專利名稱：雜交肽調(diào)制免役反應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景免役系統(tǒng)通過(guò)識(shí)別“外源”或“異?！苯Y(jié)構(gòu)作為抗原對(duì)外源病原體，腫瘤細(xì)胞，自身免役性疾病誘導(dǎo)的過(guò)程，變應(yīng)原，及移植體應(yīng)答。這些抗原大部分是蛋白質(zhì)，其可通過(guò)宿主細(xì)胞合成，或通過(guò)病原體合成。這種抗原可加工成(蛋白酶解)肽片段，其可在抗原呈遞細(xì)胞表面上的肽呈遞結(jié)構(gòu)中應(yīng)答免役系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞呈遞。這些肽呈遞結(jié)構(gòu)稱為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子。它們有這樣的名稱是由于它們首先被識(shí)別為在MHC基因座中的多態(tài)等位基因的產(chǎn)物，這些基因控制著鼠同系繁殖菌株中的移植體排斥。
為了區(qū)別從“非自身”分子衍生的肽及從“非自身”分子的衍生肽衍生的肽，動(dòng)物已經(jīng)發(fā)展出這種復(fù)合體方法以呈遞及識(shí)別抗原。本發(fā)明涉及在免疫應(yīng)答的第一步中使用這種基本過(guò)程的物質(zhì)和方法。本文還公開(kāi)了加強(qiáng)將所選取的抗原肽加入到某些MHC分子中作為免役系統(tǒng)疫苗的化合物和方法。這樣的疫苗將增強(qiáng)對(duì)抗外源侵入病原體，或腫瘤細(xì)胞的毒性反應(yīng)。使用本發(fā)明化合物的其他方法，也可用來(lái)增強(qiáng)對(duì)自身的識(shí)別作用，以控制自身免疫疾病，變應(yīng)性疾病，或移植體排斥。
對(duì)特異抗原的免疫應(yīng)答是由識(shí)別MHC分子中這些抗原肽片段的T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)。在抗原呈遞細(xì)胞(APC)中，蛋白酶解處理的抗原的肽片段結(jié)合在主要組織相容性復(fù)合體細(xì)胞(MHC)分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中。然后將這些肽-MHC復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面通過(guò)應(yīng)答T淋巴細(xì)胞上的T細(xì)胞受體來(lái)進(jìn)行識(shí)別作用(外源肽和呈遞MHC分子的鄰接表面)。這T淋巴細(xì)胞可以具有免疫調(diào)節(jié)功能(輔助或抑制免疫應(yīng)答)或效應(yīng)子功能(如通過(guò)細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答來(lái)清除病原體或腫瘤)?？乖?特異識(shí)別事件啟動(dòng)免疫應(yīng)答級(jí)聯(lián)，免疫應(yīng)答級(jí)聯(lián)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，或在自身免疫過(guò)程中，產(chǎn)生有害免疫應(yīng)答。
兩種類型的MHC分子作為T細(xì)胞的抗原肽的免疫系統(tǒng)呈遞者。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中在大約MHC I類分子合成時(shí)，MHC I類分子從內(nèi)源合成的蛋白質(zhì)接收肽，如傳染性病毒。在細(xì)胞表面MHC I類結(jié)合抗原肽呈遞給CD8-正性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，然后其被激活并能直接殺死表達(dá)病毒的細(xì)胞。相反，MHC II類分子是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的，它們的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)被不變鏈蛋白質(zhì)(Ii)阻斷。MHC II類分子和Ii蛋白質(zhì)的這些復(fù)合體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到后-Golgi區(qū)室，其中Ii由蛋白質(zhì)水解釋放，特異抗原肽與MHCII類分子結(jié)合(Blum等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA853975(1988)；Riberdy等人，自然360474(1992)；Daibata等人，Mol.Immunol.31255(1994)；Xu等人，Mol.Immunol.31723(1994)；Xu等人，Antigen Processing and Presentation，AcademicPress，NY p227(1994)；Kropshofer等人，科學(xué)2701357(1995)；Urban等人，J.Exp.Med.180751(1994))。
R.Humphreys(1996)美國(guó)專利No.5,559,028和Humphreys等人(1999)美國(guó)專利No.5,919,639揭示了Ii蛋白質(zhì)裂解的機(jī)理，在裂解過(guò)程中釋放出片段來(lái)調(diào)節(jié)MHC II類分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的抗原肽的結(jié)合和禁閉(Adams等人，Eur.J.Immunol.251693(1995)；Adams等人，Arzneim.Forsch./藥物研究471069(1997)；以及Xu等人，Arzneim.Forsch./Drug Research in Press(1999))。Ii蛋白質(zhì)的一個(gè)片段，Ii(77-92)，發(fā)現(xiàn)在抗原肽結(jié)合位點(diǎn)外接近保持抗原肽的N-末端的位點(diǎn)的末端的變構(gòu)象位點(diǎn)上起作用。并且，所引用的專利還公開(kāi)了通過(guò)三種類型的機(jī)理控制免疫應(yīng)答的這種起始調(diào)節(jié)的、抗原肽識(shí)別事件的新型治療化合物和方法。在第一種機(jī)理中，通過(guò)本發(fā)明的化合物的作用抗原肽從細(xì)胞表面MHC II類分子溢出。
在第二種機(jī)理中，本發(fā)明的化合物改善這些分子上的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合其他合成肽的荷電。這種插入肽序列可以是抗原表位或是仍然牢固結(jié)合以阻斷抗原肽結(jié)合位點(diǎn)的非抗原肽序列。第三種機(jī)理包括用調(diào)節(jié)應(yīng)答T淋巴細(xì)胞的分化和功能的方式，改變抗原肽從這些復(fù)合體的締合/解離速度，以及MHC分子/抗原肽/T細(xì)胞受體復(fù)合體的三分子組成的相互作用屬性，并且還改變?nèi)肿訌?fù)合體與輔助細(xì)胞-細(xì)胞相互作用分子的相互作用。
本發(fā)明揭示了令人驚異的發(fā)現(xiàn)，Ii-Key肽同系物與抗原肽的共價(jià)偶聯(lián)致使抗原表位的呈遞能力顯著增加。并且，核心間的接頭，Ii-Key肽的生物活性片段不需要是從Ii蛋白質(zhì)衍生的特別肽序列。由重復(fù)的亞甲基(CH2)基團(tuán)組成的柔性簡(jiǎn)單接頭就足夠了并且是優(yōu)選的。
本發(fā)明的化合物可以在不同種疾病和病況中用作為新型治療及診斷化合物。通過(guò)在起始調(diào)節(jié)時(shí)起作用，免疫應(yīng)答的抗原肽識(shí)別事件，這些化合物優(yōu)于具有不同毒性副作用的其他治療試劑。
本文公開(kāi)了在1)鑒別傳染性，惡性，自身免疫性及變應(yīng)性疾病和移植排斥中的應(yīng)用，2)為診斷的目的使用這樣的表位，3)為治療的目的使用這樣的表位。
本發(fā)明的簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及增強(qiáng)MHC II類抗原呈遞的雜交體多肽。雜交體包括N-末端和C-末端，以及共價(jià)連接雜交體N-末端和C-末端組成的間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中N-末端包括哺乳動(dòng)物Ii key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)及其保持增強(qiáng)抗原呈遞活性的修飾，C-末端包括多肽或結(jié)合MHCII類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)的類肽結(jié)構(gòu)形式的抗原表位，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，間插化學(xué)結(jié)構(gòu)不能以任何空間不同的方式氫鍵結(jié)合MHC II類分子，并且優(yōu)選的長(zhǎng)度約4個(gè)到6個(gè)氨基酸，同樣地以線性方式排列。使用在雜交體中的Ii Key肽的修飾包括，從N-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，從C-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，保護(hù)N-末端，氨基酸取代，以及產(chǎn)生環(huán)化衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用在雜交體中的IiKey肽通過(guò)C-末端截短成LRMK(SEQ ID NO3)來(lái)修飾。本發(fā)明的優(yōu)選雜交體包括Ac-LRMK(SEQ ID NO3)-5-氨基pentanoyl-IAYLKQATAK(SEQ ID NO8)-NH2，Ac-LRMK(SEQ ID NO3)-5-氨基pentanoyl-5-氨基pentanoyl-IAYLKQATAK(SEQ ID NO8)-NH2，Ac-LRMKLPKSIAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO9)，Ac-LRMKLPKSAKPIAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO10)，或者Ac-LRMKLPKSAKPVSKIAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO11)。使用在雜交體中的IiKey肽的另一種優(yōu)選修飾是用類肽結(jié)構(gòu)，D-異構(gòu)體氨基酸，N-甲基氨基酸，L-異構(gòu)體氨基酸，修飾的L異構(gòu)體氨基酸，或環(huán)化的衍生物取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。本發(fā)明還提供了鑒別在增強(qiáng)MHC II類抗原呈遞的雜交體鄰近以與Ii Key肽等同的方式起作用的分子的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種增強(qiáng)MHC II類限制性抗原表位呈遞到T細(xì)胞上的方法，方法包括將MHC II類限制性抗原表位摻入到本發(fā)明的MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽中，然后在生理學(xué)條件下接觸雜交體多肽，MHC II類表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞，和T細(xì)胞，T細(xì)胞對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子呈遞的抗原表位應(yīng)答。這種方法可用來(lái)增加MHC II類等位基因?qū)饺氲目乖砦坏膽?yīng)答。當(dāng)抗原表位摻入到本發(fā)明的雜交體中時(shí)，表現(xiàn)預(yù)定模式的MHC II類限制性Th1就Th2刺激作用的抗原表位更容易鑒別。通過(guò)增強(qiáng)分子的抗原表位將MHC II類分子呈遞到個(gè)體的特異T淋巴細(xì)胞上，本發(fā)明的雜交體也可用來(lái)調(diào)節(jié)個(gè)體對(duì)特異分子的免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供了體內(nèi)的和體外的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種抑制向T細(xì)胞呈遞MHC II類限制性抗原的方法。方法包括在生理學(xué)條件下接觸下列組成MHC II類表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞在其表面顯示T淋巴細(xì)胞-呈遞的抗原表位；對(duì)由抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子呈遞的抗原表位應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞；抗原呈遞抑制雜交體多肽，其包括i)N-末端，N-末端包括哺乳動(dòng)物Ii Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)及其保持增強(qiáng)抗原呈遞活性的修飾，ii)C-末端，C-末端包括結(jié)合到MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的抗原結(jié)合配體或類肽結(jié)構(gòu)，iii)共價(jià)結(jié)合雜交體的N-末端和C-末端的間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列。通過(guò)抑制個(gè)體抗原呈遞細(xì)胞呈遞MHC II類抗原，這種方法可用來(lái)治療患有與產(chǎn)生非-有益免疫應(yīng)答相關(guān)的疾病的個(gè)體。本發(fā)明也提供了一種鑒別抑制MHC II類抗原呈遞化合物的方法。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的各個(gè)方面是基于發(fā)現(xiàn)，通過(guò)適當(dāng)?shù)拈g插化學(xué)結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物Ii Key肽共價(jià)結(jié)合形成雜交體多肽的MHC II類限制性抗原表位，由抗原呈遞細(xì)胞呈遞到T淋巴細(xì)胞時(shí)具有比前體抗原表位顯著高的功效。形成的雜交體多肽本文稱為“增強(qiáng)MHCII類抗原呈遞雜交體多肽”，或更簡(jiǎn)單地稱為“增強(qiáng)雜交體”。本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體具有包括哺乳動(dòng)物Ii Key肽，或其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾的N-末端，下面進(jìn)行更詳細(xì)的描述。共價(jià)與Ii Key肽結(jié)合的是要呈遞的特異抗原表位。在Ii Key肽和抗原表位之間是間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，間插化學(xué)結(jié)構(gòu)共價(jià)連接著其他兩個(gè)組成。這種間插化學(xué)結(jié)構(gòu)本文稱為“間隔基”。間隔基的必要參數(shù)在下面更詳細(xì)地描述。
