藏至cDNA分析。用Omniscript RT試劑盒(QIAGEN #205111)按照制造商的說明書使用20pmmol寡(dT)16逆轉錄每個樣品，每個樣品分兩份(0.5μg每份)。然后用pH8.0的TE緩沖液將每個樣品稀釋到100μl，-20℃下保藏。在RocheMolecular LightCycler上進行實時PCR，使用2μl的各cDNA樣品和指示引物。用雜交探針方法和DNA Master雜交混合試劑盒(Roche #2158825)按照制造商的說明書測定肌動蛋白和胰島素。通過比較平行擴增的每種產(chǎn)品的標準曲線定量PCR產(chǎn)物。

測定培養(yǎng)的P0、P2和P3細胞表達的胰島素和胰高血糖素，結果如表1所示。在這三種細胞的傳代過程中，胰島素和胰高血糖素mRNA穩(wěn)定表達。
表1.HD394-P0～P3的胰島素和胰高血糖素mRNA的表達

靜態(tài)葡萄糖刺激(SGS，static glucose stimulation)測試培養(yǎng)細胞直到接近融合。在SGS測試三天前，用性質接近但不含胰島素和僅含1g/L葡萄糖的培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液，每天更換培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，在第4天進行SGS測試。
在測試前，收集培養(yǎng)液以進行葡萄糖和胰島素分析，為了準備用于測試的細胞，用Dulbeco’s磷酸緩沖鹽(DPBS)+0.5％ BSA沖洗細胞兩次，每沖洗一次孵育5分鐘，然后單獨用DPBS沖洗一次，也孵育5分鐘。沖洗后，用100ml(在100mm的培養(yǎng)皿中)或5ml(在60mm的培養(yǎng)皿中)含60mg/dl葡萄糖(KRB-60)的Krebs-Ringers SGS溶液在37℃下孵育細胞30分鐘，重復該孵育。
為了進行SGS測試，用3ml(100mm培養(yǎng)皿)或4ml(T75燒瓶)或2ml(60mm培養(yǎng)皿)KRB-60在37℃下孵育細胞20分鐘，吹起并轉動培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)液用于胰島素測試作為LG-1(低葡萄糖刺激步驟)。然后加入同體積的KRB-450+theo(含450mg/ml葡萄糖的KRB和10mM茶堿)，在如上相同的條件下培養(yǎng)細胞。收集懸浮液用于胰島素分析作為HG(高葡萄糖刺激)。再用KRB-60培養(yǎng)細胞，收集培養(yǎng)液作為LG-2。重復一次作為LG-3。收集用于胰島素分析的培養(yǎng)液，貯藏在-20℃下直至用放射免疫檢測(RIA)測定胰島素的量。
SGS測試的結構通常表示為刺激指數(shù)，被定義為HG胰島素值除以LG-1胰島素值。一般地，認為SGS檢測中刺激指數(shù)大于或約等于2是陽性結果。
表2顯示了未包被培養(yǎng)的P3細胞的SGS測試結果。該細胞的基礎胰島素釋放水平為149.5μU/60mm培養(yǎng)皿/小時，刺激的葡萄糖水平為781.6μU/60mm培養(yǎng)皿/小時，葡萄糖刺激的胰島素釋放增加了5.2倍。而且細胞在刺激后恢復到正常的、基礎的胰島素釋放水平。因此，培養(yǎng)的P3細胞顯示出了正常的胰島類功能。
表2.未包被的HD394-P3胰島的SGS測試結果

