專(zhuān)利名稱(chēng)：人乳頭狀瘤病毒治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療人乳頭狀瘤病毒感染。
背景技術(shù)：
人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是常見(jiàn)病。HPV可通過(guò)性傳播，據(jù)估計(jì)20-80％的有性活動(dòng)的成年人已感染了此病毒。但大多數(shù)感染沒(méi)有癥狀，感染可導(dǎo)致生殖器疣(其在成年人中約有1-5％具有流行性)以及肛殖道癌癥的發(fā)展。另一類(lèi)型的癌癥，宮頸癌就與HPV密切相關(guān)(Frazer，Genitourin.Med.72398-403，1996)。HPV6、11、16、18、31和33型通常與癌癥風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān)，而在90％以上的宮頸癌中檢測(cè)出有16和/或18型(van Driel等，Ann.Med.28471-477，1996)。6和11型也與肛殖疣相關(guān)。對(duì)于乳頭狀瘤病毒及其相關(guān)的病理的綜述參見(jiàn)Fields等編，病毒學(xué)(Virology)，第3版，Shah等的“第66章人乳頭瘤病毒，”Raven Press，Philadephia，第2077-2109頁(yè)，1996以及zur Hausen，J.Natl.Cancer Inst.92690-698，2000。
當(dāng)前還沒(méi)有安全可靠的途徑通過(guò)靶向免疫系統(tǒng)來(lái)治療或預(yù)防上述的疣或疾病。開(kāi)發(fā)這樣的治療方法的努力由于若干原因受到阻礙，其中原因之一是來(lái)自一個(gè)法則，即單一的HPV類(lèi)型的抗原引起一種限制的類(lèi)型特異的免疫應(yīng)答。結(jié)果這暗示含有來(lái)自若干不同HPV類(lèi)型的抗原的雞尾酒對(duì)廣泛有效的HPV治療是必需的(Caine等，Science2881753，2000)。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于下列發(fā)現(xiàn)含有來(lái)自一種類(lèi)型HPV的蛋白的融合蛋白可用于治療由另一類(lèi)型的HPV感染所引起的疾病或癥狀。例如，與細(xì)菌熱激蛋白(hsp)融合的第16型HPV抗原在治療由除第16型以外的HPV類(lèi)型(如第6和11型的HPV)所引起的人肛殖疣是有效的。此結(jié)果支持兩個(gè)論點(diǎn)(1)疣可用HPV蛋白治療和(2)為了廣泛有效，針對(duì)HPV的治療劑不需要含有來(lái)自不同HPV類(lèi)型的蛋白抗原。
因此，本發(fā)明的特征是通過(guò)給個(gè)體施用組合物來(lái)治療個(gè)體的疣的方法，所述組合物含有(1)hsp或其免疫刺激片段和(2)HPV蛋白(例如，抗原蛋白如第16型HPV的E7蛋白)或其抗原片段。這些組分本文可分別稱(chēng)為“組分(1)”和“組分(2)”。hsp(或其免疫刺激片段)和HPV蛋白(或其抗原片段)既可被簡(jiǎn)單地組合在同一種的制劑中也可通過(guò)化學(xué)共軛或融合而更緊密地結(jié)合在一起(即個(gè)體可施用具有本文所述組分的融合蛋白或可施用編碼該融合蛋白的核酸分子)。組分(1)和組分(2)組合、共軛或融合后將被同時(shí)施用。然而，各組分也可分開(kāi)施用(如按序施用)，以及組分(2)可在沒(méi)有組分(1)的情況下施用。上述方法包括步驟，其鑒定個(gè)體是患有或懷疑患有疣(在治療個(gè)體的情況下，開(kāi)始施用治療劑之前要進(jìn)行鑒定)。醫(yī)師和本領(lǐng)域中其他普通技術(shù)人員能很好地鑒別這些個(gè)體。
本發(fā)明方法也可用于預(yù)防疣，在這種情況下，想要預(yù)防疣或?qū)念A(yù)防疣中獲益的個(gè)體(而非已患有疣的個(gè)體)要作鑒定。
本發(fā)明的特征還是通過(guò)給個(gè)體施用組合物來(lái)治療個(gè)體的方法，所述個(gè)體患有以第一類(lèi)型的HPV(如第5、6、11、18、31、33、35、45、54、60或70型)感染所導(dǎo)致的疾病或癥狀，所述組合物含有(1)hsp或其免疫刺激片段和(2)第二類(lèi)型的HPV(如第16型)的蛋白或其抗原片段。即“第一類(lèi)型”的HPV和“第二類(lèi)型”的HPV相互是有區(qū)別的；它們屬于兩種不同的HPV類(lèi)型。hsp(或其免疫刺激片段)和HPV蛋白(或其抗原片段)可被簡(jiǎn)單地組合在同一種的制劑中或者通過(guò)化學(xué)共軛或融合而更緊密結(jié)合(即人們可施用具有本文描述的組分的融合蛋白或可施用編碼該融合蛋白的核酸分子)。組分(1)和組分(2)組合、共軛或融合后將被同時(shí)施用。然而，各組分也可分開(kāi)施用(如按序施用)，以及組分(2)可在沒(méi)有組分(1)的情況下施用。這里該方法也可包括這步驟，其中對(duì)患有或懷疑患有HPV感染(或與此相關(guān)的疾病或癥狀)的個(gè)體進(jìn)行鑒定。
當(dāng)由第一類(lèi)型的HPV感染的個(gè)體施給包括第二類(lèi)型的HPV的組合物時(shí)，在HPV感染被定型之前，在其一目了然之前或在其已發(fā)生之前，可實(shí)施該方法(即在治療或預(yù)防開(kāi)始之前，人們無(wú)需了解個(gè)體已被感染或?qū)⒁腥镜奶囟ǖ腍PV類(lèi)型)。當(dāng)方法是預(yù)防性時(shí)，它們可包括步驟，其中對(duì)想要預(yù)防HPV感染或?qū)念A(yù)防HPV感染中獲益的個(gè)體要進(jìn)行鑒定。
本文所述的組合物施用的量要足以治療疣(例如通過(guò)減小疣的大小或改變疣的形狀，或通過(guò)緩解與疣相關(guān)的癥狀(如通常與跖疣相關(guān)的疼痛)；當(dāng)個(gè)體患有一種以上的疣時(shí)，治療可包括減少疣的數(shù)目)。同樣，本文所述的組合物施用的量是足以治療由HPV感染所引起的或與HPV感染相關(guān)的疾病(例如，癌癥(如宮頸癌或直腸癌))或其他癥狀(例如，發(fā)育異常(如宮頸或直腸發(fā)育異常))。盡管上文分別地提及疣，疣也構(gòu)成由HPV導(dǎo)致或與HPV相關(guān)的癥狀。當(dāng)與疣或疾病或癥狀相關(guān)的不良的生理效應(yīng)有減少時(shí)，醫(yī)師和本領(lǐng)域的其他普通技術(shù)人員將認(rèn)可疣或HPV相關(guān)疾病或癥狀的有效“治療”。疣的臨床和生理表現(xiàn)以及與HPV感染相關(guān)的疾病或癥狀的那些表現(xiàn)在例如Fauci等，Harrison’s Principles of Internal Medicine，第14版，McGraw-Hill Press，New York，第302-303頁(yè)和第1098-1100頁(yè)，1998中討論。
從本文所述方法中可獲益的“個(gè)體”是那些能被乳頭狀瘤病毒感染的個(gè)體(例如，哺乳動(dòng)物如人、牲畜(如奶牛、馬、豬、綿羊和山羊)，家畜(如貓和狗))。疣可以是發(fā)生在個(gè)體的生殖器、皮膚或內(nèi)臟上(如出現(xiàn)在聲帶上的疣，是復(fù)發(fā)的呼吸性乳頭狀瘤病(RRP；也已知是青少年喉部乳頭狀瘤病(JLP)或成人發(fā)作的RRP))。
本發(fā)明進(jìn)一步包括依據(jù)本文所述的方法，將本文所述的一種或多種組合物(包括那些含有蛋白、蛋白共軛物或融合蛋白或編碼它們的核酸分子)用于治療患有疣或與HPV感染相關(guān)(或由HPV感染所導(dǎo)致)的疾病或癥狀的個(gè)體。本發(fā)明還包括依據(jù)本文所述的方法，利用一種或多種如此組合物來(lái)制造藥物，用于治療患有疣或與HPV感染相關(guān)(或由HPV感染所導(dǎo)致)的疾病或癥狀的個(gè)體。
蛋白(如HPV蛋白)的“抗原片段”是蛋白的任意部分，當(dāng)依據(jù)本文所述方法施用時(shí)，其在個(gè)體體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)是特異的片段或特異于從中獲得該片段的蛋白。免疫反應(yīng)可以是體液或細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。例如，抗原片段是HLA第I型肽抗原，如下文所述。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明上下文中所要的免疫反應(yīng)不僅可通過(guò)完整的蛋白及其片段產(chǎn)生，而且可通過(guò)突變蛋白(如那些在其氨基酸序列中含有一個(gè)或多個(gè)添加、替換(如保守氨基酸替換)或缺失的突變蛋白)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。突變HPV抗原可容易被制備以及對(duì)它們?cè)诒景l(fā)明情況下作用的能力進(jìn)行測(cè)試。