已有顯示，哺乳動(dòng)物Ii Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQID NO1)，和修飾的哺乳動(dòng)物Ii Key肽，YRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO2)，具有改變某些MHC II類限制性抗原肽向識(shí)別這些抗原肽的T淋巴細(xì)胞-雜交瘤呈遞的能力(R.Humphreys(1996)美國(guó)專利No.5,559,028；Humphreys等人，(1999)美國(guó)專利No.919,639，這些專利的內(nèi)容參考收入本篇)。
使用修飾Ii-Key肽的先前的試驗(yàn)顯示在不損害活性的情況下可以對(duì)這種多肽進(jìn)行非常多種類的修飾。確實(shí)，修飾常常能增強(qiáng)多肽的抗原呈遞活性。在下面實(shí)施例部分詳細(xì)列出的結(jié)果顯示所有保持增強(qiáng)抗原呈遞活性的修飾Ii-Key肽，當(dāng)適當(dāng)摻入時(shí)都會(huì)在本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體中起作用。對(duì)Ii-Key肽的修飾包括從N-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，從C-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，保護(hù)N-末端，氨基酸取代，環(huán)形肽的引入。保留原序列的至少4個(gè)鄰接氨基酸的Ii Key肽的缺失，或其取代形式都表現(xiàn)出功能活性。多種天然或非-天然的氨基酸可以在不同的殘基位置取代。一些可以被取代的分子實(shí)例有類肽結(jié)構(gòu)，D-異構(gòu)體氨基酸，N-甲基氨基酸，L-異構(gòu)體氨基酸，修飾L-異構(gòu)體氨基酸，和環(huán)化的衍生物。此外，此領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用醫(yī)療化學(xué)過(guò)程通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)方法獲得雜交體N-末端片段的其他修飾。這種過(guò)程的實(shí)例有推理性藥物設(shè)計(jì)法，根據(jù)X-射線衍射數(shù)據(jù)，核磁共振數(shù)據(jù)獲得的結(jié)構(gòu)信息得到分子模型，和其他計(jì)算法，以及篩查組合化學(xué)合成法合成的產(chǎn)物，和天然產(chǎn)物的分離。已知的保持高活性的Ii-Key肽的修飾形式實(shí)例有LRMK(SEQ ID NO3)，LRMKLPK(SEQ IDNO4)，LRMKLPKS(SEQ ID NO5)，LRMKLPKSAKP(SEQID NO6)，和LRMKLPKSAKPVSK(SEQ ID NO7)。其他修飾和Ii-Key肽的修飾形式在Humphreys等人，(1999)美國(guó)專利No.5,919,639和Humphreys(1996)美國(guó)專利No.5,559,028中描述。已知保持活性的Ii-Key肽的修飾形式(YRMKLPKPPKPVSKMR，SEQ ID NO2)本文稱為“Ii-Key同系物”。如本文所使用的Ii-Key同系物包括Ii-Key肽本身。
增強(qiáng)雜交體的“抗原表位”是由有些MHC II類分子的有些等位基因呈遞給有些T細(xì)胞的表位。這樣，抗原表位與MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合。選取用來(lái)生成本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體的“抗原表位”可以進(jìn)一步被修飾以進(jìn)行使用。也就是說(shuō)，天然或修飾序列的多肽，類肽結(jié)構(gòu)，和不是天然或修飾氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)也包括在抗原表位中。此外，也可對(duì)抗原表位進(jìn)行多種化學(xué)修飾，例如，加入全部或部分非天然氨基酸，或其他主鏈或側(cè)鏈組成，其中修飾物以對(duì)T細(xì)胞刺激有益的方式保持抗原表位在哺乳動(dòng)物MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的結(jié)合。這樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以帶有與從天然蛋白質(zhì)序列衍生的任何抗原肽適度的，少量的，或沒(méi)有明顯結(jié)構(gòu)上的類同之處。這樣的修飾可以對(duì)或可以不對(duì)T細(xì)胞受體的識(shí)別作用有影響。修飾可以增加對(duì)抗原表位的識(shí)別作用(如，產(chǎn)生先前非-識(shí)別亞集的T細(xì)胞受體的識(shí)別作用)。
雜交體中的間插化學(xué)片段或“間隔基”連接Ii-Key同系物和抗原表位。兩個(gè)或多個(gè)這樣的間插片段稱為“間隔基組”間隔基由從零個(gè)到數(shù)個(gè)原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)組成，當(dāng)原子以線性方式排列時(shí)，間隔基將延伸到20個(gè)氨基酸的肽酰主鏈原子的長(zhǎng)度，同樣以線性方式排列。優(yōu)選地，間隔基的長(zhǎng)度少于線性排列的9個(gè)氨基酸的肽酰主鏈。最優(yōu)地，間隔基的長(zhǎng)度為線性排列的4個(gè)到6個(gè)氨基酸的肽酰主鏈長(zhǎng)度。優(yōu)選地，間隔基不能以任何空間不同的方式氫鍵結(jié)合MHC II類分子。
除了氨基酸，有多種化學(xué)基團(tuán)可以摻入到間隔基片段中。實(shí)例在Tournier等人的(1999)美國(guó)專利No.5,910,300中描述，專利的內(nèi)容參考收入本篇。在優(yōu)選實(shí)施方案中，間隔基包括優(yōu)選地由雜原子間斷的脂肪族鏈，如C2-C6亞烷基，或＝N-(CH2)2-6-N＝?？商鎿Q地，間隔基可以由替換單元組成，如疏水性，親脂性，脂肪族和芳基脂肪族序列，任意地由雜原子如O，N，或S間斷。間隔基的這種組成優(yōu)選地從下列類型的化合物中選取固醇，烷基醇，具有不同烷基官能的聚甘油酯，烷基-苯酚，烷基-胺，憎羥基聚氧化烯，等等。其他實(shí)例有疏水聚酐，聚原酸酯，聚磷腈，多羥酸，聚己酸丙酯，polyactic，聚乙二醇多羥基酪酸。間隔基也可含有重復(fù)短脂肪族鏈，如聚亞丙基，異亞丙基，亞丁基，異亞丁基，1，5-亞戊基，等等，有氧原子隔開(kāi)。
其他可使用在間隔基中的肽酰序列在Whitlow等人的(1999)美國(guó)專利No.5,856,456中描述，專利的容納參考收入本篇。在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔基具有可以進(jìn)行裂解的摻入化學(xué)基團(tuán)，沒(méi)有限制地，這樣的化學(xué)基團(tuán)可以設(shè)計(jì)進(jìn)行由蛋白酶，化學(xué)基團(tuán)，或催化單克隆抗體催化的裂解。在蛋白酶-敏感化學(xué)基團(tuán)情況中，優(yōu)選的是胰蛋白酶靶(帶有陽(yáng)離子側(cè)鏈的兩個(gè)氨基酸)，胰凝乳蛋白酶靶(帶有疏水側(cè)鏈)，和組織蛋白敏感性(B，D或S)?！耙鹊鞍酌赴小北疚氖怯脕?lái)描述由胰蛋白或類-胰蛋白酶識(shí)別的氨基酸序列?！耙饶榈鞍酌赴小北疚氖怯脕?lái)描述由胰凝乳蛋白或類-胰凝乳蛋白酶識(shí)別的氨基酸序列。此外，在肽合成，酶催化以及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員眾所周知的催化單克隆抗體的化學(xué)靶和其他化學(xué)裂解基團(tuán)也可設(shè)計(jì)在雜交體結(jié)構(gòu)中，并使用常規(guī)試驗(yàn)方法來(lái)合成。
本發(fā)明的雜交體完全的肽特性到基本上非-肽特性變化，根據(jù)一些同系物是還原的或是非肽特性的事實(shí)，它們將更可能具有有益的屬性，如滲透穿過(guò)細(xì)胞膜，溶解性，抗蛋白水解，抗由于綴合而滅活，口服生物可用性，以及延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。
包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的還有當(dāng)酸性或堿性基團(tuán)存在時(shí)雜交分子藥物可接受的鹽。“藥物可接受的鹽”意指包括所有可接受的鹽，如醋酸鹽，銨鹽，苯磺酸鹽，安息香酸鹽，硼酸鹽，溴化物，乙二胺四乙酸鈣，camsylate，碳酸鹽，氯化物/二鹽酸化物，檸檬酸鹽，棒酸鹽，乙二胺四乙酸鹽，edisylate，estolate，esylate，延胡索酸鹽，己基resorcinate，hydrabamine，羥基萘甲酸鹽，碘化物，異硫代硫酸鹽，乳酸鹽，乳糖酸鹽，月桂酸鹽，甲磺酸鹽，甲基溴化物，甲基硝酸鹽，甲基硫酸鹽，粘酸鹽(mucate)，萘磺酸鹽，硝酸鹽，N-甲基丙烯醇酸胺(glucamide)，oleaste，草酸鹽，雙羥萘酸鹽，棕櫚酸鹽，panoate，泛酸鹽，磷酸鹽/二磷酸鹽，多聚半服糖醛酸鹽，堿式乙酸鹽，硫酸鹽，酒石酸鹽，甲苯磺酸鹽，triethiodide，戊酸鹽，等等。藥物可接受的鹽可以用作為藥劑形式，來(lái)調(diào)節(jié)溶解性或水解性質(zhì)，或可使用在持續(xù)釋放或藥物前體配方中。根據(jù)本發(fā)明化合物的具體功能性，本發(fā)明化合物的藥物可接受的鹽可以從陽(yáng)離子制成，如鈉鹽，鉀鹽，鋁鹽，鈣鹽，鋰鹽，鎂鹽，鋅鹽，以及從堿制成，如氨，精氨酸，氯普魯卡因，維生素B復(fù)合體(choline)，二乙醇胺，二乙胺，乙撐二胺，賴氨酸，N-甲基-谷氨酰胺，鳥(niǎo)氨酸，二苯基乙撐二乙胺，哌嗪，普魯卡因(procaine)，三(羥甲基)氨基甲烷，四亞甲基二胺氫氧化物，等等。這些鹽可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備，如，通過(guò)將游離酸與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)或無(wú)機(jī)堿反應(yīng)。當(dāng)堿性基團(tuán)存在時(shí)，如胺，酸性鹽，即醋酸鹽，溴化氫，氯化氫，雙羥萘酸鹽，等等可用作為藥劑形式。
同樣，在酸(-COOH)或醇基團(tuán)存在的情況中，可以使用藥物可接受的酯，例如，醋酸酯，馬來(lái)酸酯，三甲基乙酰氧甲基，等等，以及用作為持續(xù)釋放或藥物前體配方調(diào)節(jié)溶解性和水解特性的此領(lǐng)域中眾所周知的那些酯。
本發(fā)明雜交體分子或它們的組成也可以具有手性中心，因此可以外消旋，外消旋混合物存在，以及以個(gè)別的對(duì)映異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體存在，所有這樣的異構(gòu)體形式以及它們的混合物都包括在本發(fā)明中。并且，本發(fā)明的雜交化合物的一些晶體形式也可以以同質(zhì)異像體存在，所以這樣同質(zhì)異像體也包括在本發(fā)明中。此外，本發(fā)明的一些化合物可以與水或常見(jiàn)有機(jī)溶劑形成溶劑化物。這樣的溶劑化物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體可以由肽或類肽或其他化學(xué)基團(tuán)構(gòu)成，肽或類肽或其他化學(xué)基團(tuán)可以通過(guò)已經(jīng)研究出的抗原肽的合成及選取方法來(lái)合成及選取。這樣的方法和化合物存在于下列專利中Geysen等人的(1987)美國(guó)專利No.4,708,871；Geysen等人的(1993)美國(guó)專利No.5,194,392；Schatz等人的(1993)美國(guó)專利No.5,270,170；Lam等人的(1995)美國(guó)專利No.5,382,513；Geysen等人的(1996)美國(guó)專利No.5,539,084；Pinilla等人的(1996)美國(guó)專利No.5,556,762；Geysen等人的(1997)美國(guó)專利No.5,595,915；Key等人的(1998)美國(guó)專利No.5,747,334；和Nova等人的(1999)美國(guó)專利No.5,874,214，所有這些專利文獻(xiàn)參考收入本篇。
在一個(gè)或多個(gè)系列的免疫學(xué)測(cè)試法中可以確定雜交體的活性，免疫學(xué)測(cè)試法用來(lái)檢測(cè)對(duì)T細(xì)胞識(shí)別抗原肽作用的影響。在下面實(shí)施例部分中詳細(xì)描述的實(shí)例顯示了將抗原肽IAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO8)摻入到下列雜交體中的效用Ac-LRMK(SEQ ID NO2)-5-氨基pentanoly-IAYLKQATAK(SEQ ID NO8)NH2-；Ac-LRMK(SEQ ID NO2)-5-氨基pentanoly-5-氨基pentanoly-IAYLKQATAK(SEQ ID NO8)NH2-；Ac-LRMKLPKSIAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO9)，Ac-LRMKLPKSAKPIAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO10)，和Ac-LRMKLPKSAKPVSKIAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO11)。這些雜交體中的每一種都顯示出能刺激應(yīng)答T細(xì)胞雜交瘤，比未摻入抗原肽Ac-IAYLKQATAK--NH2(SEQ ID NO8)雜交體效力要高。這可通過(guò)測(cè)定雜交體和抗原表位與抗原呈遞細(xì)胞的結(jié)合與濃度的關(guān)系，接著通過(guò)具有識(shí)別結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的表位的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞雜交瘤的識(shí)別作用來(lái)確定。所使用的抗原呈遞細(xì)胞是CH27細(xì)胞種系，所使用的T細(xì)胞雜交瘤是Tpc9.1 T雜交瘤細(xì)胞種系。試驗(yàn)方法的其他詳細(xì)內(nèi)容在下面的實(shí)施例中提供。
