專利名稱：IgA腎病相關(guān)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明著眼于與健康人的白細胞相對比，IgA腎病患者的白細胞中表達有所變動的mRNA，涉及到通過用差異顯示法獲取新基因及其方法。本發(fā)明還涉及新型蛋白質(zhì)及針對該蛋白質(zhì)的抗體、編碼該蛋白質(zhì)的DNA、該蛋白質(zhì)及該DNA的檢測方法及IgA腎病的診斷和治療。
背景技術(shù)：
IgA腎病是以血液中的IgA免疫復(fù)合物沉積于腎臟的腎小球內(nèi)為特征的慢性腎小球腎炎。在日本，該疾病占原發(fā)性腎疾病的30％以上，是發(fā)病率最高的單純性腎疾病，其中有15～30％由于預(yù)后不良而轉(zhuǎn)變?yōu)槟I功能不全。但是由于IgA腎病的發(fā)病原因不明確，所以沒有根本的治療方法。此外，IgA腎病的確診是對腎病的一部分進行活檢，通過對腎小球膜細胞中沉積的IgA免疫復(fù)合物進行免疫學(xué)染色的方法確定的，因此患者的負擔很大。
有這樣的報道、IgA腎病患者中約50％病例的血液中IgA值增多[腎臟疾病(Disease of the kidney)第5版(1993)，腎(Nephron29,170(1981)]。已知血液中IgA的產(chǎn)生和抑制分別由B細胞、T細胞負責，還有報道講IgA患者的末梢T細胞中，細胞因子白細胞介素4、白細胞介素5、白細胞介素6或TGF-β的產(chǎn)生較健康人高[臨床和實驗免疫學(xué)(Clinical & Experimetal Immunology),103、125(1996)，國際腎臟學(xué)(Kidney International),46,862(1994)]；末梢淋巴細胞中整合素家族中VLA(Very late activation)-4和VLA-5具有非常強的的活性[腎病學(xué)，透析、移植(Nephrologhy,Dialysis,Transplatation),10,1342(1995)]。由此可知IgA腎病是因免疫系統(tǒng)失常而產(chǎn)生過量的IgA，血液中的IgA免疫復(fù)合物沉積于腎小球，沉積的IgA免疫復(fù)合物激活外體系統(tǒng)等而導(dǎo)致危及腎小球的損害，但對于IgA腎病的病因還不清楚。
發(fā)明公開期望能夠闡明IgA腎病的患者原因、能治療IgA腎病或有一種減弱患者負擔的診斷方法。本發(fā)明提供與IgA腎病相關(guān)的新型DNA及其獲取方法，本發(fā)明還提供與IgA腎病相關(guān)的新型蛋白質(zhì)和針對該蛋白質(zhì)的抗體、編碼該蛋白質(zhì)的DNA，以及應(yīng)用這些物質(zhì)的治療藥和診斷藥物。
本發(fā)明涉及具有序列號1～31中堿基序列的IgA腎病相關(guān)基因的DNA，在嚴格條件下與該DNA進行雜交的DNA。本發(fā)明涉及應(yīng)用以本發(fā)明DNA及該DNA互補堿基序列的部分片段為基礎(chǔ)的寡核苷酸檢測IgA腎病相尖基因的mRNA的方法和包含這些寡核苷酸的IgA腎病的診斷藥。本發(fā)明涉及應(yīng)用以本發(fā)明DNA及該DNA互補堿基序列的部分片段為基礎(chǔ)的寡核苷酸來抑制IgA腎病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及該mRNA翻譯的方法和包含這些寡核苷酸的IgA腎病治療藥物。另外本發(fā)明還涉及用差異顯示法從IgA腎病患者白細胞中獲取IgA腎病相關(guān)基因的方法。
本發(fā)明還涉及具有序列號32中氨基酸序列的蛋白質(zhì)及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA、具有序列1中堿基序列的DNA或在嚴格條件下能與具有這些堿基序列的DNA進行雜交的DNA。本發(fā)明還涉及蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于用該DNA與載體形成重組載體，將該重組載體導(dǎo)入宿主細胞得到轉(zhuǎn)化體，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，本發(fā)明的蛋白質(zhì)在培養(yǎng)物中生成，蓄積，從培養(yǎng)物中收集蛋白質(zhì)。此外本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的蛋白質(zhì)進行特異反應(yīng)的抗體，用該抗體對該蛋白質(zhì)進行免疫學(xué)識別的方法，含有該抗體的IgA腎病診斷藥和治療藥物。
為了獲取新基因，本發(fā)明中應(yīng)用差異顯示法[FEBS信件(FEBSLetters)351,231(1994)]觀注IgA腎病患者和健康人白細胞中mRNA表達量的差異。該方法是以表達方式為指標對新基因進行克隆的方法。即應(yīng)用針對細胞中提取出的總RNA或mRNA的各種引物進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，這樣可得到與健康人的白細胞相對照在IgA腎病患者的白細胞中表達量顯著增加或減少的新基因的cDNA擴增片段的方法。以下對其方法進行論述。