蛋白(如hsp)的“免疫刺激片段”是蛋白的任意部分，當(dāng)依據(jù)本文所述的方法施用時(shí)，其促進(jìn)由抗原導(dǎo)致的免疫反應(yīng)。例如，當(dāng)HPV蛋白與hsp片段一起(如融合)施用時(shí)，如果對(duì)HPV蛋白的免疫反應(yīng)受到促進(jìn)，則該片段就是hsp的免疫刺激片段。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到免疫反應(yīng)還可通過(guò)突變hsp(如在氨基酸序列中含有一個(gè)或多個(gè)添加、替換(如保守氨基酸替換)或缺失的hsp)受到促進(jìn)。突變hsp可容易被制備以及對(duì)它們促進(jìn)HPV抗原的免疫反應(yīng)的能力進(jìn)行測(cè)試。
本發(fā)明方法提供了以(即利用)含有另一類(lèi)型HPV的組合物來(lái)進(jìn)行下列治療和預(yù)防的一個(gè)有效方法(1)治療和預(yù)防疣和(2)治療和預(yù)防用一種類(lèi)型HPV感染所導(dǎo)致(或與此相關(guān))的疾病或癥狀。結(jié)果，不管它們感染(或它們可變成感染)的是什么類(lèi)型的HPV，含有單一類(lèi)型HPV的HPV抗原的組合物可用于許多個(gè)體中，如果不是大多數(shù)個(gè)體。令人驚奇的是HPV組合物在這些情形(即要求交叉反應(yīng)的情形)下是有效的。人們一直認(rèn)為一種類(lèi)型的HPV抗原不能引發(fā)有效的抗另一種類(lèi)型HPV抗原的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的其他特征或優(yōu)點(diǎn)從以下詳細(xì)的描述以及權(quán)利要求書(shū)中將表明清楚。
詳細(xì)描述本發(fā)明涉及廣泛有效的含有hsp和HPV蛋白(如蛋白抗原)的基于PHV的治療劑。無(wú)需將本發(fā)明限制在其中基于HPV的療法通過(guò)特定機(jī)制發(fā)揮其效果的方法中，認(rèn)為該藥劑產(chǎn)生免疫反應(yīng)，改善疣和其他與HPV感染相關(guān)的癥狀(如發(fā)育異常)和疾病(如癌癥)。特別是當(dāng)本發(fā)明的組合物含有來(lái)自一種以上類(lèi)型HPV的HPV蛋白時(shí)，它們可含有來(lái)自只有單一類(lèi)型的HPV蛋白。此外，含有來(lái)自單一類(lèi)型HPV的HPV蛋白的組合物在治療或預(yù)防疣或其他由另一種(即不同)類(lèi)型的HPV感染所導(dǎo)致的HPV相關(guān)的疾病或癥狀是有用的。適用于本發(fā)明有關(guān)的各種材料和程序在下文討論。
融合蛋白的制備編碼hsp和HPV蛋白的核酸序列對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知和可獲得的。因此，利用常規(guī)方法(同樣，這些核酸分子可用于單獨(dú)生產(chǎn)hsp和HPV蛋白；然后，單個(gè)hsp和HPV蛋白可物理地組合(如簡(jiǎn)單混合在一起)或通過(guò)化學(xué)共軛(參見(jiàn)下文)或二硫鍵連接)，可容易制備編碼本發(fā)明方法中有用的融合多肽的核酸構(gòu)建體。編碼任選與抗原(如HPV抗原)融合的hsp的核酸序列的例子可在下列文獻(xiàn)中找到國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 89/12455、WO 94/29459、WO 98/23735和WO 99/07860以及其中引入的參考文獻(xiàn)。表達(dá)和純化蛋白包括融合蛋白的方法下文進(jìn)一步討論。
蛋白共軛物的制備組分(1)和組分(2)也可通過(guò)單個(gè)hsp和單個(gè)HPV抗原的平移后的共軛作用來(lái)連接。化學(xué)共軛兩種蛋白(或其部分)的方法本領(lǐng)域中是已知的(參見(jiàn)，如在Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，CA，1996；Lussow等，Eur.J.Immun.212297-2302，1991以及Barrios等，Eur.J.Immun.221365-1372，1992中所述的技術(shù))。共軛物的制備方法可采用交聯(lián)劑，如戊二醛(其變成所得共軛物的一部分)，或通過(guò)二硫鍵連接組分(1)和組分(2)。人們可采用在hsp、HPV抗原中天然存在或重組插入的或兩者皆有的半胱氨酸殘基來(lái)促進(jìn)分子間二硫鍵的形成。含有與HPV抗原非共價(jià)結(jié)合的hsp或其免疫刺激片段(即組分(1))的組合物可按下列文獻(xiàn)所述來(lái)生產(chǎn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,048,530、6,017,544、6,017,540、6,007,821、5,985,270、5,948,646、5,935,576、5,837,251、5,830,464或5,750,119。也可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,997,873、5,961,979、6,030,618、6,139,841、6,156,302、6,168,793以及國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO 97/06821。
不管所施用的組合物最終結(jié)構(gòu)如何，組分(1)和組分(2)可包括下列物質(zhì)。
HPV蛋白抗原任何HPV抗原都適用于本發(fā)明的組合物(如本文所述的混合物、共軛物和融合蛋白)中。然而，表達(dá)HPV感染細(xì)胞表面上的可識(shí)別表位的HPV抗原應(yīng)尤其有用。HPV表達(dá)6或7種非結(jié)構(gòu)蛋白以及兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，以及這些蛋白的每一個(gè)在本文所述的免疫預(yù)防或免疫治療方法中可充當(dāng)靶子。
病毒衣殼蛋白L1和L2是晚期結(jié)構(gòu)蛋白。L1是主要的衣殼蛋白，其氨基酸序列在不同種類(lèi)的HPV中是高度保守的。有7種早期非結(jié)構(gòu)蛋白。蛋白E1、E2和E4在病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用。蛋白E4還在病毒成熟中起作用。對(duì)E5的作用了解不多。蛋白E6和E7是癌基因蛋白，它們對(duì)病毒復(fù)制以及宿主細(xì)胞永生化和轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。
Hsp各種hsp已從大批生物體中經(jīng)分離、克隆和特征鑒定(Mizzen，Biotherapy 10173-189，1998；如本文所用，術(shù)語(yǔ)“熱激蛋白”或其縮寫(xiě)(hsp)與稱(chēng)為“應(yīng)激蛋白”的蛋白同義或包括此蛋白)。免疫刺激hsp或其免疫刺激片段適用于本文所述的組合物(如用作融合多肽的一部分)。Hsp70、hsp60、hsp20-30和hsp10是其中由宿主針對(duì)結(jié)核分枝桿菌(Mycobaterium tuberculosis)和麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)感染的免疫反應(yīng)所識(shí)別的主要決定因素。此外，牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)菌株Bacille Calmette Guerin(BCG)的hsp65發(fā)現(xiàn)是有效的免疫刺激劑，如在以下實(shí)施例中所述。
如本文所述，其中任一種可用于組分(1)的Hsp基因和hsp的家族在本領(lǐng)域中是眾所周知的。這些家族包括例如Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、Hsp70、Hsp60、TF55、Hsp40、FKBP、親環(huán)蛋白、Hsp20-30、ClpP、GrpE、Hsp10、遍在蛋白質(zhì)、鈣聯(lián)接蛋白以及蛋白二硫化物異構(gòu)酶。參見(jiàn)，例如Macario，Cold Spring HarborLaboratory Res.2559-70，1995；Parsell等，Rev.Genet.27437-496，1993以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,232,833。Hsp可以是但不限于哺乳動(dòng)物hsp、細(xì)菌hsp和分枝桿菌hsp。
Grp170(指葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白)是hsp100-200家族中hsp的例子。Grp170存在于前高爾基體區(qū)室中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，并在免疫球蛋白折疊和裝配中發(fā)揮作用。
hsp100家族中hsp的例子包括哺乳動(dòng)物Hsp110、酵母Hsp104以及大腸桿菌(E.coli)hsp ClpA、ClpB、ClpC、ClpX和ClpY。
Hsp90家族中hsp的例子包括大腸桿菌中的HtpG、酵母中的Hsp83和Hsc83以及人中的Hsp90α、Hsp90β和Grp94。Hsp90結(jié)合蛋白質(zhì)基因，它通常是細(xì)胞調(diào)節(jié)分子，如在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中發(fā)揮作用的類(lèi)固醇激素受體(如糖皮質(zhì)激素、雌激素、孕酮和睪甾酮受體)、轉(zhuǎn)錄因子以及蛋白激酶。Hsp蛋白也參與大的高豐度蛋白復(fù)合體的形成，該復(fù)合體包括其他應(yīng)激蛋白。