這些結(jié)果顯示，每種測(cè)試的雜交體都比對(duì)照抗原表位具有顯著高的活性。具體地，未摻入的抗原表位的最大刺激作用半值終點(diǎn)為約20nm。使用雜交體Ac-LRMKLPKSAKPIAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO10)和Ac-LRMK(SEQ ID NO3)-5-氨基pentanoly-5-氨基pentanoly-IAYLKQATAK(SEQID NO8)-NH2的最大刺激作用半值終點(diǎn)為約50pm。使用亞甲基間隔基的雜交體的活性可以與Ii蛋白質(zhì)的天然序列的活性相比。這些試驗(yàn)顯示了Ii-Key核心序列和抗原表位的雜交體在體外的功效，說(shuō)明當(dāng)摻入到本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體中時(shí)，結(jié)合MHCII類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)的抗原表位的抗原呈遞功效增加了，這些試驗(yàn)還顯示從Ii蛋白質(zhì)的基本序列衍生的，與Ii Key序列配準(zhǔn)的肽序列不是必須的，并且也不是最優(yōu)的。
其他測(cè)試系統(tǒng)也可用來(lái)測(cè)定將抗原表位摻入到本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體中的作用。具有在MHC II類分子中識(shí)別抗原表位的可選擇輸出結(jié)果的測(cè)試法沒(méi)有限制地包括，測(cè)定B細(xì)胞產(chǎn)出免疫球蛋白的功效，測(cè)定生成細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功效，使用從雜交，近交，同基因異系，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得的天然T細(xì)胞獲取T細(xì)胞受體或另一種生物學(xué)相關(guān)分子。
本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體的存在也具有抑制或調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)由結(jié)合在MHC II類分子的脫位表位呈遞的其他抗原表位的應(yīng)答。在這個(gè)方面中，雜交體還作涉及所有其他抗原表位的MHC II類限制性抗原呈遞的抑制劑。在這個(gè)方面中，雜交體也可稱為“MHCII類抗原呈遞抑制雜交體多肽”或簡(jiǎn)單地稱為“抑制雜交體”。
結(jié)合在MHC II類分子抗原結(jié)合位點(diǎn)的，并且不具有T細(xì)胞刺激活性的分子，可以考慮作為與其結(jié)合的這種MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)的阻斷劑。阻斷劑的結(jié)合抑制或脫離呈遞抗原表位的結(jié)合。這樣的分子具有作為免疫抑制劑的價(jià)值。本發(fā)明的抑制雜交體也可通過(guò)將阻斷劑摻入到通常由抗原表位占據(jù)的位置來(lái)制備。將阻斷劑摻入到抑制雜交體中增強(qiáng)了阻斷劑的抑制活性。本文所使用的“抗原結(jié)合位點(diǎn)配體”是指結(jié)合在MHCII類分子抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。這種表達(dá)包括抗原表位和非-抗原分子。
類似的參數(shù)適用于用來(lái)產(chǎn)生抑制雜交體的抗原結(jié)合位點(diǎn)配體的物理需求，如上面所列出的用于抗原表位的參數(shù)。用來(lái)產(chǎn)生抑制雜交體的抗原結(jié)合位點(diǎn)配體本文限定為包括天然或修飾序列，或類肽序列，或不包括天然或修飾氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)的任何肽序列，其中肽序列具有已顯示出或考慮到會(huì)結(jié)合到哺乳動(dòng)物MHC II類分子中的性質(zhì)，其全部或部分地結(jié)合到顯示要被某些T細(xì)胞識(shí)別的已知抗原肽占據(jù)的位置中。抗原結(jié)合位點(diǎn)配體不需要僅包括天然氨基酸，其也可以包括全部或部分非天然氨基酸的多種修飾，或包括其他主鏈或側(cè)鏈組成，以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果的方式，這些修飾產(chǎn)生哺乳動(dòng)物MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的適宜結(jié)合。這樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以帶有與從天然蛋白質(zhì)序列衍生的任何抗原肽適度的，少量的，或沒(méi)有顯著的結(jié)構(gòu)類同之處。
當(dāng)具有抑制活性的抗原結(jié)合位點(diǎn)配體摻入到本發(fā)明的雜交體中時(shí)，可以是下面所描述的化合物中的一個(gè)，或可以通過(guò)使用下列專利組中的一個(gè)或多個(gè)專利中的方法發(fā)現(xiàn)，這些專利文獻(xiàn)的內(nèi)容參考收入本篇Sette等人的(1998)美國(guó)專利No.5,736,142；Adams等人的(1998)美國(guó)專利No.5,817,757；Gaeta等人的(1997)美國(guó)專利No.5,679,640；Kubo等人的(1997)美國(guó)專利No.5,662,907；Robbins等人的(1998)美國(guó)專利No.5,843,648；以及Kawakami等人的(1998)美國(guó)專利No.5,844,075。
此領(lǐng)域中技術(shù)人員可以使用常規(guī)試驗(yàn)過(guò)程設(shè)計(jì)測(cè)試法，來(lái)測(cè)定通過(guò)抑制本發(fā)明的雜交體對(duì)T細(xì)胞對(duì)另一種抗原表位(如標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ湛乖砦?應(yīng)答的抑制作用或調(diào)節(jié)作用的影響。在這樣的測(cè)試法中，在將另一種抗原表位加入之前，同時(shí)，或之后，將抑制雜交體加入到標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試混合物中。當(dāng)加入雜交體發(fā)生在加入另一種抗原表位之前或之后時(shí)，雜交體可以不只一次加入。在變化的條件下，這樣的測(cè)試法具有多種效用，如檢測(cè)產(chǎn)生免疫應(yīng)答抑制作用的最佳雜交體結(jié)構(gòu)，或檢測(cè)產(chǎn)生在生理學(xué)條件下排除內(nèi)源加工的及荷電的抗原肽，并用合成肽替換的最佳雜交體結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種鑒別在本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體周圍用與Ii Key肽等同的方式起作用的分子的方法。這樣的分子包括新型Ii Key同系物，并且也可能包括表面上不相關(guān)的分子。這樣的分子可以從化合物文庫(kù)(如從天然源獲得的分子文庫(kù)，或通過(guò)組合化學(xué)合成法制備的分子)中獲得并鑒別。為此，制備候選分子的文庫(kù)，并且將文庫(kù)中的每種化合物通過(guò)適當(dāng)?shù)拈g隔基與抗原表位的N-末端共價(jià)結(jié)合，以形成候選雜交體。當(dāng)使用肽組合文庫(kù)作為候選分子時(shí)，在合成過(guò)程中，雜交體的候選分子N-末端片段的每個(gè)氨基酸都可以C到N方向，通過(guò)合成的自動(dòng)操作法從雜交體的C-末端氨基酸殘基開(kāi)始，加到雜交體的N-末端片段上。在類肽合成情況中，如通過(guò)上述專利中所公開(kāi)的方法，可以使用聚合物合成常規(guī)的試驗(yàn)方法。在有機(jī)環(huán)-基化合物的組合化學(xué)合成的情況中，這樣的化合物可以通過(guò)間隔基與抗原肽共價(jià)結(jié)合。這種有機(jī)環(huán)-基化合物的實(shí)例，其可在同系物文庫(kù)中制備，在下列專利中公開(kāi)，這些專利文獻(xiàn)參考收入本篇Valerio等人的(1997)美國(guó)專利No.5,627,210；Houghten等人的(1998)美國(guó)專利No.5,783,577；Nefzi等人的(1998)美國(guó)專利No.5,786,448；Ostresh等人的(1999)美國(guó)專利No.5,856,107；以及Meyer等人的(1999)美國(guó)專利No.5,859,190。此領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以通過(guò)下列方法來(lái)鑒別其他修飾，推理性藥物設(shè)計(jì)，篩查組合化學(xué)合成的產(chǎn)品，以及篩查天然源的分離物，通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)。
使用在這種方法中的抗原表位應(yīng)與上面描述的抗原表位相一致。優(yōu)選地，使用的抗原表位是其有可利用的可靠的T細(xì)胞雜交瘤應(yīng)答測(cè)試法的抗原表位(如鴿子細(xì)胞色素C表位)。使用在這種方法中的間隔基也應(yīng)與上面描述的間隔基一致。
一旦候選分子適當(dāng)?shù)嘏c抗原表位結(jié)合，則使用T細(xì)胞雜交瘤應(yīng)答測(cè)試法測(cè)試產(chǎn)生的雜交體的抗原呈遞增強(qiáng)活性，T細(xì)胞雜交瘤應(yīng)答測(cè)試法是對(duì)MHC II類分子環(huán)境中由抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原表位特異。具有抗原呈遞增強(qiáng)活性的雜交體通過(guò)這種測(cè)試法確定，對(duì)雜交體的確定說(shuō)明摻入到確定雜交體的N-末端中的相應(yīng)的候選分子在這種環(huán)境中以與Ii Key肽等同的方式起作用。這種方法也適于用來(lái)確定同樣以與Ii Key肽等同的方式起作用的特異分子(如，由推理性設(shè)計(jì)制備的分子)。這樣的分子可以簡(jiǎn)單地?fù)饺氲竭m當(dāng)?shù)碾s交體中，然后如上面所描述的測(cè)試雜交體的抗原呈遞增強(qiáng)活性。
本發(fā)明還包括通過(guò)上述方法確定的在MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)肽中起作用的分子，以及摻入這種分子的增強(qiáng)雜交體。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)MHC II類限制性抗原表位呈遞到T淋巴細(xì)胞上的方法。在這種方法中，將MHC II類限制性抗原表位適當(dāng)?shù)負(fù)饺氲奖景l(fā)明的增強(qiáng)雜交體的C-末端中，如上面所描述的。然后在生理學(xué)條件下將制備的增強(qiáng)雜交體與MHC II類表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞接觸，其中MHC II類表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞正在與T細(xì)胞接觸，或然后與T細(xì)胞接觸，T細(xì)胞對(duì)由抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子呈遞的抗原表位應(yīng)答。這種方法適于與上面列出的抗原表位一致的所有抗原表位一起使用。在體外測(cè)試這種增強(qiáng)作用的方法實(shí)例在下面實(shí)施例部分及列出的專利公開(kāi)的美國(guó)專利中詳細(xì)描述。
增強(qiáng)MHC II類限制性抗原表位呈遞到T淋巴細(xì)胞上的方法在診斷及治療疾病中具有廣泛的應(yīng)用。T細(xì)胞對(duì)診斷抗原表位的應(yīng)答可以在疾病的診斷中進(jìn)行測(cè)定，特別涉及病原性感染試劑。使用摻入這種診斷抗原表位的本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體可以增加體外診斷測(cè)試中這些雜交體的敏感性。在感染性疾病和癌癥情況中，確定為病原體或癌癥特異的抗原表位可以摻入到本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體中，然后使用雜交體啟動(dòng)Th對(duì)病原體或癌癥特異MHC II類呈遞抗原表位的應(yīng)答。這種應(yīng)答致使T輔助性細(xì)胞活化并擴(kuò)展，T輔助性細(xì)胞接著激活或“許可”樹(shù)狀細(xì)胞來(lái)引發(fā)MHC II類限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)侵入有機(jī)體的有效應(yīng)答。在自身免疫疾病，變態(tài)反應(yīng)，及移植體排斥情況中，確定觸發(fā)病原體免疫應(yīng)答的特異抗原表位，然后將其摻入到本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體中。然后使用雜交體以產(chǎn)生Th2應(yīng)答的方式刺激T細(xì)胞，Th2應(yīng)答將向下調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答。在這種情況中，使用對(duì)抑制性細(xì)胞應(yīng)答的刺激作用來(lái)向下調(diào)節(jié)病原體免疫應(yīng)答。確定特異刺激預(yù)先確定的T淋巴細(xì)胞亞集的增強(qiáng)雜交體的方法在下面進(jìn)行描述。在治療疾病中這種雜交體的其他方法和應(yīng)用如下面所考慮到的。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中涉及一種確定刺激給定(預(yù)先確定的)T淋巴細(xì)胞，或其衍生的克隆細(xì)胞的特異抗原表位的方法，其中使用組合化學(xué)過(guò)程進(jìn)行肽合成。由本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體產(chǎn)生的增加敏感性的MHC II類限制性T細(xì)胞刺激作用使得使用給定T淋巴細(xì)胞對(duì)大量不同的分子篩查T細(xì)胞刺激活性可行。在這種方法中，提供或合成候選肽或化合物的文庫(kù)。文庫(kù)中的每種候選化合物都與哺乳動(dòng)物Ii Key同系物N-末端獨(dú)立地結(jié)合，如上面所描述的，通過(guò)間隔基的共價(jià)鍵，如上面所描述的，產(chǎn)生類似本發(fā)明增強(qiáng)雜交體的雜交體。然后測(cè)試每一種這些雜交體刺激存在于抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子中的預(yù)先確定的T淋巴細(xì)胞的能力。這可以通過(guò)將每種雜交體產(chǎn)物分別與抗原呈遞細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞接觸來(lái)實(shí)施，T淋巴細(xì)胞將對(duì)在抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子中呈遞的適當(dāng)抗原表位應(yīng)答。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這種測(cè)試法可大規(guī)模實(shí)施，以篩查大量的候選物。當(dāng)由抗原呈遞細(xì)胞呈遞時(shí)確定刺激T淋巴細(xì)胞的雜交體確定地包括刺激T淋巴細(xì)胞的抗原表位。