實施例4P3細胞的包被和聚集在高G藻酸鹽和高M藻酸鹽的混合物中包被約1.4×107個培養(yǎng)的P2細胞，從而形成包被的P3細胞。將P2細胞懸浮在3ml的1.4％的藻酸鈉溶液中，然后通過噴頭噴灑到0.33％的CaCl2·2H2O溶液中形成含有細胞且直徑大約為700微米的藻酸鹽凝膠球，將該凝膠球在0.33％的CaCl2·2H2O溶液中浸泡5-9分鐘，然后在0.13％的CaCl2·2H2O溶液中浸泡8分鐘，接著用0.1％的聚-L-賴氨酸處理凝膠球2分鐘以形成膜而將細胞包被在內(nèi)。然后用0.33％的CaCl2·2H2O溶液浸泡該膠囊1分鐘，用鹽沖洗膠囊，在0.2％的藻酸鹽中浸泡10分鐘，再用鹽沖洗。將膠囊放入0.05％的多聚賴氨酸中浸泡5分鐘，用鹽沖洗。接著用55mM檸檬酸鈉處理5分鐘使膠囊里邊的藻酸鹽凝膠液化，用鹽再一次沖洗后，用0.2％的藻酸鹽處理膠囊10分鐘，再用鹽沖洗。為了完成包被，將膠囊在RPMI中浸泡8分鐘。
24小時后，膠囊中的細胞開始聚集并形成胰島類結構，在裝有含0.03mM(30μM)CaCl2·2H2O和10％的胎牛血清的M4培養(yǎng)液的T75燒瓶中培養(yǎng)該包被的P3細胞，每星期更換培養(yǎng)液兩次，體外保持該包被的細胞13天，然后用于移植。
實施例5包被、聚集的P3胰島素生成細胞的表征包被24小時后，擴增的胰腺細胞聚集并顯示出與直接從胰腺中分離的包被的胰島相似的細胞結構，體內(nèi)和體外檢測證實包被擴增的胰腺細胞具有與體外發(fā)生改變的胰島相似的功能。
在培養(yǎng)液中生長的包被、聚集的P3細胞的組織學用于免疫組織化學檢測的細胞可以培養(yǎng)在小室中玻片上以進行顯微觀察。可選擇地，在常規(guī)組織培養(yǎng)液中生長的細胞和包被的細胞可以通過手工從培養(yǎng)物中移出，包埋在石蠟中用于切片。按照Leonard J等，Mol.Endocrinol，1993，Oct 7，(10)1275-83的教導可以制備PDX-1抗體。
細胞分化標記是可變化的，可以用常規(guī)的免疫組織化學方法來檢測。通常的可用方法如下。
移出小室中玻片時開始染色處理，在緩沖液中非常輕柔地漂洗細胞，在多聚甲醛溶液中固定。然后室溫下在含有正常血清的封閉溶液中孵育細胞，用含非離子去污劑的封閉溶液使增加細胞通透性，一抗如下表所示，在封閉溶液中進行適當稀釋制備這些抗體，將其加到細胞中孵育。在用一抗孵育后，用緩沖液漂洗細胞，再用封閉溶液封閉。
將用封閉溶液適當稀釋而制備的二抗加到細胞中，黑暗條件下孵育，孵育后，漂洗細胞并用Hoechst染料重染色核，除去過量液體，用蓋玻片蓋住玻片。干燥玻片并將其保藏在黑暗中。
可選擇地，可以使用ABC免疫組織化學方法制備細胞。簡言之，將細胞包埋在石蠟中，37℃過夜染色含有石蠟切片的玻片。將細胞去石蠟化，浸泡在過氧化氫甲醇溶液中以抑制內(nèi)源過氧化酶活性。將玻片在0.01的檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中煮沸30分鐘以修復特定抗原決定基。用緩沖液漂洗玻片，在濕盒中室溫下正常血清封閉。
將封閉溶液制備的一抗加到樣品中，在濕盒中孵育。沖洗玻片，與在封閉溶液中制備的二抗一起孵育，在用緩沖液漂洗，與商業(yè)試劑盒(如Dako Corporation)中的Avidin-House Reddish過氧化試劑或ABC復合體一起溫浴。再漂洗玻片并用二氨基對二氨基聯(lián)苯(diaminobenzidin)展開液及包裹在金中的尿素過氧化氫一起孵育。在用蒸餾水沖洗后，將玻片浸泡在Mayer’s Hematoxylin中5分鐘，然后放在自來水中沖洗直到水無色，核變藍。將玻片脫水并放置蓋玻片用于觀察。
表3通常使用的一抗及與其聯(lián)合使用的二抗