Lon是降解大腸桿菌中非天然蛋白質(zhì)的四聚體依賴(lài)ATP的蛋白酶。
Hsp70家族中hsp的例子包括來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Hsp72和Hsc73、來(lái)自細(xì)菌或分枝桿菌如麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌(Bacille-Calmette Guerin；本文稱(chēng)為hsp71)的DnaK、來(lái)自大腸桿菌、酵母和其他原核生物的DnaK以及BiP和Grp78。Hsp70能特異結(jié)合ATP以及未折疊的多肽和肽；hsp70參與蛋白折疊和未折疊以及蛋白復(fù)合體的裝配和解體。
來(lái)自Hsp60家族的hsp的例子是來(lái)自分枝桿菌的Hsp65。細(xì)菌Hsp60也是一般公知的GroEL。Hsp60形成大的同型寡聚體復(fù)合體，并且似乎是在蛋白折疊中起關(guān)鍵作用。Hsp60同系物存在于真核生物的線粒體和葉綠體中。
TF55家族中hsp的例子包括Tcpl、TRiC和熱小體(thermosome)。這些蛋白通常出現(xiàn)在真核生物的胞質(zhì)和一些古細(xì)菌中，它們形成多元環(huán)，促進(jìn)蛋白折疊。它們還與Hsp60具有弱的同源性。
Hsp40家族中的hsp的例子包括來(lái)自原核生物如大腸桿菌和分枝桿菌的DnaJ以及HSJ1、HDJ1和Hsp40。Hsp40作為分子伴侶在蛋白折疊、耐熱性和DNA復(fù)制等其他細(xì)胞活性中發(fā)揮作用。
FKBP的例子包括FKBP12、FKBP13、FKBP25以及FKBP59、Fprl和Nepl。這些蛋白通常具有肽基脯氨酰基異構(gòu)酶活性并與免疫抑制劑如FK506和納巴霉素(rapamycin)相互作用。這些蛋白通常在胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中找到。
親環(huán)蛋白的例子包括親環(huán)蛋白A、B和C。這些蛋白具有肽基脯氨酰基異構(gòu)酶活性并與免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(cyclosporin A)相互作用。
Hsp20-30也稱(chēng)為小Hsp。Hsp20-30通常發(fā)現(xiàn)于大的同型寡聚體復(fù)合體或可能的異型寡聚體復(fù)合體中。生物體或細(xì)胞類(lèi)型可表達(dá)若干種不同類(lèi)型的小Hsp。Hsp20-30與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相互作用，并可在肌動(dòng)蛋白的聚合/解聚中起調(diào)節(jié)作用。在靜息細(xì)胞應(yīng)激或暴露于生長(zhǎng)因子之后，Hsp20-30快速磷酸化。Hsp20-30同系物包括α-晶體蛋白。
ClpP是參與異常蛋白降解的大腸桿菌蛋白酶。ClpP的同系物在葉綠體中找到。ClpP與ClpA形成異型寡聚體復(fù)合體。
GrpE是約20kDa的大腸桿菌蛋白，其參與應(yīng)激受損蛋白的拯救以及受損蛋白的降解。GrpE在調(diào)節(jié)大腸桿菌應(yīng)激基因的表達(dá)中發(fā)揮作用。
Hsp10的例子包括GroES和Cpn10。Hsp10發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌以及真核細(xì)胞的線粒體和葉綠體中。Hsp10與Hsp60寡聚體結(jié)合形成7元環(huán)。Hsp10也參與蛋白折疊。
已發(fā)現(xiàn)遍在蛋白結(jié)合蛋白，這與通過(guò)ATP依賴(lài)的胞質(zhì)蛋白酶來(lái)蛋白水解去除蛋白協(xié)調(diào)一致。
本發(fā)明中有用的應(yīng)激蛋白可從腸桿菌(如大腸桿菌)、分枝桿菌(尤其是麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、母牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)和牛分枝桿菌)、酵母、果蠅、脊椎動(dòng)物(如鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳動(dòng)物如嚙齒類(lèi)或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物包括人類(lèi))中獲得。
蛋白表達(dá)和純化可重組生產(chǎn)蛋白。更具體而言，可被單獨(dú)使用或組合或共軛之后施用的hsp(或其片段)和HPV抗原(或其片段)以及含有組分(1)和組分(2)的融合蛋白都能在細(xì)菌、酵母、植物或植物細(xì)胞、或動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞中重組生產(chǎn)。例如，hsp、HPV抗原以及含有它們的融合蛋白可用合適的表達(dá)載體中的核酸序列轉(zhuǎn)化(即轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染)宿主細(xì)胞來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)。合適的表達(dá)載體包括質(zhì)粒、病毒顆粒以及噬菌體。對(duì)于昆蟲(chóng)細(xì)胞，桿狀病毒表達(dá)載體是合適的。完整的表達(dá)載體或其部分都可被整合到宿主細(xì)胞基因組中。在一些情形中，理想的是采用誘導(dǎo)型表達(dá)載體例如LACSWITCH誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)(Stratagene；LaJolla，CA)。
分子生物領(lǐng)域中的那些專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員將理解各種表達(dá)系統(tǒng)的任一種都可提供重組蛋白使用(如融合蛋白)，所述重組蛋白在本文所述的方法中是有用的。所用的明確的宿主細(xì)胞和載體對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)無(wú)關(guān)緊要。
如上所述，組分(1)、組分(2)和含有它們的融合蛋白可通過(guò)植物細(xì)胞生產(chǎn)。對(duì)于植物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒和煙草花葉病毒)和質(zhì)粒表達(dá)載體(如Ti質(zhì)粒)是合適的。這些細(xì)胞可從廣范圍的來(lái)源(如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA；也可參見(jiàn)，例如Ausubel等，Current Protocols inMoleucular Biology，John Wiley & Sons，New York，1994)中獲得。轉(zhuǎn)化方法和表達(dá)載體的選擇將取決于所選擇的宿主系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化方法在例如Ausubel(同上)中描述。表達(dá)載體可從在例如Pouwels等，CloningVectorsA Laboratory Manual，1985，增刊，1987中所提供的那些載體中挑選。
內(nèi)含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞可培養(yǎng)在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基按需要適合于選擇基因的激活或阻遏、轉(zhuǎn)化子的篩選或選擇基因的擴(kuò)增。
如果合適或有益，編碼融合蛋白的核酸可包括分泌融合蛋白的信號(hào)序列以便例如促進(jìn)蛋白從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離。特定的起始信號(hào)對(duì)有效翻譯插入的核酸序列也是需要的。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和鄰近序列。在一些情況下，必須提供外源的翻譯控制信號(hào)，也許包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子必須與所需編碼序列的讀框協(xié)調(diào)以確保完整插入子的翻譯。這些外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可屬于多種起源，無(wú)論是天然還是合成的。表達(dá)效率可通過(guò)包括合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯增強(qiáng)子元件來(lái)提高(如在Bittner等，Methods in Enzymol.153516，1987中公開(kāi)的元件)。