候選化合物可從多種來(lái)源獲得，如，天然可獲得分子的文庫(kù)和組合化學(xué)文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，候選化合物的合成過(guò)程可以擴(kuò)充以制備需要的雜交體。在許多情況中，這種文庫(kù)用在某些序列位置上限定一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的某種可能的序列集來(lái)設(shè)計(jì)。在合成這些肽的過(guò)程中，沿著C到N的方向，加上一個(gè)或多個(gè)間隔基序列殘基，接著加上所需的Ii Key，N-末端片段殘基。候選化合物可以由上面確定的作為如本文所限定的抗原表位的可能的物質(zhì)或組分的任何物質(zhì)或組分組成。優(yōu)選地，候選化合物是預(yù)測(cè)會(huì)結(jié)合到MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)的多肽或類肽結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還包括通過(guò)這種方法確定的特異抗原表位。同樣包括在本發(fā)明中的還有其中摻入特異抗原表位的增強(qiáng)雜交體。
候選化合物也可通過(guò)在基因水平上產(chǎn)生多樣性，接著表達(dá)多肽基序列的體外方法獲得。通過(guò)上述篩查確定的化合物可被用作為其他在相同或其他測(cè)試中進(jìn)行篩查的亞文庫(kù)的基礎(chǔ)。多種方法可以用來(lái)產(chǎn)生抗原表位序列多樣性，如噬菌體展示，核糖體展示，以及體外RNA-蛋白質(zhì)融合技術(shù)。這些方法部分在下列專利中提供，這些專利的內(nèi)容參考收入本篇Huang等人的(1996)美國(guó)專利No.5,516,637；Garrard等人(1998)美國(guó)專利No.5,821,047；Kay等人(1998)美國(guó)專利No.5,852,167；Collines等人(1998)美國(guó)專利No.5,925,559。這些方法中一些也在下列公開(kāi)物中部分提供Roberts等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9412297；Hanes等人(1998)Natl.Acad.Sci.USA.9514130；Jermutus等人(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9534。對(duì)這些方法來(lái)說(shuō)，一個(gè)過(guò)程要求將LRMK序列(SEQ ID NO3)，及其修飾通過(guò)遺傳學(xué)方法引入到多肽基產(chǎn)物中。LRMK(SEQID NO3)基元在產(chǎn)物線性序列中的位置通過(guò)如上所述的間隔基與抗原表位隔開(kāi)。產(chǎn)生，表達(dá)及分析多肽基產(chǎn)物的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，和選取一種或多種具有較好屬性的多肽基產(chǎn)物的方法，對(duì)此領(lǐng)域中的技術(shù)人員是眾所周知的。
將抗原表位摻入到本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體中，除了增加抗原呈遞細(xì)胞呈遞抗原表位的總效力，還可以增加等位基因限制性抗原表位呈遞的MHC II類等位基因的范圍。增加的與抗原表位對(duì)應(yīng)的增強(qiáng)雜交體的等位基因范圍，可通過(guò)實(shí)施上述的測(cè)試過(guò)程使用表達(dá)一定范圍的MHC II類等位基因的抗原呈遞細(xì)胞來(lái)檢測(cè)。MHC II類等位基因的范圍應(yīng)反映出所需的范圍。這種用于MHC II類分子的多等位基因測(cè)試系統(tǒng)的實(shí)例在下列專利中提供R.Humphreys(1996)美國(guó)專利No.5,559,028和Humphreys等人(1999)美國(guó)專利No.5,919,639，這些專利的內(nèi)容參考收入本篇。選擇具有所需MHC II類等位基因范圍的表現(xiàn)出最大活性的雜交體進(jìn)行使用。預(yù)先確定的等位基因活性范圍可能與已知的疾病或其他醫(yī)療狀況有關(guān)系。在優(yōu)選實(shí)施方案中，MHC II類等位基因的范圍是從與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，依賴于胰島素的糖尿病mellitus相關(guān)的HLA-D等位基因中選取的。對(duì)HLA-DR等位基因的選擇，以及選取在這種等位基因上進(jìn)行反應(yīng)性測(cè)試的抗原呈遞細(xì)胞種系，和T細(xì)胞種系和雜交瘤，此領(lǐng)域中的技術(shù)人員可使用方便獲得的物質(zhì)和常規(guī)的實(shí)驗(yàn)條件容易地確定。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種確定或選取表現(xiàn)預(yù)定模式MHC II類限制性Th1和Th2刺激作用的抗原表位的方法。所需預(yù)定模式的刺激作用可以是僅對(duì)Th1的刺激作用，或僅對(duì)Th2的刺激作用，或?qū)h1和Th2的刺激作用，在將MHC II類限制性抗原表位呈遞到T細(xì)胞上的應(yīng)答。將候選抗原表位適當(dāng)?shù)負(fù)饺氲奖景l(fā)明的抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽中。然后將顯示具有所需模式的MHC II類限制性Th1和Th2刺激作用的呈遞活性的增強(qiáng)雜交體從產(chǎn)生的增強(qiáng)雜交體中確定出來(lái)。篩查顯示所需活性的雜交體分子是通過(guò)將雜交體多肽與MHC II類表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞接觸來(lái)實(shí)施的，其中T細(xì)胞對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子對(duì)抗原表位的呈遞應(yīng)答。雜交體和細(xì)胞的接觸應(yīng)在生理學(xué)條件下進(jìn)行。對(duì)Th1和Th2應(yīng)答的測(cè)試過(guò)程可如下列專利文獻(xiàn)中所描述來(lái)實(shí)施，這些專利文獻(xiàn)的內(nèi)容參考收入本篇Daynee等人的(1996)美國(guó)專利No.5,540,919；Powrie等人的(1997)美國(guó)專利No.5,601,815；Metzger等人的(1997)美國(guó)專利No.5,665,347；Hsu等人的(1998)美國(guó)專利No.5,776,451；Sedlacek等人的(1998)美國(guó)專利No.5,837,269；Daynee等人的(1998)美國(guó)專利No.8,837,269；Reed(1999)美國(guó)專利No.5,879,687；Wang(1999)美國(guó)專利No.5,895,646；Baumann等人的(1999)美國(guó)專利No.5,897,990；以及Levitt等人的(1999)美國(guó)專利No.5,908,839。
Th1和Th2刺激作用通常通過(guò)細(xì)胞因子釋放測(cè)試法來(lái)確定。顯示出與所需Th1和Th2刺激作用模式相關(guān)的產(chǎn)生細(xì)胞因子釋放的最大活性的增強(qiáng)雜交體可確定并選取使用。在優(yōu)選實(shí)施方案中細(xì)胞因子釋放的預(yù)定模式反映出與疾病或其他身體狀況的增強(qiáng)或抑制相關(guān)的模式。例如，產(chǎn)生與自身免役疾病相關(guān)的細(xì)胞因子釋放模式是優(yōu)選的，自身免役疾病有如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，或依賴于胰島素的糖尿病mellitus。此外，對(duì)與感染性疾病和變態(tài)反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子釋放模式有有益影響的雜交體可以選取。通過(guò)方便獲得的物質(zhì)和常規(guī)的實(shí)驗(yàn)條件，此領(lǐng)域中的技術(shù)人員可方便地確定選取并實(shí)施適當(dāng)?shù)臏y(cè)試法來(lái)確定Th1和Th2刺激作用，包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和在那些動(dòng)物中進(jìn)行的體外輔助性測(cè)試，并且也包括其他體外測(cè)試。
本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體通過(guò)增強(qiáng)抗原表位對(duì)MHC II類分子向個(gè)體T淋巴細(xì)胞的呈遞，可以用來(lái)調(diào)節(jié)個(gè)體對(duì)特異分子的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用可以是增強(qiáng)的或是抑制的，并對(duì)應(yīng)于T淋巴細(xì)胞的亞集，T輔助性細(xì)胞或T抑制性細(xì)胞分別被刺激。
哪一種淋巴細(xì)胞被刺激由服用的特異增強(qiáng)雜交體來(lái)確定，如上所述，來(lái)選取所需T淋巴細(xì)胞刺激作用的特異雜交體。一旦適當(dāng)增強(qiáng)雜交體產(chǎn)生并選取，雜交體可以在適于將雜交體運(yùn)送到個(gè)體的抗原呈遞細(xì)胞的條件下給個(gè)體服用。為了適當(dāng)增強(qiáng)雜交體的運(yùn)送可以使用藥物可接受的載體。本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體適當(dāng)?shù)呐浞經(jīng)]有限制地包括局部用藥配方，口服用藥配方，系統(tǒng)或非腸道用藥配方。用藥配方，方法及劑量在下面詳細(xì)描述。
上面所描述的調(diào)節(jié)個(gè)體免疫應(yīng)答的方法，可以應(yīng)用在患有疾病或病況的個(gè)體的治療中。對(duì)其具有認(rèn)為對(duì)于治療患者有益的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的抗原表位是首先要選取的。在一個(gè)實(shí)施方案中，從抗原表位衍生的分子在發(fā)病機(jī)理中起到作用?？商鎿Q地，抗原表位可能在有害的試劑中如病原體上，或在病原體感染細(xì)胞上找到。如本文所使用的，“治療”包括在確定或考慮認(rèn)為患病的個(gè)體中減輕疾病病征或侯征，或控制疾病的發(fā)展。如本文所使用的“預(yù)防”包括在可能還沒(méi)有疾病的可識(shí)別病征或侯征的個(gè)體中，減輕疾病的潛在病因或可能發(fā)病的相關(guān)因子。
疾病可以是由細(xì)菌，病毒，寄生物，真菌，(立克次氏體)richettsia，或其他感染性試劑，或這種試劑的組合引起的或與由其感染相關(guān)的感染性疾病。治療可以針對(duì)疾病的毒素。對(duì)于表位衍生物優(yōu)選的毒素沒(méi)有限制地包括，葡萄球菌腸毒素，中毒性中風(fēng)癥毒素，逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原(如從人類免役缺損病毒衍生的抗原)，鏈球菌抗原，支原體菌屬，分直桿菌屬，以及皰疹病毒。特別優(yōu)選的毒素是SEA，SEB，SE1-3，SED和SEE。疾病或病況可以考慮是自身免役疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，紅斑狼瘡，糖尿病mellitus，重癥肌無(wú)力，甲狀腺炎，硬皮癥，皮膚肌炎，天皰疹，和類似的疾病?？梢杂脕?lái)評(píng)定本發(fā)明的化合物和方法的效果的自身免役疾病的模型系統(tǒng)的實(shí)例是系統(tǒng)性紅斑狼瘡，重癥肌無(wú)力，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，依賴于胰島素的糖尿病mellitus，和實(shí)驗(yàn)變應(yīng)性腦脊髓炎。實(shí)施這些實(shí)驗(yàn)的方法在Clark等人的(1994)美國(guó)專利No.5,284,935中提供，專利的內(nèi)容參考收入本篇。
可以考慮認(rèn)為是變應(yīng)性過(guò)程的疾病和病況如，哮喘，枯草熱，過(guò)敏性鼻炎，局部皮炎，結(jié)腸炎，以及其他這種由特殊過(guò)敏原或非確定過(guò)敏原引起或相關(guān)的過(guò)程。這種過(guò)敏原的實(shí)例有植物，動(dòng)物，細(xì)菌，寄生性過(guò)敏原和引起接觸性過(guò)敏的金屬基過(guò)敏原。使用的本發(fā)明中的優(yōu)選的過(guò)敏原是種子，草，花生，螨蟲，跳蚤和貓過(guò)敏原。
或者可替換地，疾病或病況可以是增殖或惡性過(guò)程，如癌癥，良性前列腺肥大，牛皮癬，腺瘤或其他內(nèi)部器官的細(xì)胞增殖，或?qū)Σ《净蚱渌腥拘?，刺激性或環(huán)境過(guò)程應(yīng)答的細(xì)胞增殖。
如使用在本文中的，“哺乳動(dòng)物”意指包括人類物種以及所有其他哺乳動(dòng)物物種。本發(fā)明的化合物和方法可以使用在在所有哺乳動(dòng)物物種的個(gè)體中產(chǎn)生的疾病或病況的治療中。如本文所使用的，“個(gè)體”是指任何一種哺乳動(dòng)物物種，包括人類物種。在人類物種個(gè)體中產(chǎn)生的疾病或病況，如本文實(shí)施例中所提及的，應(yīng)包括在其他物種產(chǎn)生的，是由相同的有機(jī)體或致病過(guò)程引起的，或由相關(guān)的有機(jī)體或致病過(guò)程引起的，或由未知或其他已知有機(jī)體和/或致病過(guò)程引起的可比疾病或病況。如本文所使用的，“醫(yī)師”也包括獸醫(yī)，或參與診斷和/或治療哺乳動(dòng)物個(gè)體的任何個(gè)體。