為了組織學分析，針對CK-19、PDX-1和內(nèi)分泌激素對微膠囊集落進行免疫染色，結果如表1A所示，CK-19染色顯示了單層的CK-19陽性細胞，其與環(huán)繞在內(nèi)部細胞團周圍的基層上皮細胞相似。內(nèi)部的細胞團顯示出明顯的胰島素、生長激素抑制素和胰高血糖素著色(圖1B-D)。因此，包被的P3集落的染色圖案顯示出了與重建的胰島相似的細胞結構。包被的P3細胞聚集后在體外的功能包被的P3細胞集落在體外的功能通過SGS檢測法來測定(表4)，該細胞的基礎胰島素釋放水平為3.7μU/膠囊/小時，刺激的葡萄糖釋放水平為2.3μU/膠囊/小時，該速率低于培養(yǎng)的P3細胞。這種弱化反應的原因是因為藻酸鹽與胰島素發(fā)生了結合。在細胞包被后，但在胰島素結合藻酸鹽的能力達到滿意程度之前進行SGS測試，胰島素與藻酸鹽的結合通過胰島素生成細胞周圍的藻酸鹽染色胰島素的存在來顯示。
表4、包被的HD394-P3胰島的SGS測試

包被的P3細胞聚集后在體內(nèi)的功能為了測定包被的P3集落在體內(nèi)的功能，將包被的細胞移植到STZ誘導的糖尿病SCID小鼠中。通過單一的腹膜內(nèi)注射鏈脲菌素(220mg/kg)使實驗動物(SCID小鼠)患有糖尿病。一個星期內(nèi)該動物出現(xiàn)高血糖(＞400mg/dl)。
為了移植包被的細胞，將動物的腹壁消毒，用1ml的注射器和14-號血管導管，將含有120,000個細胞的800個微膠囊在全身麻醉的情況下無菌地移植到上述糖尿病鼠的腹腔中。
移植后周期性地測量血液葡萄糖和體重。用肝素化的玻璃毛細管從任一眼眶中收集血液樣品，離心毛細管，將血漿收集到eppendorf管中，用Beckman II葡萄糖分析儀測定葡萄糖水平。
圖2顯示了包被的P3細胞在體內(nèi)的功能。移植后，受體鼠保持高水平葡萄糖18天。但是，在移植后第48天，受體鼠顯示出正常的葡萄糖水平。在移植后第55天進行再一次測試證實了該正常的葡萄糖水平。
從受體鼠中回收上述移植的包被P3集落用于組織學分析，移植塊和從網(wǎng)膜、肝和腎中收集的活組織切片用于組織學分析。圖3A-F顯示了兩倍放大的回收集落的兩個區(qū)域。免疫染色顯示移植后在包被的P3集落中存在胰島素生成細胞。環(huán)繞的藻酸鹽也是胰島素陽性，這顯示了與藻酸鹽結合的胰島素(圖3E)。
實施例6體外發(fā)生改變的胰島包被后的特征為了對照，將P3胰腺細胞與直接分離自胰腺的胰島細胞比較，該胰島是糖尿病治療的模式系統(tǒng)。該胰島細胞從胰腺中分離后包被到藻酸鹽微膠囊不久就產(chǎn)生可辨認的結構，將這種包被的胰島細胞保持在培養(yǎng)液中并保留用胰島素表達和SGS測試來確定的功能性胰島活性。當移植到糖尿病大鼠中時該包被的島細胞在體內(nèi)也顯示出功能。
體外重建胰島的包被如上所述從供者的胰腺中分離人胰島，其純度在60％以上。在包被之前，新分離的島細胞在裝有含血清的M7培養(yǎng)液的非粘附性Fenwall袋中懸浮培養(yǎng)4-48小時。包被后，包被的島細胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)到兩年半。對包被的在培養(yǎng)液中培養(yǎng)6個月(HD302)和28個月(HD314)的胰島的兩個群進行了分析。
將膠囊固定并切片用于組織學分析，如上文所述。針對CK-19、PDX-1、內(nèi)分泌激素和淀粉酶染色膠囊內(nèi)的細胞(圖4A-E是6個月的胰島，圖5A-E是28個月的胰島)。