組分(1)、組分(2)和含有它們的融合蛋白在正常生理?xiàng)l件下是可溶的。此外，這些融合蛋白可包括一種或多種不相關(guān)(即非hsp非HPV)蛋白(全部或部分)從而創(chuàng)造出至少三聯(lián)融合蛋白?！暗谌钡鞍卓梢允谴龠M(jìn)融合蛋白純化、檢測(cè)或增溶的蛋白或是提供一些其他功能的蛋白。例如，表達(dá)載體pUR278(Ruther等，EMBO J.21791，1983)可用于創(chuàng)建lacZ融合蛋白，以及pGEX載體可用于表達(dá)外源多肽作為含有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，這些融合蛋白是可溶的，并能從溶解細(xì)胞中容易地純化，其方法是吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠上，接著在游離谷胱甘肽存在下進(jìn)行洗脫。pGEX載體設(shè)計(jì)成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位點(diǎn)，以便克隆的靶基因產(chǎn)物能從GST部分釋放?！暗谌钡鞍滓部梢允敲庖咔虻鞍譌c結(jié)構(gòu)域。利用親和柱可容易純化此種融合蛋白。當(dāng)然，本發(fā)明方法中所用的融合蛋白可包括一種以上的組分(1)和/或一種以上的組分(2)，以及組分(1)和組分(2)能直接或間接連接(如一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可存在于它們當(dāng)中)。
蛋白(如hsp、HPV抗原或含有hsp的融合蛋白)純化的方法可利用與該蛋白特異結(jié)合的抗體。本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員可采用基于親和的純化方法來(lái)純化蛋白。例如，對(duì)于人細(xì)胞系中表達(dá)的非變性融合蛋白的純化，參見(jiàn)Janknecht等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.888972，1981。在該系統(tǒng)中，將目的基因亞克隆到牛痘重組質(zhì)粒中，以便將基因的可讀框翻譯性地融合到由6個(gè)組氨酸殘基組成的氨基端標(biāo)志上。將用重組痘苗病毒感染的細(xì)胞的抽提物裝載到Ni2+氮川乙酸瓊脂糖柱上，并用含有咪唑的緩沖液選擇性洗脫組氨酸標(biāo)志的蛋白。同樣程序可用于細(xì)菌培養(yǎng)物。
蛋白包括融合蛋白(尤其是那些含有短抗原片段的蛋白)也可通過(guò)化學(xué)合成法(如在Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984 ThePierce Chemical Co.，Rockford，IL中所述的方法)來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)。
一旦分離，如果需要，蛋白可進(jìn)一步純化和/或濃縮，只要進(jìn)一步處理不損傷引發(fā)免疫反應(yīng)的能力，所述免疫反應(yīng)在本發(fā)明方法中足以有效。純化和濃縮蛋白的多種方法是本領(lǐng)域中眾所周知的(參見(jiàn)，例如Fisher，Laboratory Techniques In Biochemistry And MolecularBiology，Work和Burdon編，Elsevier，1980)，包括超速離心和/或沉淀(如采用硫酸銨)、微濾(如通過(guò)0.45μm醋酸纖維素濾膜)、超濾(如使用篩分膜和再循環(huán)過(guò)濾)、凝膠過(guò)濾(如填充有Sepharose CL-6B、CL-4B、CL-2B、6B、4B或2B、Sephacryl S-400或S-300、Superose6或Ultrogel A2、A4或A6的柱；全部獲自Pharmacia公司)、快速蛋白液相色譜(FPLC)以及高效液相色譜(HPLC)。
交叉反應(yīng)性HPV序列本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可確定含有第一類(lèi)型的HPV抗原的組合物能否用于治療已有第二類(lèi)型的HPV感染的個(gè)體。這種確定可依據(jù)的測(cè)定包括預(yù)測(cè)性測(cè)定(如那些采用計(jì)算機(jī)模型的測(cè)定)和生物學(xué)測(cè)定(其中有一個(gè)測(cè)定真正測(cè)定交叉反應(yīng)性)?？刹捎靡环N或兩種測(cè)定(毫不奇怪，人們將希望在預(yù)測(cè)性測(cè)定中所獲得的結(jié)果有待于在生物學(xué)測(cè)定中進(jìn)一步測(cè)試)。各個(gè)例子如下。
利用成熟的免疫學(xué)方法人們可測(cè)試交叉反應(yīng)性(即測(cè)試含有一種類(lèi)型的HPV抗原的組合物有效地治療個(gè)體的能力，所述個(gè)體是由另一類(lèi)型的HPV感染的個(gè)體或患有與另一類(lèi)型的HPV相關(guān)的疾病或癥狀的個(gè)體)。例如，使用改造的雙重轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人第I型MHC分子和人CD8基因的抗原結(jié)合區(qū)(Lustgarten等，Human Immunol.52109，1997；Vitiello等，J.Exp.Med.1731007，1991)可證實(shí)免疫交叉反應(yīng)性。
更具體而言，利用標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)(參見(jiàn)，例如Coligan等編，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，1999)，HLA-A2/CD8雙重轉(zhuǎn)基因小鼠(Lustgarten等，同上)可用來(lái)證明胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的交叉反應(yīng)性，所述CTL是針對(duì)抗從HPV6和11的E7蛋白衍生的肽產(chǎn)生HPV16E7而出現(xiàn)的。簡(jiǎn)而言之，小鼠用HspE7融合蛋白(基于BCG Hsp65和HPV16E7分子)每隔7-21天免疫1-3次。將HspE7懸浮于磷酸緩沖的鹽水(PBS)中，并以每只小鼠皮下施用范圍從1μg到1000μg的劑量。最后施用HspE7之后7天，將小鼠處死，去除它們的脾臟，并將組織離解成單個(gè)細(xì)胞懸浮液。特異于HPV E7的CTL細(xì)胞通過(guò)將衍生自HPV16E7、HPV6E7和HPV11E7的HLA-A2結(jié)合肽加入到濃度為1μM的培養(yǎng)基中而得到再刺激。細(xì)胞可在例如6孔板中受到再刺激，所述6孔板在其各孔中有不同的肽。如計(jì)算機(jī)算法所規(guī)定，與HLA-A2結(jié)合親和性預(yù)測(cè)最高的一些肽(如十個(gè)肽)都可用于各個(gè)HPV16、HPV6和HPV11(或任何其他HPV類(lèi)型；參見(jiàn)Parker等，J.Immunol.152163，1994；算法也可通過(guò)全國(guó)衛(wèi)生研究所(National Institutes of Health)的BIMAS(生物信息學(xué)&分子分析部門(mén)(Bioinformatics & Molecular Analysis Section))網(wǎng)址(2001年6月26日存取在http//bimas.dcrt.nih.gov/上)從因特網(wǎng)上獲得。此外，如果不同，來(lái)自其他兩個(gè)HPV基因型的相應(yīng)肽也可使用(即HPV16E7肽11-20和HPV6和11肽11-20)。
在體外再刺激周期(如一周)之后，通過(guò)用衍生自HPV16E7、HPV6E7和HPV11E7的HLA-A2結(jié)合肽脈沖溶解的T2靶細(xì)胞將可測(cè)定CTL活性。此外，利用前述的方法(Asal等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7145，2000)，通過(guò)ELISPOT分析IFN-γ分泌細(xì)胞，可測(cè)定抗原特異的T淋巴細(xì)胞識(shí)別衍生自HPV16E7、HPV6E7和HPV11E7的HLA-A2結(jié)合肽。這些分析可在其他HLA等位基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行。