本發(fā)明還提供了在適當(dāng)?shù)乃幬锱浞街杏糜诜玫幕衔?，如化合物藥物，化合物前體藥物，或化合物代謝藥物。“服用”或“服用化合物”可以理解為將本發(fā)明的化合物以化合物藥物，化合物前體藥物，或化合物代謝藥物提供給需要治療或預(yù)防疾病的個(gè)體。這樣的藥物含有一種或多種本發(fā)明的雜交體多肽作為主要或要素活性組分，使用在一種或多種上述疾病或病況的治療或預(yù)防中，這樣的藥物可以以多種治療劑型在用于局部用藥，口服用藥，系統(tǒng)用藥，和非腸道用藥的傳統(tǒng)載體中服用。依據(jù)要進(jìn)行治療的疾病或病況，用藥途徑和用藥法是變化的，并且是由熟練的技術(shù)人員來(lái)確定。例如，化合物可以以口服劑型用藥，如以片劑，膠囊(每個(gè)包括定時(shí)釋放配方和持續(xù)釋放配方)，丸劑，粉末，粒劑，酏劑，酊劑，溶液，懸浮液，糖漿和乳液，或者化合物可以通過(guò)注射服用。同樣，它們也可以以靜脈內(nèi)(通過(guò)大丸劑或灌注法)，腹腔內(nèi)，皮下，有或沒(méi)有閉塞的局部，或肌肉內(nèi)方式用藥。所有這些方式對(duì)制藥領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是眾所周知的。
產(chǎn)品的每日劑量可以在每天每位成人0.001毫克到1000毫克的范圍內(nèi)變化。對(duì)于口服用藥，組合物優(yōu)選地以含有0.001毫克到1000毫克的活性組分的片劑形式提供，優(yōu)選地含有0.001，0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.5，10.0，20.0，50.0，100.0毫克活性組分，在治療過(guò)程中根據(jù)患者的病征或侯征進(jìn)行侯征調(diào)節(jié)劑量。有效量的藥物通常以從每天每公斤體重約0.0001毫克到約50毫克劑量提供。這個(gè)范圍更具體地從每天每公斤體重約0.0001毫克到約7毫克。
有益地，本發(fā)明適當(dāng)?shù)呐浞娇梢砸悦刻靻我粍┬头?，或者可以將每天的總劑量分開(kāi)服用，如分成兩次，三次或四次每天。本發(fā)明增強(qiáng)雜交體多肽可用來(lái)制備治療上述疾病或病況的藥物或藥劑。并且，本發(fā)明的化合物可以以鼻內(nèi)用藥方式服用，通過(guò)局部使用適當(dāng)?shù)谋莾?nèi)載體，或者通過(guò)經(jīng)皮途徑用藥，通過(guò)使用此領(lǐng)域中普通技術(shù)人員眾所周知的經(jīng)皮貼片。為了以經(jīng)皮給藥系統(tǒng)形式服用，在用藥過(guò)程中當(dāng)然應(yīng)使用連續(xù)用藥，而不是間斷用藥。
為了治療或預(yù)防疾病，本發(fā)明的雜交體多肽可以以藥物組合物服用，藥物組合物包括活性組分和適于局部用藥使用的藥物可接受的載體。局部用藥藥物組合物可以是溶液，霜?jiǎng)?，膏劑，膠體，洗液，香波，或適于皮膚涂用的氣霧劑形式的。這些含有本發(fā)明的化合物的局部藥物組合物一般包括約占含有藥物可接受的載體的混合物的0.005％到5％重量比的活性組分。
為了治療及預(yù)防疾病和病況，如上面所列出的，本發(fā)明的雜交體可以與其他已知用來(lái)治療這種疾病和病況的試劑一起使用。對(duì)于使用多于一種活性試劑的組合治療，在活性試劑可以同時(shí)服用的情況中，活性試劑可以同時(shí)服用，或者它們可以在錯(cuò)開(kāi)分別服用。
使用在本發(fā)明組合物中的劑量用法可以依據(jù)多種因素來(lái)選取，包括如類型，物種，年齡，體重，性別和患者的醫(yī)療狀況，要治療的病況的嚴(yán)重性，以及使用的本發(fā)明的具體化合物。具有普通技術(shù)的醫(yī)師可以方便地確定并開(kāi)出預(yù)防，減輕，或控制疾病和病況所需的有效量的藥物的處方。獲得產(chǎn)生效力并且沒(méi)有毒性或具有可接受毒性的藥物濃度的最佳精確決定需要依據(jù)藥物對(duì)于靶位點(diǎn)的有效性的動(dòng)力學(xué)的用藥體制。這個(gè)過(guò)程涉及藥物的分配，平衡，和排除，這在熟練技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的方法中，本文詳細(xì)描述的化合物可以制成活性組分，并且可以與適當(dāng)?shù)乃幬锵♂寗?，賦形劑或考慮到所需的服用方式選取的并與傳統(tǒng)制藥慣例一致的carder(統(tǒng)一稱為“carder物料”)形成的混合物一起服用，carder有口服片劑，膠囊，酏劑，糖漿，等等。例如，對(duì)于片劑或膠囊形式的口服用藥方式，活性藥物組分可以與口服、無(wú)毒性藥物可接受的惰性載體組合，惰性載體有乙醇，甘油，水，等等。并且，當(dāng)需要時(shí)，適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合劑，潤(rùn)滑劑分解試劑和著色劑也可以摻入到混合物中。適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合劑沒(méi)有限制地包括，淀粉，凝膠，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，谷類甜味劑，天然或合成的樹(shù)膠，如阿拉伯膠，黃芪膠，或藻酸鈉，羥甲基纖維素，聚乙烯乙二醇，蠟等等。使用在這些劑型中的潤(rùn)滑劑沒(méi)有限制地包括油酸鈉，硬脂酸鈉，苯甲酸鈉，乙酸鈉，氯化鈉等等。分解試劑沒(méi)有限制地包括淀粉，甲基纖維素，aga，斑脫土，黃原膠等等。
液體形式可以是適當(dāng)?shù)卣{(diào)味的懸浮或分散試劑，如合成的及天然的樹(shù)膠，例如，黃芪膠，阿拉伯膠，甲基纖維素等等?？梢允褂玫钠渌稚⒃噭┦歉视偷?。對(duì)于非腸道用藥，無(wú)菌懸浮液是所需溶液。當(dāng)靜脈內(nèi)用藥時(shí)，通常含有適當(dāng)防腐劑的等張predation是所需的。
含有活性藥物組分的局部用藥制備品可以與此領(lǐng)域中眾所周知的多種載體物質(zhì)混合，如醇，蘆薈凝膠(aloe vera gel)，allatoin，甘油，維生素A或E油，礦物油，PPG2丙酸肉豆蔻酯，等等，形成醇溶液，局部清洗劑，清洗霜?jiǎng)?，皮膚凝膠，皮膚洗液，以及凝膠或霜?jiǎng)┡浞降南悴ā?br> 本發(fā)明雜交體也可以以微脂粒給藥系統(tǒng)的形式服用，如，小單層囊，大單層囊和多層囊。微脂?？蓮亩喾N化合物制成，如膽固醇，硬脂酰胺磷脂酰膽堿。
本發(fā)明的雜交體多肽及其配方可以與生物可降解類聚合物結(jié)合使用，用來(lái)獲得控釋藥，如聚乳酸，polyepsilon己內(nèi)酯，多羥基酪酸，聚原酸酯，聚縮醛，聚二氫吡喃，聚氰基丙烯酸鹽，和水凝膠交聯(lián)的或兩性分子嵌段共聚物。
本發(fā)明的雜交體多肽及其配方可使用方便獲得的原材料，試劑并通過(guò)傳統(tǒng)的合成法來(lái)制備。在這些反應(yīng)中，也可以使用此領(lǐng)域中普通技術(shù)人員眾所周知的，但在本文中沒(méi)有詳細(xì)描述的變通方法。
作為將本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體直接給個(gè)體服用以增強(qiáng)抗原表位向個(gè)體的T淋巴細(xì)胞呈遞MHC II類分子的一種選擇，可以從個(gè)體獲得抗原呈遞細(xì)胞種群，并在體外用本發(fā)明增強(qiáng)的雜交體治療。將這些細(xì)胞在適于雜交體與抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子結(jié)合的條件下用增強(qiáng)的雜交體治療。治療后，在促進(jìn)治療的細(xì)胞與個(gè)體T淋巴細(xì)胞接觸的條件下，將抗原呈遞細(xì)胞給個(gè)體服用。如上面所描述的，對(duì)免疫應(yīng)答的影響，增強(qiáng)或抑制，將取決于哪一種T細(xì)胞亞集優(yōu)先受到增強(qiáng)雜交體的刺激。對(duì)免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用可能對(duì)于抗癌細(xì)胞或感染有機(jī)體的細(xì)胞毒性應(yīng)答有有益的影響?？商鎿Q地，增強(qiáng)T抑制性細(xì)胞應(yīng)答可能對(duì)抑制對(duì)特異分子的免疫應(yīng)答有影響。當(dāng)使用從自身免疫疾病的病因?qū)W抗原獲得的抗原表位時(shí)，這樣的抑制作用可以具有治療效果，自身免疫疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，重癥肌無(wú)力，或紅斑狼瘡。使用本發(fā)明的化合物和方法體外治療從患者獲取的細(xì)胞的方法和過(guò)程可遵從于下列專利，這些專利文獻(xiàn)的參考收入本篇Rosenberg(1998)美國(guó)專利No.5,126,132；Chada等人(1997)美國(guó)專利No.5,693,522；Kriegler等人(1998)美國(guó)專利No.5,849,586；Gruber等人(1999)美國(guó)專利No.5,856,185；和Kriegler等人(1999)美國(guó)專利No.5,874,077。
在另一個(gè)方面中，使用Celis等人(1998)美國(guó)專利No.5,846,827中所描述的化合物和方法，本發(fā)明的化合物和方法可在體外條件下使用，以促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，上述專利文獻(xiàn)的內(nèi)容參考收入本篇。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種抑制MHC II類限制性抗原肽向T淋巴細(xì)胞呈遞的方法。如上面所討論的，抗原結(jié)合位點(diǎn)配體組成結(jié)合在主要組織相容性II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的任何肽或分子，這樣的分子可以或可以不具有T淋巴細(xì)胞刺激活性?？乖Y(jié)合位點(diǎn)配體與Ii-Key同系物的結(jié)合(通過(guò)間隔基)，產(chǎn)生了具有抑制MHC II類限制性抗原呈遞的增強(qiáng)活性的雜交體。為了抑制MHC II類限制性抗原表位向T淋巴細(xì)胞的呈遞，將抗原呈遞抑制雜交體多肽與MHC II類表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞接觸，MHC II類表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞在其表面展示MHC II類限制性T淋巴細(xì)胞-呈遞的抗原表位。這種作用的結(jié)果調(diào)節(jié)了對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子呈遞抗原表位的應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞功能。
體外測(cè)試顯示對(duì)抗原表位向T細(xì)胞呈遞的抑制作用在R.Humphrey(1996)美國(guó)專利No.5,559,028；和Humphrey等人(1999)美國(guó)專利No.5,919,639中提供，這些專利的內(nèi)容參考收入本篇。雜交體的生物活性，如抑制抗原-特異T淋巴細(xì)胞活化的能力，也可以在多種系統(tǒng)中得到測(cè)試。在一個(gè)示例性方案中，將過(guò)量的雜交體與已知的MHC表達(dá)(如HLA-DR1)的抗原呈遞細(xì)胞，已知抗原特異性的T細(xì)胞克隆體(破傷風(fēng)毒素(830-843)和MHC限制(又，DR1))，和抗原肽本身(破傷風(fēng)毒素(830-843))一起溫育。將測(cè)試培養(yǎng)物溫域足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使T細(xì)胞增殖，如1到4天，然后定量增殖。定量可以通過(guò)在最后18小時(shí)溫育中用氚化胸苷脈沖來(lái)實(shí)施，或通過(guò)將上清液流體轉(zhuǎn)移到HT-2細(xì)胞的第二培養(yǎng)物中來(lái)實(shí)施，T細(xì)胞的增殖取決于應(yīng)答T細(xì)胞的白細(xì)胞介素釋放并且通過(guò)在最后18小時(shí)溫育中用氚化胸苷脈沖來(lái)測(cè)定。然后計(jì)算相對(duì)與沒(méi)有接受抑制劑的對(duì)照物的抑制作用百分比。在體外測(cè)試中雜交體和其他抗原呈遞抑制劑的能力可以與這種化合物體內(nèi)抑制免疫應(yīng)答的能力相關(guān)聯(lián)。體內(nèi)活性可以通過(guò)動(dòng)物模型確定，如，通過(guò)服用已知限制到由肽識(shí)別的具體MHC分子的抗原，和免疫調(diào)節(jié)雜交體。T淋巴細(xì)胞隨后從動(dòng)物體內(nèi)移出，并與一定劑量范圍的抗原一起培養(yǎng)。通過(guò)傳統(tǒng)方式測(cè)定對(duì)刺激作用的抑制，如通過(guò)用氚化胸苷脈沖，并與適當(dāng)?shù)膶?duì)照物比較。某些試驗(yàn)細(xì)節(jié)對(duì)此領(lǐng)域中的技術(shù)人員是顯然的。
通過(guò)將抗原肽結(jié)合位點(diǎn)配體摻入到本發(fā)明的抑制雜交體中產(chǎn)生增強(qiáng)的活性可以更快更精確地檢測(cè)抑制性活性。這種增強(qiáng)的檢測(cè)作用能確定抑制MHC II類抗原呈遞的新型化合物。在這個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種確定抑制MHC II類抗原呈遞的化合物的方法。這種方法包括提供預(yù)計(jì)是抗原結(jié)合位點(diǎn)配體的候選化合物文庫(kù)，并將每種候選化合物獨(dú)立地通過(guò)間隔基與哺乳動(dòng)物IiKey同系物共價(jià)結(jié)合，這樣Ii Key同系物在N-末端，候選化合物在C-末端。這種產(chǎn)物稱為“候選抗原呈遞抑制雜交體多肽”或“候選抑制雜交體”。然后，通過(guò)將個(gè)體候選抑制雜交體與抗原呈遞細(xì)胞，(抗原呈遞細(xì)胞在其一些HMC II類分子中表達(dá)天然產(chǎn)生序列的抗原肽)，以及對(duì)在抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子中呈遞的抗原表位應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞(也稱為T淋巴細(xì)胞活化測(cè)試法)接觸來(lái)篩查。與對(duì)照反應(yīng)相比，如果候選抑制雜交體的接觸降低了T淋巴細(xì)胞的活化作用，那么就確定了。在試驗(yàn)中確定降低的T淋巴細(xì)胞活化作用說(shuō)明摻入到雜交體中的候選化合物，和候選抑制雜交體本身，都是MHC II類抗原呈遞的抑制劑。