在原始和包被的胰島中，CK-19細胞著色有明顯的不同。原始胰島中的CK-19陽性細胞著色很弱，不能識別出細胞的組織結構。相反，有一單層CK-19陽性細胞環(huán)繞在體外培養(yǎng)的島周圍。細胞結構上的不同表明從胰腺中分離并在體外培養(yǎng)后的胰島已經(jīng)發(fā)生重建。重建胰島的CK-19陽性細胞的獨特單層結構代表上皮基層。對內(nèi)分泌激素進行染色表明胰島素、胰高血糖素和生長激素抑制素陽性細胞存在于被CK-19細胞環(huán)繞的內(nèi)細胞群中。
CK-19陽性細胞大部分是PDX-1陽性，這表明其是胰腺的祖細胞，如B.Weir的報道(Bonner-Weir等.PNAS USA 977999-8004(2000))。該環(huán)繞的CK-19、PDX-1陽性細胞層隨著時間的推移數(shù)量變少且著色減弱。
體外重建胰島的包被及體外的功能在培養(yǎng)液中維持包被的胰島9個月后，用靜態(tài)葡萄糖刺激(SGS)測定法測定細胞在不同的葡萄糖水平時分泌胰島素的能力以檢測其體外功能。
每個微膠囊相當于0.75個胰島單位(EQ)，結果如表5所示，SGS測試表明基本胰島素釋放水平為17nU/胰島EQ/小時，刺激的葡萄糖水平為73nU/胰島EQ/小時，刺激指數(shù)為4。
表5.對包被的HD357胰島進行的移植前SGS測試，胰島素輸出(μU/ml)

體外重建胰島的體內(nèi)功能在培養(yǎng)液中培養(yǎng)9個月后，將其移植到STZ誘導的糖尿病裸鼠中檢測包被胰島在體內(nèi)的功能(圖6)。在大鼠1中，血液葡萄糖水平在移植后的兩天內(nèi)從移植前的495mg/dl降低到99mg/dl。在大鼠2中，血液葡萄糖水平在移植后的兩天內(nèi)從移植前的561mg/dl降低到79mg/dl。
移植后第35天對大鼠進行口服葡萄糖耐量測試(OGTT)，將動物禁食過夜，或者約10-16小時。禁食后，抽取血液樣品以進行血漿葡萄糖測定(樣品0)。喂給動物1.75gm/kg葡萄糖P.O.(45％的溶液)，喂給后30分鐘(樣品1)、1小時(樣品2)、90分鐘(樣品3)和2小時(樣品4)收集血液樣品。通過尾靜脈穿刺獲得血液樣品，用肝素花毛細管來收集血液和分離血漿。用Beckman II葡萄糖分析儀測定血糖，在移植后第35天，對正常和接近正常的移植鼠進行OGTT，為進行比較，正常值如表6所示。
表6.口服葡萄糖耐受性測試的標準值

在移植后第59天，大鼠1死于眼部感染，在第118天，從大鼠2移出50％的包被胰島塊，不久，該動物的血糖水平開始出現(xiàn)波動，在移出胰島塊43天后，血糖水平增加到300mg/dl。在移出胰島塊93天后，血糖水平是403mg/dl。
最近研究的結果進一步證實了前述的臨床前和臨床研究直接從胰腺中分離的包被的胰島在體內(nèi)和體外都具有功能。
實施例7人胰腺原始胰島的特征為了比較，分析胰島以測定CK-19和PDX-1陽性細胞的位置和結構，在胰腺組織中沒有發(fā)現(xiàn)與CK-19和PDX-1陽性細胞有關的可識別結構。
供者胰島的組織表征在修整用于分離胰島的供者胰腺的同時采集該供者胰腺組織樣品，處理樣品用于組織學鑒定，針對CK-19、PDX-1、內(nèi)分泌激素和淀粉酶對原始胰島和其周圍的胰腺組織進行免疫染色(圖8A-F)。
CK-9染色表明，CK-19陽性細胞分散在整個胰腺中，如同預料的一樣它們位于胰腺的導管中。在胰島的內(nèi)部是弱著色的CK-19陽性細胞，但沒有可識別的組織結構。PDX-1染色表現(xiàn)出胰島內(nèi)許多PDX-1陽性細胞的核染色圖案。在CK-19和PDX-1陽性細胞之間沒有發(fā)現(xiàn)直接的重迭染色，內(nèi)分泌激素和淀粉酶表現(xiàn)出典型的標準細胞染色圖案。