或者，人們可測(cè)定CTL與衍生自人HLA-A2陽(yáng)性個(gè)體中的HPV6或11E7蛋白的肽交叉反應(yīng)的能力，所述CTL是由用HspE7免疫所誘導(dǎo)的，所述人HLA-A2陽(yáng)性個(gè)體經(jīng)受用HspE7治療生殖器疣。在治療之前和各用HspE7治療之后若干天(如7天)，可將外周血單核細(xì)胞(PBMC)從個(gè)體(如病人)中分離出來(lái)。細(xì)胞的分析方法可通過(guò)產(chǎn)生熒光的MHC-肽復(fù)合物(四聚體，Altman等，Science 27494，1996)或通過(guò)ELISPOT分析法(Asal等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7145，2000)進(jìn)行。細(xì)胞可從外周血中直接進(jìn)行測(cè)定以及如Youde等(CancerRes.60365，2000)所述在體外接著再刺激。對(duì)于體外再刺激，將2×106/ml的PBMC培養(yǎng)在含有10％人AB血清(RAB)和濃度為10μg/ml肽的RPMI1640中。再刺激肽就自HPV16 E7衍生出來(lái)，并包含預(yù)示HLA-A2結(jié)合親和性最高的肽(如十個(gè)肽)，如通過(guò)計(jì)算機(jī)算法所規(guī)定(Parker等，同上)。第4天，將1ml含有25單位/ml的IL-2的RAB加入到各個(gè)孔中。第6天，把1ml培養(yǎng)基用1ml含有10單位/ml的IL-2的培養(yǎng)基替換。第7天，將被輻射的自體PBMC(新鮮或凍融的)重懸浮于3×106個(gè)細(xì)胞/ml的含有10μg/ml肽和3μg/ml β2微球蛋白的RAB中?？乖蔬f細(xì)胞允許附著2小時(shí)，然后洗滌以去除非粘著性細(xì)胞，再加入1-2×106個(gè)效應(yīng)細(xì)胞/ml。第9天，將1ml的含有25單位/ml的IL-2的RAB加入到各個(gè)孔中。第13天，將孔中的內(nèi)含物分到多個(gè)板中，并把培養(yǎng)基(含有10單位/ml的IL-2)恢復(fù)到原始體積。第14天使用細(xì)胞。對(duì)于FACS分析，四聚體的制備如前所述(Altman等，Science 27494，1996)。用于裝載四聚體的肽是衍生自HPV16、HPV6和HPV11的E7分子的HLA-2結(jié)合肽。如計(jì)算機(jī)算法所規(guī)定(Parker等，同上)，HLA-A2結(jié)合親和性預(yù)測(cè)最高的肽(如十個(gè)肽)可用于各個(gè)HPV16、HPV6和HPV11中。此外，如果不同，來(lái)自其他兩個(gè)HPV基因型的對(duì)應(yīng)的肽也可使用(即HPV16 E7肽11-20和HPV6和11肽11-20)。新鮮的或再刺激的PBMC用PE標(biāo)記的HPV-E7肽四聚體和FITC標(biāo)記的抗-CD8抗體染色，并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，正如上文已述。利用前述方法(Asal等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7145，2000)對(duì)識(shí)別HLA-A2結(jié)合肽的抗原特異的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT分析，所述HLA-A2結(jié)合肽衍生自HPV16 E7、HPV6 E7和HPV11 E7，存在于新鮮和再刺激的PBMC中。同樣，這些技術(shù)可適用于具有其他HLA單元型的個(gè)體。
此外，有可能用HspE7蛋白或衍生自第16E7型HPV的肽體外刺激后的人PBMC與脈沖細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試人PBMC能力，采用來(lái)自以前未用HspE7治療的HLA-A2陽(yáng)性健康志愿者的人PBMC，所述脈沖細(xì)胞是用來(lái)自其他兩個(gè)HPV基因型(6和11)所對(duì)應(yīng)的肽脈沖。使用本領(lǐng)域普通程序，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激和分析。簡(jiǎn)而言之，PBMC從外周血中分離，粘著性細(xì)胞與非粘著性細(xì)胞分開(kāi)，以及粘著性細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后生成樹(shù)突細(xì)胞(DC)，正如在Current Protocols in Immunology(Coligan等編，John Wiley & Sons，第7.32.7-8頁(yè)，1999)中所述。非粘著性細(xì)胞低溫儲(chǔ)藏在90％FCS/10％DMSO中以在測(cè)定后期備用。
對(duì)于刺激，DC用50μg/ml的HspE7或用40μg/ml的合適肽和3μg/mlβ2微球蛋白在37℃、5％CO2下脈沖24小時(shí)(Kawashima等，Human Immunol.591，1998)。所用的肽是衍生自HPV16、HPV6和HPV11的E7分子的HLA-A2結(jié)合肽。如計(jì)算機(jī)算法所定義(Parker等，同上)，HLA-A2結(jié)合親和性預(yù)測(cè)最高的肽(如十個(gè)肽)可用于各個(gè)HPV16、HPV6和HPV11中。此外，如果不同，來(lái)自其他兩個(gè)HPV基因型的對(duì)應(yīng)肽也可使用(即HPV16 E7肽11-20和HPV6和11肽11-20)。利用免疫磁珠(Miltenyi Biotec)通過(guò)陽(yáng)性篩選將CD8+細(xì)胞從低溫保藏的自體非粘著細(xì)胞中分離出來(lái)。裝載肽/蛋白的DC以4200拉德進(jìn)行輻射，并與自體CD8+細(xì)胞在例如48孔板中以1∶20的比例混合，所述48孔板在0.5ml的RAB中含有0.25×105個(gè)DC和5×105個(gè)CD8+細(xì)胞以及10ng/ml的IL-7。第7和14天，把細(xì)胞用自體肽脈沖的粘著APC再刺激(Kawashima等，Human Immunol.591，1998)。每2-3天向培養(yǎng)物中添加10單位/ml的hIL-2。在體外刺激7和14天之后，對(duì)HPV E7肽特異的T淋巴細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生熒光的MHC肽復(fù)合體(四聚體，Altman等，Science 27494，1996)或通過(guò)ELISPOT分析法(Asal等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7145，2000)進(jìn)行分析。對(duì)于FACS分析，四聚體的制備如前所述(Altman等，Science 27494，1996)。用于裝載四聚體的肽如上所述是衍生自HPV16、HPV6和HPV11的E7分子的HLA-2結(jié)合肽。肽特異的T淋巴細(xì)胞用PE標(biāo)記的HPV-E7肽四聚體和FITC標(biāo)記的抗-CD8抗體進(jìn)行染色，并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析(Youde等，Cancer Res.60365，2000)。利用前述方法(Asal等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7145，2000)對(duì)識(shí)別HLA-A2結(jié)合肽的抗原特異的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT分析，所述HLA-A2結(jié)合肽衍生自HPV16E7、HPV6 E7和HPV11 E7。同樣，這些技術(shù)可適用于具有其他HLA單元型的個(gè)體。
組合物的施用本發(fā)明包括的組合物含有至少一種HPV蛋白抗原(如HPV蛋白抗原(或其抗原片段)，HPV蛋白抗原與hsp(或其免疫刺激片段)混合或共軛或含有HPV蛋白抗原(或其抗原片段)與hsp(或其免疫刺激片段)的融合蛋白。任選地，可將這些蛋白懸浮于可藥用載體，如稀釋劑(如PBS)或碳酸氫鹽溶液(如0.24M NaHCO3)。根據(jù)施用的方式和路徑以及標(biāo)準(zhǔn)制藥準(zhǔn)則選擇有用的載體。對(duì)應(yīng)用合適的藥物載體和稀釋劑以及藥物必需品描述在Remington’s PharmaceuticalSciences中。佐劑如霍亂毒素、大腸桿菌熱不穩(wěn)定的腸毒素(LT)、脂質(zhì)體或免疫刺激復(fù)合體(ISCOM)也可包括在內(nèi)。
蛋白(如融合蛋白)無(wú)需給個(gè)體直接施用。相反，編碼該蛋白的核酸序列可施用；所述蛋白在個(gè)體體內(nèi)表達(dá)。所述核酸可以是載體的部分(如病毒載體，例如病毒載體基因組的部分)或密封在例如脂質(zhì)體中?；蛘?，所述核酸可作為裸體核酸被傳遞。
組合物可制成溶液、懸浮液、栓劑、片劑、顆粒、粉末、膠囊、藥膏或面霜。如上所述，在制備這些組合物中，可包括一個(gè)或多個(gè)藥物載體。可藥用載體或其他添加劑另外的例子包括溶劑(如水或生理鹽水)、增溶劑(如乙醇、聚山梨酸酯或Cremophor EL)、提供等滲性的藥劑、防腐劑、抗氧化劑、賦形劑(如乳糖、淀粉、晶體纖維素、甘露糖、麥芽糖、磷酸氫鈣、輕質(zhì)硅酸酐或碳酸鈣)、接頭(淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥基丙基纖維素、乙基纖維素、羧基甲基纖維素或阿拉伯膠)、潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂、滑石粉或硬化油)或穩(wěn)定劑(如乳糖、甘露糖、麥芽糖、聚山梨酸酯、大粒凝膠或聚氧化乙烯固化的蓖麻油)。如果必須(或所需)，可加入甘油、二甲基乙酰胺、乳酸鈉、表面活性劑、氫氧化鈉、乙二胺、乙醇胺、碳酸氫鈉、精氨酸、甲葡胺或三氨基甲烷。如果需要緩釋組合物，可用生物可降解的聚合體如聚-D，L-丙交酯-共聚-乙交酯或聚乙交酯作填充基質(zhì)(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,417,986、4,675,381和4,450,150)。采用這些組分可制成藥物制劑如溶液、片劑、顆?；蚰z囊。如果組合物是口服，可加入調(diào)味劑和顏料。