用來(lái)產(chǎn)生候選抑制雜交體的候選化合物可以是天然產(chǎn)生的產(chǎn)物，組合產(chǎn)生的肽，類肽，或其他以及化合物。
本發(fā)明也包括通過(guò)上述方法確定的抑制分子和抑制雜交體。對(duì)于體外應(yīng)用，這種抗原呈遞抑制劑的主要應(yīng)用是體內(nèi)臨床應(yīng)用？？這種雜交體可以應(yīng)用在治療自身免疫疾病中，如上所述。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種通過(guò)抑制對(duì)抗原表位特異的T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答來(lái)治療患有疾病的個(gè)體的治療方法，給個(gè)體服用本發(fā)明的抑制雜交體以抑制個(gè)體的T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答。抑制雜交體的可接受配方和方法以及用藥法與上面所描述的本發(fā)明的增強(qiáng)雜交體的配方和方法以及用藥法相對(duì)應(yīng)。
本發(fā)明的化合物和方法不同于Kappler等人的(1998)美國(guó)專利No.5,820,866中的化合物和方法，專利文獻(xiàn)的內(nèi)容參考收入本篇，不同之處在于本發(fā)明中的抗原肽是結(jié)合在在各自位點(diǎn)上非共價(jià)結(jié)合在MHC II類分子上的Ii蛋白質(zhì)的片段上的，而不是共價(jià)結(jié)合在兩條MHC II類分子鏈中一條鏈的N-末端的。此外，本發(fā)明還包括其中抗原肽與其他化合物結(jié)合的構(gòu)建，其他化合物用適當(dāng)?shù)挠H和力與MHC II類分子結(jié)合(不需要在Ii Key同系物的結(jié)合位點(diǎn)上)，或包括其中抗原肽與其他細(xì)胞表面蛋白質(zhì)結(jié)合的構(gòu)建，如CD4，其與MHC II類分子和T細(xì)胞受體結(jié)合形成的復(fù)合體相互作用，如在抗原呈遞細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞之間。這樣的雜交體可以從MHC II類分子的結(jié)構(gòu)模型中設(shè)計(jì)出來(lái)，如通過(guò)傳統(tǒng)的藥物設(shè)計(jì)方法，或如在本文其他地方所描述的，通過(guò)篩查組合合成的產(chǎn)物，或篩查分離的天然產(chǎn)物。
本發(fā)明的化合物和方法不同于Clark等人的(1994)美國(guó)專利No,5,284,935中的化合物和方法，該專利內(nèi)容參考收入本篇，不同之處在于，在本發(fā)明的化合物中，毒素是綴合在MHC II類分子上或綴合在復(fù)合體的抗原肽上的，其中抗原肽共價(jià)結(jié)合在MHC II類分子上，如結(jié)合在MHC Ii類分子一條鏈的N-末端。
本發(fā)明的化合物和方法不同于Stanton等人的(1998)美國(guó)專利No.5,807,552總的化合物和方法，該專利內(nèi)容參考收入本篇，不同之處在于，在所引用發(fā)明的化合物中，抗原肽通過(guò)兩性分子螺旋狀肽的片段結(jié)合，以產(chǎn)生周期隔開(kāi)的抗原表位的非共價(jià)結(jié)合多聚體的方式相互作用。
本發(fā)明的化合物和方法不同于包括在Ii蛋白質(zhì)的序列中被取代的抗原表位的化合物和方法，其中修飾的Ii序列在將修飾基因轉(zhuǎn)染到抗原呈遞細(xì)胞中后表達(dá)(Barton等人，國(guó)際免疫學(xué)，101159(1998)；Fujii等人，人類免疫學(xué)，59607(1998)；Malcherek等人，歐洲免疫學(xué)期刊，281524(1998)；Sutmptner等人，EMBO期刊165807(1997)；Van Bergen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 947499(1997))。至少，這樣的構(gòu)建有利于定向在Ii蛋白質(zhì)和MHC II類分子之間形成的復(fù)合體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到后-Golgi區(qū)室，以進(jìn)行抗原/Ii蛋白質(zhì)處理和MHC II類肽荷電(Bakke等人，細(xì)胞16707(1990)；Lamb等人，免疫學(xué)期刊1483478(1992))因此，涉及本發(fā)明的分子和細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理沒(méi)有很好地開(kāi)發(fā)。
根據(jù)當(dāng)前的公開(kāi)內(nèi)容，常規(guī)試驗(yàn)將可以發(fā)展出新型的治療方法。雖然在下面實(shí)施例部分列出的數(shù)據(jù)是中實(shí)施鼠科動(dòng)物生物學(xué)活性測(cè)試的試驗(yàn)中獲得的，但是在體外生理學(xué)條件下使用人類細(xì)胞也可以得到相似的結(jié)果。常規(guī)試驗(yàn)就可以優(yōu)化從Ii-Key序列衍生的雜交體構(gòu)建的片段和間隔基的片段。
在雜交體設(shè)計(jì)中的第一個(gè)結(jié)構(gòu)問(wèn)題是活性所必需的Ii-Key核心肽的范圍。Ii-Key肽LRMK(SEQ ID NO3)的最小活性序列用來(lái)制備在本項(xiàng)研究中進(jìn)行測(cè)試的雜交體。預(yù)先確定的這種四肽保持了在對(duì)抗原肽對(duì)MHC II類分子的呈遞作用影響的測(cè)試中測(cè)試的Ii-Key肽系列的任何肽的至少50％最大活性(Adams等人，歐洲免疫學(xué)期刊，251693(1995)；Adams等人，Arzneim，F(xiàn)orsch./藥物研究471069(1997))。在Ii蛋白質(zhì)序列中，具有從LRMK(SEQ ID NO3)C-末端延伸的其他殘基的肽，在將肽荷電增強(qiáng)到MHC II類分子中的基礎(chǔ)測(cè)試中已確定表現(xiàn)出較大的活性。然而，對(duì)于這個(gè)系列的同系物，Ii-Key肽部分保持持續(xù)使用LRMK(SEQ ID NO3)。
在這個(gè)系列的雜交體肽中抗原表位也是保持不變的。其是鴿細(xì)胞色素C(PGCC)抗原表位PGCC 95-104 IAYLKQATAK(SEQ ID NO8)。
列在表1中的系列雜交體設(shè)計(jì)用來(lái)測(cè)試間隔基的長(zhǎng)度和組合對(duì)活性的影響。設(shè)計(jì)這個(gè)系列的化合物的推理是從(部分地)有關(guān)Ii蛋白質(zhì)衍生的肽和抗原肽是如何結(jié)合到MHC II類分子的抗原肽結(jié)合溝中的知識(shí)中吸取的。使用從流感病毒紅血球凝聚素獲得的抗原肽，HA(307-319)(Stern等人，自然，378215-221)，和Ii-蛋白質(zhì)衍生肽，稱為裂解亮肽素-誘導(dǎo)肽(CLIP)的Ii(86-102)(Ghosh等人，自然，378457-462(1995))推斷的X-射線結(jié)晶學(xué)分析揭示了在HLA-DR1，MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中兩種肽的分子取向。在抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中定位的位置CLIP在缺失HLA-DM分子的細(xì)胞系中被鑒別到，HLA-DM分子的作用是將弱結(jié)合肽，包括CLIP移出，換成更牢固結(jié)合的抗原肽(Sette等人，科學(xué)2581801(1992)；Avva等人，免疫學(xué)1763-772(1994)；Sloan等人，自然375802-805(1995)；Dennzin等人，細(xì)胞，82155-163(1995))。Ii-Key的核心，LRMK(SEQ ID NO3)在已經(jīng)鑒別的CLIP系列中最長(zhǎng)的肽的N-末端的末梢(Chicz等人，自然358764(1992))。然而，Ii-Key肽(從LRMK(SEQ ID NO3)的C-末端延伸的)系列的較長(zhǎng)的同系物與CLIP較長(zhǎng)形式的N-末端的初級(jí)氨基酸序列重疊。
表I中的雜交體6是由Ii-Key核心序列LRMK(SEQ ID NO3)組成的雜交體，通過(guò)Ii蛋白質(zhì)殘基LPKSAKPVSK(SEQ IDNO12)間隔基的延伸到C-末端，延伸到抗原表位IAYLKQATAK(SEQ ID NO8)。要作為“引用雜交體”的間隔基片段的Ii蛋白質(zhì)序列的這種排布可以通過(guò)將雜交體6的結(jié)晶學(xué)成像與預(yù)先通過(guò)X-射線結(jié)晶學(xué)產(chǎn)生的兩個(gè)各自的成像重疊獲得。這兩個(gè)成像是結(jié)合到HLA-DR1 MHC II類分子結(jié)合袋中的HA(307-319)的成像和CLIP的成像(Stern等人，自然，378215-221(1994)，Ghosh等人，自然，378457-462(1995))。在這兩個(gè)結(jié)晶學(xué)成像中，HLA-DR1 MHC II類分子的P1疏水袋填充了CLIP的Ii序列的蛋氨酸99，或填充了HA(307-319)肽的亮氨酸87?？梢院侠淼仡A(yù)測(cè)，PGCC(95-104)的Ile95也將存在與疏水P1袋中。因此，雜交體包括Ii蛋白質(zhì)序列通過(guò)賴氨酸90之后到具有PGCC(95-104)序列的雜交體的C末端。在Ii蛋白質(zhì)和抗原肽序列之間雜交體序列的交換出現(xiàn)在預(yù)計(jì)結(jié)合到HLA-DR1的P1疏水袋的殘基位置之前。
仔細(xì)考慮Ii和抗原肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和排布為聚脯氨酰II類(PPII)螺旋體，在抗原肽結(jié)合溝的溝內(nèi)，設(shè)計(jì)出剩余雜交體肽。X-射線結(jié)晶學(xué)成像顯示CLIP和抗原肽每個(gè)都在聚脯氨酰II類螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)中卷曲。在這種類型的螺旋體中，每個(gè)回轉(zhuǎn)的氨基酸重復(fù)頻率為3.0個(gè)氨基酸，相反在已充分了解的α-螺旋中發(fā)現(xiàn)每個(gè)回轉(zhuǎn)氨基酸重復(fù)頻率為3.2個(gè)氨基酸。沿著兩種類型螺旋的縱向軸看去，PPII螺旋比α-螺旋中發(fā)現(xiàn)的每個(gè)回轉(zhuǎn)伸展約兩倍的距離。PPII螺旋不具有穩(wěn)定α-螺旋的內(nèi)回轉(zhuǎn)氫鍵。也就是，在α-螺旋中殘基I的肽酰主鏈酰亞胺部分氫鍵結(jié)合殘基I+3的肽酰主鏈羰基。由于這種沿著肽酰主鏈的回轉(zhuǎn)的內(nèi)在穩(wěn)定作用，α-螺旋形成能量相對(duì)強(qiáng)的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些螺旋可以在蛋白質(zhì)內(nèi)折疊，彼此折疊及折疊在其他局部二級(jí)結(jié)構(gòu)上。相反，PPII構(gòu)型使用在蛋白質(zhì)中，作為蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的識(shí)別單元。這樣的PPII螺旋發(fā)現(xiàn)在SR-1區(qū)域內(nèi)調(diào)節(jié)跨膜受體的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的識(shí)別作用，識(shí)別作用通過(guò)一些細(xì)胞表面事件(在結(jié)構(gòu)或空間方面)來(lái)改變。T細(xì)胞識(shí)別的抗原表位也是如PPII結(jié)構(gòu)的卷曲。這樣的PPII結(jié)構(gòu)具有比α-螺旋可能具有的展示抗原序列的可變側(cè)鏈的區(qū)域要寬。這樣產(chǎn)生等邊的金字塔結(jié)構(gòu)，其中在MHC II類分子的抗原肽結(jié)合裂縫的底部沿著抗原肽螺旋的一個(gè)脊部的殘基結(jié)合到疏水袋中。沿著抗原肽PPII螺旋的另外兩個(gè)脊部的側(cè)鏈暴露在沿著MHC分子表面的淺袋中，以與T細(xì)胞受體相互作用。當(dāng)序列是PPII螺旋而不是α-螺旋時(shí)，大約兩倍于MHC II類和TCR分子側(cè)鏈原子的原子可以接觸抗原序列的每條側(cè)鏈。在兩個(gè)反平行螺旋之間的抗原肽結(jié)合槽中，結(jié)合肽的PPII螺旋構(gòu)型在N-末端延伸至少5個(gè)殘基的位置超過(guò)通常鑒別的抗原表位的第一個(gè)殘基。Ii序列的p87的特點(diǎn)在于，在兩個(gè)反平行α-螺旋形成的槽的末端的X-射線的結(jié)晶成像，在兩個(gè)反平行α-螺旋之間是CLIP或是抗原肽。
模擬連接Ii-Key核心結(jié)構(gòu)LRMK(SEQ ID NO3)和抗原表位IAYLKQATAK(SEQ ID NO8)的雜交體可能的相互作用，產(chǎn)生有關(guān)在連接LRMK(SEQ ID NO3)功能基團(tuán)和抗原肽的雜交體的間隔基中原子與MHC II類分子(表1)相互作用的結(jié)構(gòu)需求的幾種假設(shè)。在一種假設(shè)中，僅當(dāng)間隔基是卷曲如PPII螺旋時(shí)，間隔基的氨基酸側(cè)鏈的原子最理想地與MHC II類分子的特異殘基相互作用。這個(gè)觀點(diǎn)可使用雜交體6測(cè)試。在這種雜交體中，全部10個(gè)氨基酸殘基立即C-末端與Ii蛋白質(zhì)序列中的LRMK91(SEQ ID NO3)結(jié)合，組成間隔基，保留在X-射線結(jié)晶學(xué)模式重疊時(shí)觀察到的CLIP的Ii蛋白質(zhì)序列和HA抗原肽之間的配準(zhǔn)。如果雜交體6是唯一具有生物活性的測(cè)試雜交體，那么可以得出結(jié)論，在槽末端中的MHC II類殘基到抗原序列的第一殘基一定是接觸的。
另一個(gè)可替換的假設(shè)是，僅有一些間隔基中的殘基在雜交體肽中是功能上需要的。雜交體5(表I)設(shè)計(jì)成這樣的，直接C-末端結(jié)合在Ii蛋白質(zhì)序列中的LRMK91(SEQ ID NO3)的僅前七個(gè)殘基，作為間隔基存在。在雜交體4中，直接C-末端結(jié)合在Ii蛋白質(zhì)序列中的LRMK91(SEQ ID NO3)的僅前四個(gè)殘基，作為間隔基存在。如果雜交體4和5與雜交體6相比具有活性，那么這種發(fā)現(xiàn)說(shuō)明作為聚脯氨酰II類(PPII)螺旋的間插片段的二級(jí)結(jié)構(gòu)是不重要的。這種發(fā)現(xiàn)也促使人們進(jìn)行對(duì)MHC II類分子中重要的接觸殘基的研究，及對(duì)這種相互作用重要的推測(cè)主鏈位置(如，肽酰羰基或亞氨基殘基)的研究。