從IgA腎病患者和健康人的白細胞中制備總RNA的方法可用硫氰酸胍三氟醋酸銫法[Methods in Enzymol,154,3(1987)]、AGPC法[實驗醫(yī)學(xué)9,1937(1991)]或用提取RNA用的試劑盒RNAeasy(QIAGEN公司)等。
由總RNA制備poly(A)+RNA的方法可用oligo(dT)-纖維素層析柱法|分子克隆實驗室手冊(第2版)等。另外從IgA腎病患者和健康人的白細胞中制備mRNA的試劑盒可選用快速追蹤mRNA分離試劑盒(Fast Track mRNA Isolation kit；インビトロジエン公司產(chǎn)品)，快速制備mRNA純化試劑盒(Quick Prep mRNA Purificationkit；Pharmacia公司產(chǎn))等。
接著根據(jù)IgA腎病患者和健康人的白細胞中提取出的RNA，用錨定引物合成cDNA，然后用5′末端進行過熒光標記的錨定引物和隨機引物對該cDNA進行PCR反應(yīng)。所謂錨定引物是將除胸腺嘧啶核苷外的腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶等寡核苷酸添加到與mRNA3′末端polyA序列結(jié)合的oligo-dT序列的3′末端的引物。隨機引物是指能對多中cDNA序列進行擴增的引物，且優(yōu)選應(yīng)用在一次反應(yīng)中能得到每個cDNA擴增片段的寡核苷酸，其長度為10聚體。
PCR反應(yīng)后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，用熒光檢測儀進行熒光檢測。由引可比較IgA腎病患者和健康人白細胞中cDNA擴增片段的泳帶，將表達擴增有所變動的cDNA片段從膠中收回，將該cDNA擴增片段整合到載體中，通過常規(guī)的堿基序列分析法，如Sanger等的雙脫氧法[美國國家科學(xué)院院刊，74,5463(1977)]進行分析，來確定該DNA的堿基序列。
作為整合DNA片段的載體可用pDIRECT[核酸研究(NucleicAcid Research)18,6069(1990)]、PCR-Script AmpSK(+)[Stratagene公司，策略(Strategies),5,6264(1992)]、pT7Blue(ノバジ一ン公司)、pCRⅡ[インビトロヅエン公司，生物工程(Biotechnolgy),9,657(1991)]、pCR-RTAP(ヅ一ンハ夕一公司)及pNOTAT7(5プライム→3プライム公司)等。
堿基序列的分析可用堿基序列自動分析裝置，如用373A·DNA測序儀(Amplier Biosvstems公司)。
本發(fā)明的DNA可以是序列另1～31中堿基序列所組成的DNA或是在嚴格條件下與該DNA進行雜交的DNA序列。
在嚴格條件下能與序列另1～31中堿基序列進行雜交的DNA是指在不失該蛋白質(zhì)原有活性的范圍內(nèi)導(dǎo)入了-處以上的置換、缺失、插入或添加等變異的DNA，具有序列號1～31中所示堿基序列的DNA或以其片段作探針用菌落雜交法或斑點雜交法[分子克隆實驗指南(Moleular Cloning,A labortory manual)，第2版(Sambrook、Fritsch、Maniatis編著，冷泉港實驗室出版)Cold Spring HarborLaboratory Press)1989年刊〕以后記作分子克隆實驗指南，第2版]得到的DNA。
用以本發(fā)明DNA的堿基序列為基礎(chǔ)的寡核苷酸檢測IgA腎病相關(guān)的mRNA的方法可用Northen雜交法〔Molecular Cloning,A laboratorymanual Second edition,cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)〕、PCR法〔PCR方案(PCR Protocols〕，學(xué)院出版社)Academic Press(1990)〕等。尤其是RT(Room Tempreture)-PCR法簡單便利，可用于IgA腎病的診斷。具體而言就是從人采血，收集白細胞，從中分離RNA，應(yīng)用oligo(dT)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將之變換為cDNA，之后應(yīng)用與希望能檢測出的mRNA相對應(yīng)的一組寡核苷酸引物進行PCR反應(yīng)，檢測擴增片段的方法。
作為寡核苷酸引物可用相當于希望檢測出的mRNA的一部分堿基序列中5′末端堿基序列的有義引物及相當于3′末端堿基序列的反義引物。只是mRNA中相當于尿嘧啶的堿基在寡核苷酸引物中為胸腺嘧啶。
作為有義引物和反義引物優(yōu)選應(yīng)用融解溫度(Tm)和堿基數(shù)沒有很大變化的寡核苷酸。堿基數(shù)優(yōu)選為15～40聚體。
應(yīng)用上述寡核苷酸引物所擴增的堿基序列部分，mRNA無論是怎樣的堿基序列區(qū)域均可，但優(yōu)選堿基序列的長度為50bp～2kbp，含有重復(fù)序列或GC(鳥嘌呤、胞嘧啶)富含序列的堿基序列。