治療性組合物的施用可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)穆窂竭M(jìn)行例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、局部、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、口服、皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、舌下、表皮內(nèi)、鼻腔、肺內(nèi)(如通過(guò)吸入)、陰道或直腸。
所施用的組合物的量將取決于例如特定的組合物、佐劑是否與組合物共施用、共施用佐劑的類(lèi)型、施用方式和頻率以及所需的效果(如預(yù)防或治療)。劑量通常由那些本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員在開(kāi)發(fā)藥物或預(yù)防劑的過(guò)程中確定。一般而言，本發(fā)明組合物的施用劑量范圍是每個(gè)成年人1μg-100mg。如果佐劑與組合物一起施用，則一般可采用的劑量范圍是每成年人1ng-1mg。如必須可反復(fù)施用，如由本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所確定。例如，初始劑量之后可接著三次加強(qiáng)劑量，每次間隔一周或一個(gè)月。加強(qiáng)注射可在第一次施用后的3-12周進(jìn)行，以及第二次加強(qiáng)使用相同制劑再于3-12周后進(jìn)行。血清或T細(xì)胞可從測(cè)試免疫反應(yīng)的個(gè)體中采集，所述免疫反應(yīng)是由抗HPV抗原的組合物引發(fā)，抗包括在例如融合蛋白或蛋白共軛物中的HPV抗原。測(cè)定抗特異抗原的抗體或胞毒T細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。如需要進(jìn)行另外的加強(qiáng)。依據(jù)例如組合物中融合蛋白的量的變化，免疫方案可使引發(fā)最大的免疫反應(yīng)最佳化。
當(dāng)然，本文所述的蛋白可通過(guò)施用核酸如病毒載體(如反轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體)來(lái)傳遞。
無(wú)需進(jìn)一步詳述，相信本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員依據(jù)以上公開(kāi)和以下實(shí)施例，可最大程度地利用本發(fā)明。下列實(shí)施例僅作為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員如何分離和利用融合多肽的說(shuō)明來(lái)解釋?zhuān)⒎鞘且匀魏畏绞絹?lái)限制本公開(kāi)的剩余部分。
實(shí)施例如在WO 99/07860中所述，通過(guò)重組生產(chǎn)含有與第16型HPV的E7蛋白偶聯(lián)的牛分枝桿菌BCG Hsp65的融合多肽，并將其制成制劑。Hsp65是應(yīng)激蛋白的Hsp60家族的成員。在人臨床試驗(yàn)測(cè)試此融合多肽在治療肛門(mén)高級(jí)鱗狀上皮內(nèi)損傷(HSIL)的功效的過(guò)程中，進(jìn)行了下列觀察。
在治療肛門(mén)HSIL中，22個(gè)患者參與了隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的HspE7的多通道試驗(yàn)。合格患者通過(guò)活檢已確認(rèn)了肛門(mén)HSIL，并且是人免疫缺陷病毒(HIV)陰性。利用從肛門(mén)棉拭中獲得的細(xì)胞對(duì)患者的HPV進(jìn)行定型，但病人不要求患有HPV-16。個(gè)別損傷不被定型為HPV?；颊呓邮苋?00μg的HpsE7或安慰劑的皮下注射，每次間隔一個(gè)月。通過(guò)肛門(mén)巴氏涂片、帶有活檢的高分辨肛鏡(HRA)以及全科醫(yī)師評(píng)估，對(duì)他們的治療反應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。非反應(yīng)者(即那些患有持久肛門(mén)HSIL的患者)在對(duì)照試驗(yàn)中12或24周之后，允許跨接到公開(kāi)標(biāo)記的試驗(yàn)中，其中他們接受三次500μg的HspE7注射，每次間隔一個(gè)月。在安慰劑對(duì)照試驗(yàn)中治療分配是雙盲的，并且盲區(qū)一直未被打開(kāi)。
為了確定感染患者的HPV類(lèi)型，僅在活檢之前，在隨機(jī)的安慰劑對(duì)照試驗(yàn)的篩選拜訪處，用達(dá)可綸棉拭從患者的肛門(mén)中采集樣品。在樣品運(yùn)送培養(yǎng)基(Sample Transport Medium)(Digene)中運(yùn)送之后，分離DNA并用于測(cè)定HPV類(lèi)型。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)將共有序列引物組MY09/MY11用于擴(kuò)增HPV DNA。在擴(kuò)增步驟后，把樣品印跡到尼龍膜上并用生物素標(biāo)記的寡核苷酸以探針進(jìn)行探查，所述寡核苷酸特異于29種不同的HPV類(lèi)型(6、11、16、18、26、31、32、33、35、39、40、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、66、68、69、70、73、AE2、Pap155以及Pap291)，以及收集的探針含有10種HPV類(lèi)型的引物(2、13、34、42、57、62、64、67、72和W13B)。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)照比較，使用5點(diǎn)等級(jí)，將產(chǎn)生斑點(diǎn)印跡的樣品對(duì)HPV類(lèi)型計(jì)算分值為陽(yáng)性或陰性；分值是1或大于1的是陽(yáng)性。
為了證實(shí)PCR是成功的，對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行β-球蛋白對(duì)照擴(kuò)增以及探針檢測(cè)。如果樣品對(duì)β-球蛋白的存在不是陽(yáng)性，則認(rèn)為PCR步驟是技術(shù)失敗的。如果共有探針不導(dǎo)致分值2或更多，則認(rèn)為樣品是“HPV陰性”。
在他們進(jìn)入公開(kāi)標(biāo)記試驗(yàn)中的時(shí)，22個(gè)患者中的14個(gè)(64％)患有生殖器疣，所述疣一直持續(xù)在以前的雙盲試驗(yàn)全程中，在所述試驗(yàn)中，他們接受三次100μg的HspE7或安慰劑的注射，每月一次。在這14個(gè)患者至跨接到公開(kāi)標(biāo)記的試驗(yàn)中時(shí)，其中8個(gè)患者(57％)已經(jīng)惡化，4個(gè)患者(29％)無(wú)變化，以及2個(gè)患者(14％)有改善(一個(gè)顯著改善而另一個(gè)最低程度地改善)。另有一患者在雙盲試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)患有濕疣，所述濕疣在公開(kāi)標(biāo)記的試驗(yàn)開(kāi)始之前消除了，因此從此分析中刪除，如同其他7個(gè)患者在任何試驗(yàn)過(guò)程中未患有可檢測(cè)的疣一樣。在全部14個(gè)患者(100％)中，濕疣存在于肛門(mén)直腸道內(nèi)，以及其中還有6個(gè)患者(43％)存在于肛門(mén)周?chē)钠つw上。在公開(kāi)標(biāo)記的試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查員確定14個(gè)帶疣的患者中有11個(gè)患者(79％)需要手術(shù)切除，有2個(gè)患者(14％)需要局部切除(如液氮、電烙術(shù))以及有1個(gè)患者(7％)需要局部治療(即imiquimod)。這些患者選擇推遲現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查員推薦的治療，而非同意在公開(kāi)標(biāo)記的試驗(yàn)中接受三次500μg的HspE7的注射，每次間隔一個(gè)月。
在最終用500μg的HspE7治療后一個(gè)月，有2個(gè)患者(14％)沒(méi)有可檢測(cè)的疣，有11個(gè)患者(79％)在疣的大小和數(shù)目上下降，如與他們剛開(kāi)始進(jìn)入公開(kāi)標(biāo)記的試驗(yàn)比較，以及有1個(gè)患者(7％)發(fā)現(xiàn)疣體積增大(表1)。至公開(kāi)標(biāo)記試驗(yàn)的主要評(píng)價(jià)點(diǎn)的時(shí)候(最終劑量后4個(gè)月)，另有一個(gè)患者發(fā)現(xiàn)改善從部分到完全反應(yīng)(即沒(méi)有可見(jiàn)的疣)，從而產(chǎn)生總共3個(gè)患者(21％)完全痊愈(表1)。這些痊愈者在公開(kāi)標(biāo)記試驗(yàn)中6個(gè)月的評(píng)價(jià)過(guò)程中沒(méi)有一個(gè)復(fù)發(fā)。10個(gè)患者(71％)繼續(xù)表現(xiàn)出部分反應(yīng)(即疣在大小上進(jìn)一步顯著縮小，去除剩余的疣而需要的治療程度持續(xù)減少)。至公開(kāi)標(biāo)記試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，仍有1個(gè)非反應(yīng)者(7％)沒(méi)有改善。