對(duì)其他雜交體測(cè)試間隔基的Ii蛋白質(zhì)序列的外在殘基的需求，找到對(duì)間隔基序列中Ii蛋白質(zhì)的特異殘基的需求，可以支持這樣的間隔基一定在其活性位點(diǎn)是如PPII螺旋的卷曲的觀點(diǎn)。在這些雜交體中，將間隔基氨基酸殘基用ε-氨基-戊酸(ava)殘基替換。雜交體3含有兩個(gè)ava殘基，雜交體2含有一個(gè)ava殘基。這些雜交體肽分別是雜交體5和4的同系物。Ava殘基的線性延伸，包括氨基基團(tuán)-亞甲基橋-羧基基團(tuán)，約等于三肽?；鶈卧闹麈滈L(zhǎng)度。在這些“缺失同系物”雜交體4和雜交體5具有生物活性的情況下，可以得出結(jié)論對(duì)間隔基的側(cè)鏈原子和MHC II類抗原肽結(jié)合溝之間的特異相互作用沒(méi)有功能上的需要。
使用在本項(xiàng)研究中的雜交體肽是在N-末端完全?；?，在C-末端酰胺化的，以抑制肽鏈端解酶的活性。
表I 使用Ii-Key核心基元和抗原表位之間的可變間隔基設(shè)計(jì)雜交體肽
使用在本公開(kāi)中的單個(gè)字母氨基酸代碼表示如下A＝L-丙氨酸，D＝L-天冬氨酸鹽，E＝L-谷氨酸鹽，F(xiàn)＝L-苯丙氨酸，H＝L-組氨酸，I＝L-異亮氨酸，K＝L-賴氨酸，L＝L-亮氨酸，M＝L-蛋氨酸，N＝L-天冬酰胺，P＝L-脯氨酸，R＝L-精氨酸，Q＝L-谷氨酰胺，T＝L-蘇氨酸，Y＝L-酪氨酸Ava＝5氨基戊酸(ε-氨基-n-戊酸)。
表I中的肽由Commonwealth生物技術(shù)有限公司(601Biotech Drive，Richmond VA 23225)合成。每種肽的純度和組合通過(guò)HPLC分離和質(zhì)譜測(cè)定法確定。
實(shí)施例2 雜交體肽的生物活性列在表I中的肽系列的生物活性通過(guò)T雜交瘤應(yīng)答測(cè)試來(lái)確定。將對(duì)天蛾幼蟲(Hornworm moth)細(xì)胞C表位IAVLKQATAK(SEQ ID NO8)特異的T細(xì)胞雜交瘤用抗原肽或用列在表I中的核心Ii-Key序列的抗原肽的雜交體系列中的雜交體來(lái)刺激。將雜交體與不同長(zhǎng)度的間隔基連接。間隔基含有Ii蛋白質(zhì)天然序列的氨基酸，或5-氨基-n-戊酸(ava；5-氨基戊酸)的亞甲基(-CH2-)基團(tuán)。將抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞雜交瘤的培養(yǎng)物與抗原肽的系列1∶4稀釋液(從3μM)一起溫育。通過(guò)測(cè)定抗原刺激培養(yǎng)物(24小時(shí)刺激作用)的上清液已被轉(zhuǎn)移到其中的HT-2培養(yǎng)物對(duì)氚化胸苷的吸收來(lái)確定應(yīng)答。對(duì)雜交體1，抗原肽應(yīng)答的半最大值終點(diǎn)約為20nm。用雜交體5和2刺激的半最大值終點(diǎn)約為50Pm。具有亞甲基間隔基的雜交體，雜交體2和3的活性，可以與具有Ii蛋白質(zhì)天然序列的雜交體的活性相比。這些試驗(yàn)說(shuō)明了Ii-Key核心序列和抗原肽之間的雜交體的體外效用。
這些試驗(yàn)的結(jié)果顯示有效的治療作用是由Ii-Key核心序列(如，LRMK，SEQ ID NO3)通過(guò)柔性鏈與選取的抗原表位共價(jià)雜交而產(chǎn)生的。柔性鏈可以在長(zhǎng)度從3個(gè)到6個(gè)肽酰單元延伸，并且可以由不以任何空間不同的方式氫鍵結(jié)合MHC II類分子的簡(jiǎn)單的重復(fù)單元構(gòu)成。這種短且簡(jiǎn)單的柔性間隔基產(chǎn)生比由特異氨基酸殘基組成的較長(zhǎng)的間隔基增加的活性，如雜交體7的次-最大活性所示，雜交體7具有由天然存于與Ii蛋白質(zhì)中的LRMK(SEQ ID NO3)和推定交換位點(diǎn)之間CLIP和抗原肽之間的10個(gè)氨基酸組成的間隔基，如結(jié)晶學(xué)成像數(shù)據(jù)所示。
表II 增強(qiáng)的T細(xì)胞對(duì)包含Ii Key核心序列，可變間隔基，和抗原肽的雜交體增殖性應(yīng)答
對(duì)表II的說(shuō)明。在每分鐘上千次計(jì)數(shù)中，對(duì)抗原表位的免疫應(yīng)答與從3μM備用溶液的雜交體(1∶4)系列稀釋液的稀釋因子有關(guān)。試驗(yàn)對(duì)于這項(xiàng)測(cè)試，將下列組成同時(shí)加入到初級(jí)培養(yǎng)物中(a)含有抗原表位的雜交體肽(表I)；(b)絲裂霉素C-處理的，帶有結(jié)合特異抗原肽及其呈遞到抗原肽-特異T細(xì)胞雜交瘤上所需的MHC II類等位基因的MHC II類正性抗原呈遞細(xì)胞(APC)；(c)對(duì)抗原肽和限制其呈遞的MHC II類等位基因特異的MHC II類等位基因-限制的T細(xì)胞雜交瘤。在這種初級(jí)培養(yǎng)物溫育的最后，將培養(yǎng)物的上清液等分份轉(zhuǎn)移到第二培養(yǎng)皿中，與依賴于白細(xì)胞介素的成淋巴細(xì)胞(lymphoblastoid)細(xì)胞種系一起溫育。通過(guò)確定氚化胸苷脫氧核糖(3[H]TdR)在第二培養(yǎng)物的HT-2指示細(xì)胞的DNA中的吸收量，來(lái)測(cè)定在初級(jí)培養(yǎng)物中從活化的T細(xì)胞雜交瘤釋放的白細(xì)胞介素對(duì)第二指示細(xì)胞的刺激作用。
Ii-Key核心序列LRMK(SEQ ID NO3)和PGCC95-104(鴿細(xì)胞色素C95-104，IAYLKQATAK(SEQ ID NO8))之間的雜交體由Ek呈遞。將肽溶解到磷酸緩沖液鹽水(PBS；0.01M磷酸鈉緩沖液，PH7.2，0.1M氯化鈉)中。通過(guò)過(guò)濾對(duì)溶液除菌。TPc9.1T雜交瘤對(duì)呈遞在鼠科動(dòng)物II類MHC等位基因Ek上的鴿細(xì)胞色素C81-104肽特異。將表達(dá)H-2k等位基因的CH27 B細(xì)胞淋巴瘤用作為抗原呈遞細(xì)胞。
通過(guò)下列過(guò)程測(cè)定抗原肽-特異T細(xì)胞活化作用。通過(guò)將5×106細(xì)胞/毫升和0.25毫克/毫升的絲裂霉素C(Sigma)在37℃在改進(jìn)eagle培養(yǎng)基(DMEM)/10mM N-2(羥乙基哌嗪-N’[2-乙磺酸])(HEPES)中溫育20分鐘，接著用四倍體積的DMEM-5％牛胎血清(FCS)沖洗兩次產(chǎn)生絲裂霉素C-處理的CH28細(xì)胞(AkEk)APC。在每次測(cè)試前，將T細(xì)胞雜交瘤在2200rad照射。
對(duì)于初級(jí)培養(yǎng)物的測(cè)試，將5×104絲裂霉素C-處理的APC，5×104T雜交瘤細(xì)胞和從3μM含抗原表位的肽獲得的系列1∶4稀釋液在PH7.2-7.4，完全DMEN-5％FCS，10mMHEPES，1X非必需氨基酸(Sigma)，1mM丙酮酸鈉，2mM L-谷氨酰胺，100U/毫升青霉素G，100μg/毫升硫酸鏈霉素，5×10-5M 2-巰基乙醇(2-ME)中培養(yǎng)。對(duì)僅含T雜交瘤細(xì)胞(T)+APC的培養(yǎng)皿監(jiān)測(cè)背景T細(xì)胞活化作用；對(duì)含T+APC+抗原肽的培養(yǎng)皿監(jiān)測(cè)每種AE101系列肽對(duì)非-特異T雜交瘤的活化作用。將每份培養(yǎng)物的上清液(20，40或75μl等分份)移出，24小時(shí)后，測(cè)定它們對(duì)1×104依賴于白細(xì)胞介素的HT-2成淋巴細(xì)胞(分別加入到140，120或75μl完全Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)1640緩沖液-5％FCS中)生長(zhǎng)的影響，在24小時(shí)HT-2測(cè)試的最后5個(gè)小時(shí)，摻入3[H]TdR，加入1μCi/培養(yǎng)皿進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于所有測(cè)試，記錄的數(shù)值是三個(gè)培養(yǎng)皿的平均值，平均標(biāo)準(zhǔn)誤差少于±10％。由于在測(cè)試中刺激作用是變化的，所以，通常在初級(jí)培養(yǎng)物和二級(jí)2-HT指示培養(yǎng)物中為了比較在不同時(shí)間實(shí)施的測(cè)試，標(biāo)準(zhǔn)或參考肽都包括在其中。
權(quán)利要求
1.一種MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽，包括(a)N-末端，包括哺乳動(dòng)物Ii-Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾；(b)C-末端，包括結(jié)合MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)的多肽或類肽結(jié)構(gòu)形式的抗原表位；以及(c)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，共價(jià)結(jié)合雜交體的N-末端和C-末端組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽，其中間插化學(xué)結(jié)構(gòu)不能以如何空間不同的方式氫鍵結(jié)合MHC II類分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽，其中間插化學(xué)結(jié)構(gòu)是同樣乙線性方式排列的長(zhǎng)度約為4到6個(gè)氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽，其中Ii Key肽通過(guò)C-末端截短到LRMK(SEQ ID NO3)來(lái)修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽，其中多肽是從下列組中選取的，包括Ac-LRMK(SEQID NO3)-5-氨基pentanoly-IAYLKQATAK(SEQ IDNO8)NH2，Ac-LRMK(SEQ ID NO3)-5-氨基pentanoly-5-氨基pentanoly-IAYLKQATAK(SEQ ID NO8)NH2，Ac-LRMKLPKSIAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO9)，Ac-LRMKLPKSAKPIAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO10)，和Ac-LRMKLPKSAKPVSKIAYLKQATAK-NH2(SEQ ID NO11)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽，其中對(duì)Ii Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)的修飾是從下列組中選取的，包括(a)從N-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸；(b)從C-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸；(c)保護(hù)N-末端；(d)氨基酸取代；(e)產(chǎn)生環(huán)化衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽，其中對(duì)Ii Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)的修飾是用下列組中的分子取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，包括(a)類肽結(jié)構(gòu)；(b)D-異構(gòu)體氨基酸；(c)N-甲基氨基酸；(d)L-異構(gòu)體氨基酸；(e)修飾的L-異構(gòu)體氨基酸；以及(f)環(huán)化衍生物。
8.一種鑒別在MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體中以與Ii Key肽等同的方式起作用的分子的方法，包括(a)提供候選分子的文庫(kù)，將文庫(kù)中的每種候選分子在其C-末端與結(jié)合到MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的抗原表位共價(jià)結(jié)合，候選化合物和抗原表位通過(guò)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合形成雜交體，間插化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列；(b)使用T細(xì)胞雜交瘤應(yīng)答測(cè)試從步驟(a)中鑒別具有抗原呈遞增強(qiáng)活性的雜交體，T細(xì)胞雜交瘤應(yīng)答測(cè)試對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子中的抗原表位特異，鑒別特異雜交體確定摻入到所鑒別的雜交體的N-末端中的候選分子是在抗原呈遞增強(qiáng)雜交體中以與Ii Key肽等同的方式起作用的分子。
9.一種MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體，包括(a)N-末端，包括依據(jù)權(quán)利要求8鑒別的，在MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體中以與Ii Key肽等同的方式起作用的分子，及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾；(b)C-末端，包括結(jié)合在MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的多肽或類肽結(jié)構(gòu)形式的抗原表位；以及(c)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，共價(jià)結(jié)合雜交體的N-末端和C-末端組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列。
10.一種依據(jù)權(quán)利要求8鑒別的，在MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體中以與Ii Key肽等同的方式起作用的分子，及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾。