同樣應(yīng)用反義RNA/DNA[化學(xué)46,681(1991)，生物技術(shù)(Biotechnology)9,358(1992)]，通過抑制DNA轉(zhuǎn)錄或mRNA翻譯可用于IgA腎病的治療。
應(yīng)用反義RNA/DNA技術(shù)抑制蛋白質(zhì)的生產(chǎn)是這樣的設(shè)計、制備以編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA的部分堿基序列為基礎(chǔ)的寡核苷酸，優(yōu)選以翻譯起始區(qū)域10～50堿基的堿基序列為基礎(chǔ)而設(shè)計的寡核苷酸，然后施與生物體內(nèi)。合成寡核苷酸的堿基序列與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA的反義鏈的堿基序列的部分相一致或者可利用在能夠抑制該蛋白質(zhì)的活性表達而不失去活性的范圍內(nèi)經(jīng)過變動的序列。作為寡核苷酸可用DNA、RNA或其衍生物如甲基化或磷酸化。
由用上述方法得到的cDNA片段而得到DNA全長可以上述cDNA擴增片段作探針，通過雜交從各種cDNA文庫中篩選而得到，以下論述cDNA文庫的制備方法。
cDNA文庫的制備方法可參照分子克隆實驗指南(第2版)和分子生物學(xué)的現(xiàn)行方案，增刊1～34中的方法或者用市售的試劑盒，如用cDNA合成和質(zhì)粒克隆用Super ScriptTM質(zhì)粒系統(tǒng)(Super ScriptTMPlasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning,LifeTechnologies公司產(chǎn)品)和ZAP-cDNA合成試劑盒[ZAP-cDNASynthesis kit,(Stratagene公司)。再有，cDNA文庫也有市售的，本發(fā)明中也有Gibco BRL公司的人白細胞cDNA文庫等cDNA文庫的市售品。
在制備cDNA文庫的時候，以細胞出的mRNA為模板合成cDNA，將該cDNA整合到載體中，只要能將該cDNA整合到載體中，那么任何一種載體均可應(yīng)用。如可用ZAP Express〔策略(Strategies)5,58(1992)〕、pBluesuipt Ⅱ SK(+)[核酸研究(Nucleic AcidResearch)17,9494(1989)[,λzapⅡ(Stratagene產(chǎn)品)λgt10、λgt11 [DNA克隆可行的方案(DNA Cloning,A PracticalApproach),Vol.,49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech產(chǎn)品)、λExcell、PT7T3 18U(Pharmacia pcD2[分子細胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)3,280(1983)]和pUC18[基因(Gene),33,103(1985)]等。將用載體構(gòu)建的cDNA文庫導(dǎo)入大腸桿菌的時候，只要能導(dǎo)入、表達、維持cDNA文庫，那么任一種大腸菌均可以。如用可XL1-BlueMRF [策略(Strategies),5,81(1992)]、C600[遺傳學(xué)(Genetics),39,440(1954)]、Y1088、Y1090[科學(xué))Science,222,778(1983)]、NM522[分子生物學(xué)雜交(J.Mol.Biol),166,(1983)]、K802[分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol),16,118(1966)]及JM105[基因(Gene),38,275(1985)]等。
不制備eDNA文庫的時候，合成cDNA后在兩端付加銜接頭，用基于該銜接頭堿基序列和擴增片段堿基序列的引物進行PCR，得到5′RACE(cDNA未端的快速擴增)和3′-RACE[美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A),85,8998(1988)]。此外，也可用以序列號1中堿基序列為基礎(chǔ)的PCR法或用DNA合成儀進行化學(xué)合成的方法。
從cDNA文庫篩選cDNA克隆的時候，可用同位素或熒光標記的探針，通過集落雜交法或噬斑雜交法[分子克隆實驗指南，第2版]進行。另外，也可制備引物，以由poly(A)+RNA或mRNA而合成的cDNA或cDNA文庫作模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)法[分子克隆實驗指南(第2版)，分子生物學(xué)的現(xiàn)行規(guī)程，增刊1～34]制備cDNA。
用適當?shù)南拗菩悦该盖杏蒙厦娴姆椒êY選出的cDNA克隆，克隆到pBluescript KS(+)(Stratagene)等質(zhì)粒中，用常規(guī)的堿基序列分析法，如用Sanger等的雙脫氧法[美國國家科學(xué)院院刊，74,5463(1977)]進行分析，確定該DNA的堿基序列。也可用堿基序列自動分析裝置，如用373A-DNA測序儀(Amplier Biosystem產(chǎn)品)進行堿基序列的分析。