表1用HspE7治療后對(duì)生殖器疣的反應(yīng)總結(jié)患者數(shù)(％)第12周*第24周+結(jié)果 (n＝14) (n＝14)完全反應(yīng)者 2(14) 3(21)部分反應(yīng)者 11(79) 10(71)非反應(yīng)者 1(7)1(7)*用500μg的HspE7最終治療后一個(gè)月。
+用500μg的HspE7最終治療后四個(gè)月。
在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查員對(duì)3個(gè)完全反應(yīng)者沒(méi)有推薦進(jìn)一步治療。如表2所列，現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查員建議對(duì)部分反應(yīng)者的治療是切除療法(14個(gè)中有6個(gè)，43％)或用局部藥劑治療(14個(gè)中有4個(gè)，29％)；對(duì)非反應(yīng)者建議另外的手術(shù)(14個(gè)中有1個(gè)，7％)。為了長(zhǎng)期隨訪他們的反應(yīng)，全部22個(gè)患者辦理了注冊(cè)協(xié)議，并且他們同意推遲調(diào)查員建議的治療。
表2生殖器疣反應(yīng)評(píng)價(jià)以及臨床大夫推薦的治療基線*第12周+第24周※患者編號(hào)推薦的治療疣反應(yīng) 推薦的治療疣反應(yīng) 推薦的治療003 手術(shù) CR 局部 CR 無(wú)004 手術(shù) PR 切除 PR 切除005 局部 PR 局部 CR 無(wú)006 手術(shù) PR 手術(shù) PR 切除008 切除 PR 局部 PR 局部009 手術(shù) PR 切除 PR 局部010 手術(shù) PR 切除 PR 切除011 手術(shù) CR 局部 CR 無(wú)014 手術(shù) PR 局部 PR 局部016 手術(shù) 惡化 手術(shù) 惡化 手術(shù)017 切除 PR 局部 PR 局部020 手術(shù) PR 切除 PR 切除021 手術(shù) PR 切除 PR 切除022 手術(shù) PR 切除 PR 切除
*基線指公開(kāi)標(biāo)記試驗(yàn)的開(kāi)始。
+用500μg的HspE7最終治療后一個(gè)月。
※用500μg的HspE7最終治療后四個(gè)月。
縮寫(xiě)CR＝完全反應(yīng)；PR＝部分反應(yīng)對(duì)第一次隨機(jī)對(duì)照的試驗(yàn)進(jìn)行篩選的過(guò)程中，所有14個(gè)診斷有生殖器疣的患者的肛門(mén)棉拭樣品都檢測(cè)到了多種HPV類(lèi)型的HPVDNA(表3)。HPV-6和/或11存在于12個(gè)患者中(86％)。一患者僅有HPV-16及相關(guān)類(lèi)型，而另一個(gè)患者不能定型。14個(gè)患者中有3個(gè)(21％)是HPV-16陽(yáng)性的。其疣改善的大多數(shù)患者(13個(gè)中有11個(gè)，85％)沒(méi)有HPV-16。非反應(yīng)者也沒(méi)有HPV-16(參見(jiàn)表3)。
表3患有生殖器疣的患者中的HPV類(lèi)型患者編號(hào) 篩選時(shí)肛門(mén)棉拭樣品中的 第24周+時(shí)的疣反應(yīng)HPV類(lèi)型*003 6、11、16 CR004 6、54 PR005 6、70 CR006 6、11、45 PR008 16、31、55 PR009 6、11、59 PR010 6、11、45、54 PR011 HPV陽(yáng)性，類(lèi)型未知 CR014 6、11 PR016 11、61 惡化017 HPV陰性PR020 6、11、16 PR021 6、31、53、58、59、61、66 PR022 6 PR*隨機(jī)安慰劑對(duì)照的臨床試驗(yàn)的篩選探訪。
+用500μg的HspE7最終治療后一個(gè)月。
縮寫(xiě)HPV＝人乳頭狀瘤病毒；CR＝完全反應(yīng)；PR＝部分反應(yīng)在這種HspE7的公開(kāi)標(biāo)記的跨接試驗(yàn)中(500μg 3次，每次間隔一個(gè)月)，涉及持久的肛門(mén)HSIL和伴隨的生殖器疣的患者，在基線處有疣的14個(gè)患者中有3個(gè)(17％)在最終劑量后四個(gè)月不再患有疣。另有10個(gè)患者(71％)表現(xiàn)出癥狀改善(即疣的大小顯著縮小，以及去除剩余疣所需的治療程度持續(xù)減少)。一個(gè)患者(7％)在試驗(yàn)過(guò)程中未改善，因此額外的手術(shù)由現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查員推薦。
在公開(kāi)標(biāo)記試驗(yàn)注冊(cè)之前，此試驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)的大多數(shù)患者也許將遭受手術(shù)介入以去除疣(14個(gè)患者中有11個(gè)，79％)。至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，僅有1個(gè)患者推薦手術(shù)治療。局部切除療法(如液氮、電烙)推薦給6個(gè)患者(43％)，而采用局部藥劑(如imiquimod)治療推薦給4個(gè)患者(29％)。有3個(gè)患者不需進(jìn)一步治療。
反應(yīng)在6個(gè)月期間似乎是進(jìn)行性的，沒(méi)有反應(yīng)者在此期間復(fù)發(fā)。濕疣逐漸和進(jìn)行性的消散與由HspE7誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫之后人們從免疫的宿主反應(yīng)中所預(yù)期到的相一致。
在進(jìn)入公開(kāi)標(biāo)記試驗(yàn)之前，雙盲試驗(yàn)中2個(gè)患者他們的濕疣有一些改善。迄今為止，我們沒(méi)有打開(kāi)盲區(qū)，并不知道這些患者是否接受了100μg的HspE7或安慰劑。然而，根據(jù)每月一次共三次注射500μg的HspE7的公開(kāi)標(biāo)記試驗(yàn)所觀察到的反應(yīng)，較高的劑量似乎比100μg更有活性。
從13個(gè)患者中僅有3個(gè)(23％)的肛門(mén)棉拭樣品檢測(cè)出HPV-16DNA，這3個(gè)患者的疣在用HspE7治療后有改善。在其疣對(duì)用HspE7治療有反應(yīng)的大多數(shù)患者中可檢測(cè)出來(lái)自HPV-6、HPV-11的DNA或兩者皆有之。這些數(shù)據(jù)暗示在它們對(duì)HspE7的反應(yīng)中存在這些HPV類(lèi)型之間的免疫交叉反應(yīng)性。
總之，此處提供的結(jié)果暗示HspE7對(duì)生殖器疣有廣譜的活性。該活性似乎不限于HPV-16陽(yáng)性患者，而交叉多種類(lèi)型的HPV。預(yù)測(cè)HspE7在治療生殖器區(qū)域的HPV誘導(dǎo)的疾病將是有效的，以及預(yù)測(cè)該活性將不限于HPV-16陽(yáng)性患者。
此處的觀察報(bào)告暗示用HspE7的治療性處理可組成新的、簡(jiǎn)單的以及非手術(shù)治療生殖器疣的方法，該治療方法最低程度將減輕疣的負(fù)擔(dān)，由此減少治療程度和所得的發(fā)病率。內(nèi)在肛門(mén)直腸疾病常要求另外的治療，所述治療十分痛苦并讓人衰弱。任何治療甚至僅提供部分反應(yīng)減少或消除“手術(shù)”或切除療法的數(shù)量和程度，轉(zhuǎn)化成發(fā)病率的減少、工作時(shí)間損失更少以及生活質(zhì)量的提高。
這些經(jīng)過(guò)說(shuō)明熱激蛋白/第16型HPV抗原組合物在消除或減少疣中的是有效的，所述疣被認(rèn)為主要由第6和11型HPV所導(dǎo)致。有顯著意義的是觀察到(1)疣可用基于HPV的組合物根本上治療，和(2)第16型HPV組合物在治療推測(cè)是除第16型以外的HPV所導(dǎo)致的癥狀中是有效的。后者的交叉反應(yīng)性結(jié)果完全未預(yù)料到，假定一般認(rèn)為類(lèi)型特異的組合物僅能引起類(lèi)型特異的免疫反應(yīng)。
為了對(duì)所觀察到的融合多肽的交叉反應(yīng)性闡明可能的機(jī)制，對(duì)各種I型HLA分子和第16、6和11類(lèi)型HPV的E7肽的理論結(jié)合進(jìn)行了計(jì)算。T1/2解離的計(jì)算利用了在Parker等，J.Immunol.152163，1994中(也參見(jiàn)以上所述的網(wǎng)址)所述的算法。數(shù)據(jù)總結(jié)于表4中。
表4
粗體的肽序列顯示各個(gè)HLA分子頂端的兩個(gè)接頭以及各個(gè)來(lái)自各個(gè)類(lèi)型HPV的E7蛋白頂端的兩個(gè)接頭。表4中的結(jié)果暗示取決于所檢查的特異HLA分子，第16E7型HPV抗原可引發(fā)抗其他類(lèi)型HPV的E7抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。例如，對(duì)于HLA B 2705來(lái)說(shuō)，從所有3種類(lèi)型HPV的E7第76位氨基酸位置開(kāi)始的肽預(yù)測(cè)是高水平的結(jié)合。因此，對(duì)于表達(dá)這種HLA分子的患者來(lái)說(shuō)可能的是第16E7型HPV組合物將是交叉反應(yīng)性的并用于治療或預(yù)防由第6和11類(lèi)型HPV的感染。表4中的各個(gè)粗體肽片段代表可能的抗原片段，其可包括在組合物(如本文所述的融合多肽)中作為替換全部E7病毒抗原。當(dāng)然，也可使用兩個(gè)或多個(gè)這種公認(rèn)的HLA表位或含有這些公認(rèn)HLA表位的長(zhǎng)片段。