11.一種增強(qiáng)MHC II類限制性抗原表位向T細(xì)胞呈遞的方法，包括(a)將MHC II類限制性抗原表位摻入到MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽中，雜交體多肽包括(i)N-末端，包括哺乳動(dòng)物Ii-Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾；(ii)C-末端，包括結(jié)合MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)的多肽或類肽結(jié)構(gòu)形式的抗原表位；以及(iii)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，共價(jià)結(jié)合雜交體的N-末端和C-末端組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列；以及(b)在生理學(xué)條件下接觸(i)步驟(a)的雜交體多肽；(ii)MHC II類表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞；以及(iii)對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子呈遞的抗原表位應(yīng)答的T細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中對(duì)抗原表位的MHC II類等位基因應(yīng)答是增加的。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中對(duì)Ii Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)的修飾是從下列組中選取的，包括(a)從N-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸；(b)從C-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸；(c)保護(hù)N-末端；(d)氨基酸取代；以及(e)產(chǎn)生環(huán)化衍生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中對(duì)Ii Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)的修飾是用下列組中的分子取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，包括(a)類肽結(jié)構(gòu)；(b)D-異構(gòu)體氨基酸；(c)N-甲基氨基酸；(d)L-異構(gòu)體氨基酸；(e)修飾的L-異構(gòu)體氨基酸；以及(f)環(huán)化衍生物。
15.一種使用組合化學(xué)過(guò)程合成肽，鑒別刺激預(yù)定T淋巴細(xì)胞或從其衍生的克隆細(xì)胞的特異抗原表位的方法，包括(a)提供T淋巴細(xì)胞或從其衍生的克隆細(xì)胞；(b)進(jìn)一步提供提供候選分子的文庫(kù)，將文庫(kù)中的每種候選分子在其C-末端與結(jié)合到MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的抗原表位共價(jià)結(jié)合，候選化合物和抗原表位通過(guò)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合形成雜交體，間插化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列；(c)從步驟(b)中鑒別當(dāng)呈遞在抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子中刺激步驟(a)中的T淋巴細(xì)胞的雜交體，所鑒別的特異雜交體的候選化合物對(duì)應(yīng)于刺激T淋巴細(xì)胞的特異抗原表位。
16.一種通過(guò)權(quán)利要求15的方法鑒別的抗原表位。
17.一種增強(qiáng)等位基因限制性抗原表位的MHC II類等位基因呈遞范圍的方法，包括(a)將抗原表位摻入到抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽中，雜交體多肽包括(i)N-末端，包括哺乳動(dòng)物Ii-Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾；(ii)C-末端，包括抗原表位；以及(iii)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，共價(jià)結(jié)合雜交體的N-末端和C-末端組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列；以及(b)在生理學(xué)條件下將步驟(a)的抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽與抗原呈遞細(xì)胞和對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子呈遞的抗原表位應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞接觸。
18.一種鑒別表現(xiàn)預(yù)定模式的MHC II類限制性Th1和Th2刺激作用的抗原表位的方法，包括(a)將候選抗原表位摻入到抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽中，雜交體多肽包括(i)N-末端，包括哺乳動(dòng)物Ii-Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾；(ii)C-末端，包括抗原表位；以及(iii)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，共價(jià)結(jié)合雜交體的N-末端和C-末端組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列；以及(b)在生理學(xué)條件下通過(guò)將雜交體多肽與下列物質(zhì)接觸，篩查表現(xiàn)具有預(yù)定模式的MHC II類限制性Th1和Th2刺激作用的呈遞活性的雜交體分子(i)MHC II類表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞；以及(ii)對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子呈遞抗原表位應(yīng)答的Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞；以及(iii)通過(guò)MHC II類呈遞鑒別刺激預(yù)定模式的Th1和Th2細(xì)胞的雜交體多肽。
19.一種通過(guò)增強(qiáng)分子的抗原表位向個(gè)體的T淋巴細(xì)胞的MHCII類呈遞作用，來(lái)調(diào)節(jié)個(gè)體對(duì)特異分子的免疫應(yīng)答的方法，包括(a)提供MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽，包括(i)N-末端，包括哺乳動(dòng)物Ii-Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾；(ii)C-末端，包括結(jié)合MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)的多肽或類肽結(jié)構(gòu)形式的抗原表位；以及(iii)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，共價(jià)結(jié)合雜交體的N-末端和C-末端組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列；以及(b)在適于雜交體向個(gè)體的抗原呈遞細(xì)胞傳送的條件下服用步驟(a)的抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽。
20.一種通過(guò)增強(qiáng)分子的抗原表位向個(gè)體的T淋巴細(xì)胞的MHCII類呈遞作用，來(lái)增強(qiáng)個(gè)體對(duì)特異分子的免疫應(yīng)答的方法，包括(a)從個(gè)體獲得抗原呈遞細(xì)胞群；(b)在適于雜交體與抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子結(jié)合的條件下，用MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體體外治療這些細(xì)胞；MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體包括(i)N-末端，包括哺乳動(dòng)物Ii-Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾；C-末端，包括結(jié)合MHCII類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)的多肽或類肽結(jié)構(gòu)形式的抗原表位；以及(ii)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，共價(jià)結(jié)合雜交體的N-末端和C-末端組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列；以及(c)在促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞與個(gè)體的T淋巴細(xì)胞物理接觸的的條件下給個(gè)體服用步驟(b)產(chǎn)生的抗原呈遞細(xì)胞。
21.一種鑒別抑制MHC II類抗原呈遞的化合物的方法，包括(a)提供預(yù)計(jì)是抗原結(jié)合位點(diǎn)配體的候選分子的文庫(kù)，將文庫(kù)中的每種候選分子獨(dú)立地在其N-末端與哺乳動(dòng)物IiKey肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)或其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾共價(jià)結(jié)合，候選化合物和Ii Key肽通過(guò)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合形成候選抗原呈遞抑制雜交體多肽，間插化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列；以及(b)通過(guò)獨(dú)立地將每種雜交體與T淋巴細(xì)胞活化測(cè)試中的抗原呈遞細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞接觸，來(lái)篩查步驟(a)中的候選抗原呈遞抑制雜交體多肽，與對(duì)照反應(yīng)相比雜交體接觸與降低的T淋巴細(xì)胞活化作用的相關(guān)性確定，雜交體以及摻入到其中的候選化合物是MHC II類抗原呈遞的抑制劑。
22.一種通過(guò)權(quán)利要求2的方法鑒別的抗原呈遞抑制雜交體多肽。
23.一種通過(guò)權(quán)利要求21的方法鑒別的抑制MHC II類抗原呈遞的化合物。
24.一種抑制MHC II類限制性抗原表位向T淋巴細(xì)胞呈遞的方法，包括在生理學(xué)條件下接觸下列組成(a)MHC II類表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞，在其表面上展示T淋巴細(xì)胞呈遞的抗原表位；以及(b)抗原呈遞抑制雜交體多肽，包括(i)N-末端，包括哺乳動(dòng)物Ii-Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾；(ii)C-末端，包括結(jié)合在MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的抗原結(jié)合位點(diǎn)配體或類肽結(jié)構(gòu)；以及(iii)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，共價(jià)結(jié)合雜交體的N-末端和C-末端組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列；以及(c)淋巴細(xì)胞，其對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類分子呈遞a)部分抗原表位應(yīng)答。
25.一種通過(guò)抑制個(gè)體抗原呈遞細(xì)胞的MHC II類抗原呈遞來(lái)治療個(gè)體的與產(chǎn)生不利免疫應(yīng)答有關(guān)的疾病的治療方法，包括(a)提供MHC II類抗原呈遞抑制雜交體多肽，包括(i)N-末端，包括哺乳動(dòng)物Ii-Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO1)及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾；(ii)C-末端，包括結(jié)合在MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的抗原結(jié)合位點(diǎn)配體或類肽結(jié)構(gòu)；以及(iii)間插化學(xué)結(jié)構(gòu)，共價(jià)結(jié)合雜交體的N-末端和C-末端組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)是原子的共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，原子在以線性方式排列時(shí)形成柔性鏈，柔性鏈延伸到20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，同樣地以線性方式排列；以及(b)在適于將雜交體傳送到個(gè)體抗原呈遞細(xì)胞的條件下給個(gè)體服用步驟(a)的雜交體。
全文摘要
本發(fā)明提供了MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體多肽。雜交體具有N－末端,包括哺乳動(dòng)物Ii－Key肽LRMKLPKPPKPVSKMR(SEQ ID NO:1)及其保持抗原呈遞增強(qiáng)活性的修飾;C－末端,包括結(jié)合在MHC II類分子的抗原肽結(jié)合位點(diǎn)中的多肽或類肽形式的抗原表位;以及間插化學(xué)結(jié)構(gòu),共價(jià)結(jié)合雜交體的N－末端和C－末端。本文也描述了鑒別在MHC II類抗原呈遞增強(qiáng)雜交體中以與Ii Key肽等同的方式起作用的分子的方法。本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)MHI II類限制性抗原表位向T細(xì)胞呈遞的方法。本發(fā)明還提供了體內(nèi)和體外方法。本發(fā)明還提供了鑒別一種MHC II類抗原呈遞作用的化合物的方法。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1373668SQ00812837
公開(kāi)日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月14日
發(fā)明者羅伯特·E·漢弗萊斯, 莎莉伊·亞當(dāng)斯, 徐民楨 申請(qǐng)人:抗原表達(dá)公司