可根據(jù)GENBank、EMBL和DDBJ等堿基序列數(shù)據(jù)庫來確認所得堿基序列的穎性。
由上述方法所得的DNA可是具有序列號1中堿基序列的DNA或是在嚴格條件下與該DNA進行雜交的DNA。另外具有由該堿基序列所推定的氨基酸序列的蛋白質(zhì)包括具有序列號32中氨基酸的蛋白質(zhì)。編碼新型蛋白質(zhì)的DNA的調(diào)控及表達可按照分子克隆實驗指南(第2版)、分子生物學(xué)現(xiàn)行方案，補Supplement1～34[Ausubel、Brent、Kingston、Moore、Seidman、Smith、Struhl編著，GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience1987-1996年出版，簡稱為分子生物學(xué)的現(xiàn)行方案，增刊1-34]中的方法進行。
即，將用上述方法得到的全長DNA插入到適宜載體的啟動子下游，制成重組載體，將重組載體導(dǎo)入宿主細胞就可得到表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體。
細菌、酵母、動物細胞、昆蟲細胞等只要能表達目的基因均可作為宿主細胞。如細胞可用大腸桿菌(Escherichia Coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)，淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amvloliquefaniens)、黃色短桿菌(Breribacterium flavum)、乳發(fā)酵短桿菌(Breribacterium Lactofermentum)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilum)等大腸菌屬、沙雷氏菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞細菌屬、芽胞桿菌屬等。酵母可用啤酒糖酵母(Saccharomvcescererisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pom e)、乳克魯維氏酵母(Kluvveromvces lactis)、茁芽絲孢酵母Trichosporonpullulans河岸許旺氏酵母(Schwanniomvces alluvius)等。動物細胞如人的ナマルバ細胞。猴子的COS細胞。中國公鼠的CHO細胞等。昆蟲細胞如草地夜蛾Spodoptera Frugiporda的卵母細胞Sf9、Sf21[桿狀病毒表達載體實驗室手冊(Baulovirus Expression Vectors ALaboratory manual),Oreily、Miller、Luckow著，W.H.Freemanand Company紐約(New York)1992年版(以后稱作桿狀病毒表達載體，實驗室手冊)]，粉紋夜蛾的卵細胞，Pharmingen生產(chǎn)的High5，即市售的Tn5等。
作為導(dǎo)入本發(fā)明DNA的載體，只要能整合該DNA、在宿主細胞中能夠表達，那些任一種載體均可。
以細菌，如大腸桿菌(Escherichia Coli)作宿主細胞的時候，啟動子、核糖體結(jié)合序列。本發(fā)明的DNA、轉(zhuǎn)錄終止序列、優(yōu)選依不同的情況由啟動子的調(diào)控序列構(gòu)成。
作為表達載體，如可用pKYP10(特開昭58-110600)、pLSA1[農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agril.Biol Chem,)53,277,(1989)]、pGEL1[美國國家科學(xué)院院刊，82,4306,(1985)]等。
作為啟動子，只要能在大腸菌等宿主細胞中表達就可。如可用trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子(Plac)、T7lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子等大腸菌、噬菌體來源的啟動子。也可用2個連續(xù)的Ptrp啟動子(Ptrp×2)、tac啟動子等經(jīng)過人為設(shè)計、改變過的啟動了。
作為核糖體結(jié)合序列，優(yōu)選能將SD(Shine-Dalgarno)序列(以后略作SD序列)與起始密碼子間調(diào)整到適當?shù)木嚯x(如6～18個堿基)的。
為了使本發(fā)明DNA的堿基序列能以最適宜的密碼子在宿主細胞中表達，必要時可置換本發(fā)明重組載體中的堿基。
轉(zhuǎn)錄終止序列對本發(fā)明DNA的表達不一定是必要的，所以在本發(fā)明的重組載體中可優(yōu)選在最合適的結(jié)構(gòu)基因的正下方配置轉(zhuǎn)錄終止序列。