權(quán)利要求
1.一種治療個(gè)體身上的疣的方法，所述方法包含識(shí)別出患有或懷疑患有疣的個(gè)體；以及給所述個(gè)體施用包含融合蛋白的組合物，所述融合蛋白包含(1)熱激蛋白(hsp)或其免疫刺激片段，和(2)人乳頭狀瘤病毒(HPV)的蛋白或其抗原片段，其中施用所述組合物的量足以治療所述疣。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述hsp是分枝桿菌(Mycobacterial)hsp。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述分枝桿菌hsp是牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)hsp。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述hsp是牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)Hsp65。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述hsp是Hsp60或Hsp70家族蛋白的成員
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HPV是第16型HPV。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HPV蛋白是E7蛋白。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物含有約50-5000μg的融合蛋白。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述組合物含有約100-2000μg的融合蛋白。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中施用的所述組合物不含佐劑。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白所施用的量足以縮小疣的大小。
14.一種治療個(gè)體所患的與人乳頭狀瘤病毒(HPV)相關(guān)的疾病或癥狀的方法，所述方法包含給個(gè)體施用包含融合蛋白的組合物，所述融合蛋白包含(1)hsp或其免疫刺激片段，以及(2)HPV的蛋白或其抗原片段，其中個(gè)體被一種與給個(gè)體施用的HPV類(lèi)型不同的HPV類(lèi)型感染，所述施用組合物的量足以治療疾病或癥狀。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述hsp是分枝桿菌(Mycobacterial)hsp。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述分枝桿菌hsp是牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)hsp。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述hsp是牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)Hsp65。
18.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述hsp是Hsp60或Hsp70家族蛋白的成員
19.權(quán)利要求14所述的方法，其中給個(gè)體施用的HPV類(lèi)型是第16型。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述個(gè)體患有與HPV的第5、6、11、18、31、33、35、45、54、60或70型相關(guān)的疾病或癥狀。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述個(gè)體患有與HPV的第6、11、33、45或70型相關(guān)的疾病或癥狀。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述個(gè)體患有與HPV第6或11型相關(guān)的疾病或癥狀。
23.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述HPV蛋白是E7蛋白。
24.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述組合物含有約50-5000g的融合蛋白。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述組合物含有約100-2000μg的融合蛋白。
26.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述組合物不含佐劑。
27.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
29.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述個(gè)體在施用組合物之前沒(méi)有被識(shí)別出受所施用的HPV類(lèi)型感染。
30.一種治療個(gè)體身上的疣的方法，所述方法包含識(shí)別出患有或懷疑患有疣的個(gè)體；給個(gè)體施用編碼融合多肽的核酸，所述融合多肽包含(1)hsp或其免疫刺激片段，和(2)HPV的蛋白或其抗原片段；以及在個(gè)體中表達(dá)融合多肽的量足以治療疣。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述核酸包含在病毒載體內(nèi)。
32.一種治療個(gè)體所患的與HPV感染相關(guān)的疾病或癥狀方法，所述方法包含給個(gè)體施用編碼融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含(1)hsp或其免疫刺激片段，和(2)HPV的蛋白，其中所述個(gè)體被一種與給個(gè)體施用的HPV類(lèi)型不同的HPV類(lèi)型感染；以及在個(gè)體中表達(dá)融合蛋白，使其量足以治療疾病或癥狀。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述核酸包含在病毒載體內(nèi)。
34.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述疾病或癥狀是生殖器疣、跖疣、宮頸癌、宮頸發(fā)育異常、肛門(mén)癌、肛門(mén)發(fā)育異?；驈?fù)發(fā)性呼吸乳頭狀瘤病。
35.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述疾病或癥狀是生殖器疣、跖疣、宮頸癌、宮頸發(fā)育異常、肛門(mén)癌、肛門(mén)發(fā)育異?；驈?fù)發(fā)性呼吸乳頭狀瘤病。
36.組合物在制造用于治療疣的藥物中的應(yīng)用，所述組合物包含(1)熱激蛋白或其免疫刺激片段，和(2)人乳頭狀瘤病毒的蛋白或其抗原片段。
37.組合物在制造用于治療第二類(lèi)型人乳頭狀瘤病毒感染的藥物中的應(yīng)用，所述組合物包含(1)熱激蛋白或其免疫刺激片段，和(2)第一類(lèi)型人乳頭狀瘤病毒的蛋白或其抗原片段，其中所述第一類(lèi)型和第二類(lèi)型是不同的。
38.編碼融合多肽的核酸在制造用于治療疣的藥物中的應(yīng)用，所述融合多肽包含(1)熱激蛋白或免疫刺激片段，和(2)人乳頭狀瘤病毒的蛋白或其抗原片段。
39.編碼融合多肽的核酸在制造用于治療第二類(lèi)型人乳頭狀瘤病毒感染的藥物中的應(yīng)用，所述融合多肽包含(1)熱激蛋白或其免疫刺激片段，和(2)第一類(lèi)型人乳頭狀瘤病毒的蛋白或其抗原片段，其中所述第一類(lèi)型和第二類(lèi)型是不同的。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)給個(gè)體施用組合物來(lái)治療個(gè)體中的疣的方法，所述組合物含有(1)熱激蛋白或其免疫刺激片段和(2)人乳頭狀瘤病毒蛋白或其抗原片段。本發(fā)明還公開(kāi)了通過(guò)給個(gè)體施用組合物來(lái)治療已感染或懷疑正被感染第一類(lèi)型人乳頭狀瘤病毒的個(gè)體所感染的人乳頭狀瘤病毒的方法，所述組合物含有(1)熱激蛋白或其抗原片段和(2)第二類(lèi)型人乳頭狀瘤病毒蛋白或其抗原片段，其中第一類(lèi)型和第二類(lèi)型不同。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1678344SQ01811772
公開(kāi)日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2001年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月26日
發(fā)明者約翰·尼夫, 斯蒂芬·戈德斯通, 馬克·溫尼特, 馬文·西格爾, 萊斯莉·布克斯 申請(qǐng)人:斯特雷斯根生物技術(shù)公司