可以理解本申請所描述的實施例和實施方案式僅僅是為了說明的目的，本領域所屬技術人員可對其做出的各種修飾或改變，而這種修飾或改變包含在本申請的精神和范圍內(nèi)以及所附權利要求的范圍之內(nèi)。本申請所引用的所有出版物、專利和專利申請在此將其全文引為參考。
序列表SEQUENCE LISTINGCCTCGCCTTTGCCGATCCSeq.ID No.1GCCATCAAGCACATCACTGT Seq.ID No.2AGCCACACGCAGCTCATTGTAGA Seq.ID No.3AGAGGGAGCAGATGCTGGTA Seq.ID No.4CCCATCGAGCACGGCATCGTCACCAASeq.ID No.5CAGCCTGCAGCCCTTGGCC Seq.ID No.6TGGGACGACATGGAGAAAATCTGGCACCACSeq.ID No.7TGGAGGGGTCCCTGCAGAAG Seq.ID No.8
權利要求
1.原位向哺乳動物提供胰島素的方法，所述方法包括(a)包被用于繁殖胰腺細胞的細胞培養(yǎng)物，所述的細胞培養(yǎng)物具有如下屬性(i)具有能夠以約180個細胞/平方厘米的初始濃度從一個培養(yǎng)容器傳代到另一個容器并擴增到約1800個細胞/平方厘米的能力，及(ii)在擴增和未擴增的細胞中90％是PDX-1陽性，且胰島素∶肌動蛋白mRNA比率為1∶100～1000∶1；(b)將所述包被的細胞插入到哺乳動物中以使所述細胞成熟成胰島素分泌細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞成熟成細胞集落。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞成熟成細胞集落，所述集落包括由CK-19陽性細胞形成的包被覆蓋層和由50-5000個胰腺細胞形成的內(nèi)細胞團，其直徑為50-300微米。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述的哺乳動物是糖尿病人。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物的胰島素∶肌動蛋白mRNA比率為1∶10～100∶1。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述包被步驟包括用藻酸鹽包裹細胞以形成膠囊，用二價陽離子交聯(lián)藻酸鹽，及提供多聚賴氨酸膜密封所述膠囊。
7.一種含有包被的胰腺細胞的組合物，所述包被的胰腺細胞具有如下屬性(i)具有能夠以約180細胞/平方厘米的初始濃度從一個培養(yǎng)容器傳代到另一個容器并擴增到約1800個細胞/平方厘米的能力，及(ii)在擴增和未擴增的細胞中90％是PDX-1陽性，且胰島素∶肌動蛋白mRNA比率為1∶100～1000∶1。
全文摘要
本發(fā)明涉及到發(fā)現(xiàn)存在的中間的、分化階段的胰腺干細胞，該干細胞能在原位成熟成穩(wěn)定的細胞系，該細胞系可產(chǎn)生葡萄糖反應性的胰島素。這些細胞的價值在于它們在培養(yǎng)過程中既能擴增而且穩(wěn)定。本發(fā)明避免了將中間階段的干細胞培養(yǎng)成末期階段的胰腺細胞的步驟。
文檔編號A61K47/36GK1620251SQ02828230
公開日2005年5月25日 申請日期2002年12月23日 優(yōu)先權日2001年12月21日
發(fā)明者臧文治, 鄭天立, 王燕萍 申請人:艾姆賽特有限公司