將重組載體導(dǎo)入細胞的方法，只要具備將DNA導(dǎo)入細菌的方法，如用鈣離子法[美國國家科學(xué)院院刊，69,2110-2114(1972)]原生質(zhì)法(特開昭63-2483942)等，任一種均可應(yīng)用。
以酵母作宿主細胞的時候，作為表達載體，如可用YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等。
作為啟動子，只要能在酵母中表達，那么用哪一種均可，如用己糖激酶等具有降解作用基因的啟動子、gal1啟動子、gol10啟動子、熱休克蛋白質(zhì)啟動子、MFα1啟動子、CUP1啟動子等。
作為將重組載體導(dǎo)入酵母的方法，只要是能將DNA導(dǎo)入酵母的方法，如電穿孔法[酶學(xué)方法，194,182-187(1990)]，原生質(zhì)球法[美國國家科學(xué)院院刊，84,1929-1933(1978)]，醋酸鋰法[細菌學(xué)雜志153,163-168(1983)]等，可用任一種。
以動物細胞作宿主細胞的時候，表達載體可用，如pAGE107[特開平3-22979；細胞工程學(xué)(Cytotechnology),3,133,(1990)[pAS3-3(特開平2-227075),pAMoERC3Sc,PCDM8[自然(Nature),329,840(1987)],pcDNAI/Amp,pcDNAI(均為フナコシ公司產(chǎn)品)。
作為啟動子，只要能在動物細胞中表達，用任一種均可，如用巨細胞病毒(CEA)的IE(立即早期(Immediate early)基因的啟動子，SV40或金屬硫蛋白的啟動子等。另外，人CMV的IE基因的增強子也可用作啟動子。
將重組載體導(dǎo)入動物細胞的方法，如可用電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]，磷酸鈣法(特開平2-227075)，脂轉(zhuǎn)染法]美國國家科學(xué)院院刊USA,84,7413(1987)]等中的任一種。
昆蟲細胞作宿主細胞的時候，可參照分子生物學(xué)的現(xiàn)行方案，增刊1～34，桿狀病毒表達載體，實驗室手冊中的方法表達蛋白質(zhì)。即，如下所述，將導(dǎo)入了重組基因的載體和桿狀病毒共同導(dǎo)入昆蟲細胞，在昆蟲細胞培養(yǎng)養(yǎng)皮中得到重組病毒后，由用重組病毒感染昆蟲細胞，就能獲得表達蛋白質(zhì)的昆蟲細胞。
作為轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體，如可用pVL1392,pVL1393,pBlueBacⅢ(均為イン ビトロジエン公司產(chǎn)品)等。
作為桿狀病毒，如可用感染夜盜蛾科昆蟲的苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等。
為了制備重組病毒，將上述重組基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體和上述桿狀病毒共同導(dǎo)入昆蟲細胞的方法，可用，如磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂轉(zhuǎn)染法[美國國家科學(xué)院院刊，84,7413(1987)]等。
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上面得到的轉(zhuǎn)化體，在培養(yǎng)物中生成蓄積本發(fā)明的蛋白質(zhì)，收集該培養(yǎng)物就能制備出本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的方法，可依照培養(yǎng)宿主細胞時用的常規(guī)方法進行。
培養(yǎng)大腸菌或酵母等微生物作宿主細胞所得到的轉(zhuǎn)化體時所用的培養(yǎng)基，只要含有微生物微生所需的碳源、氮源、無機鹽類等。能高效地培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，那么無論天然培養(yǎng)基、還是合成培養(yǎng)基均可。
作為碳源，可用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、淀粉水解物等碳水化合物，醋酸、丙酸等有機酸，乙醇、丙醇等酒精類。
作為氮源，可用氨、氯化銨、碳酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無機酸、或有機酸的銨鹽，或用其它含氮化合物以外的物質(zhì)，蛋白胨、肉浸膏、酵母浸膏、コ一ンスチ一プリ力一、酶蛋白水解物、大豆渣及大豆渣水解物、各種發(fā)酵菌體或其消化物等。
作為無機物，可用磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
通常在振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)等通過良好的情況下、15-40℃培養(yǎng)16～96小時。培養(yǎng)期間，pH保持在3.0～9.0?？捎脽o機酸或有機酸、堿液、尿素、碳酸鈣、氨等調(diào)整pH。
培養(yǎng)中必要時可向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素、四環(huán)素等抗生素。
當培養(yǎng)以誘導(dǎo)性啟動子作啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物時，必要時可向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物。如當培養(yǎng)啟用lac啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物時向培養(yǎng)基中加入異內(nèi)基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，而培養(yǎng)啟用trp啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物時向培養(yǎng)基中加入吲哚乙酸(IAA)。
當培養(yǎng)以動物細胞作宿主細胞所得到的轉(zhuǎn)化體時，常用通常使用的RPMI1640培養(yǎng)基、Eagle氏MEM培養(yǎng)基或者用向這些培養(yǎng)基中添加了胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)通常在5％CO2、35～37℃的條件下進行3-7天，培養(yǎng)中必要時可向培養(yǎng)基中加入卡那霉素、青霉素等抗生素。
當培養(yǎng)以昆蟲細胞作宿主細胞所得到的轉(zhuǎn)化體時，可用通常使用的TNM-FH培養(yǎng)基[Pharmingen產(chǎn)品]，SF900ⅡSFM[LifeTeehnologies嚴品]，ExCell400、ExCell405[均為JRH Bioscienes產(chǎn)品]等。于25～30℃培養(yǎng)1～4天，培養(yǎng)過程中必要時也可加入慶大霉素等抗生素。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)以溶解狀態(tài)表達時或在細胞內(nèi)形成不溶體的時候，都要在培養(yǎng)結(jié)束后，將細胞離心，分離，懸浮于水性緩沖激后，用超聲波法、弗氏細胞壓碎法將細胞弄破，從離心分離的上清中收回蛋白質(zhì)。
此外，當在細胞內(nèi)形成不溶體的時候，用蛋白質(zhì)變性劑將不溶體溶化后，在不含有蛋白質(zhì)變性劑或蛋白質(zhì)變性劑的濃度稀釋到不能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性的溶液中稀釋或進行透析，可形成蛋白質(zhì)的立體構(gòu)選。
當本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其糖修飾體等衍生物在細胞外分泌產(chǎn)生的時候，可以從培養(yǎng)上清中收集到該蛋白質(zhì)或其糖鏈付加體等的衍生物。對于分離純化來講，可單獨應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用溶劑提取，用有機溶劑分別進行沉淀、鹽析、透析、離心、超過液、病子交換層析、凝膠過濾層析、疏水性層析、親和性層析、反相層析、結(jié)晶、電泳等分離過程。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)以序列號32中的氨基酸序列為基礎(chǔ)，可用化學(xué)合成的方法進行制備。
另外可用本發(fā)明蛋白質(zhì)或以序列號32中氨基酸序列為基礎(chǔ)化學(xué)合成的本發(fā)明蛋白質(zhì)部分的肽作抗原進行免疫，以此來制備抗體也就是說，將免疫動物的脾細胞與小鼠的骨髓瘤細胞融合制作雜交瘤，培養(yǎng)該雜交瘤施用于動物使動物產(chǎn)生腹水癌，收集該培養(yǎng)液體或腹水就能制備針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的單克隆抗體。此外，通過收集免疫動物的免疫血清就可制備針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的多克隆抗體。這些抗體可用于IgA腎病的腐爛和治療。
以下為本發(fā)明的實施例。[實施例]實施例1,IgA腎病患者和健康人白細胞的差異顯示(1)由IgA腎病患者和健康人的白細胞獲取總RNA分別從5名IgA腎病患者和5各健康人每個人采血20ml，加入1000單位/ml的肝素鈉溶液(清水制藥)500μl抗凝；剩入離心管中，室溫3,300rpm離心15分鐘，將中間白細胞成分的緩沖液層移到其它的離心層中后，根據(jù)AGPC法[實驗室學(xué)9,1937,(1991)]提取總RNA。(2)用IgA腎病患者和健康人白細胞的總RNA進行熒光差異顯示。
分別取總RNA2.5μg，加蒸餾水至全共達9μl，加入5′端用異硫氰酸熒光素(以后稱作FITC進行熒光標記的錨定引物(サワデイ一公司50μm)1μl,70℃加熱5分鐘后立即冰冷。因為熒光標記的錨定引物要與下列3種序列(FAH:5′-FITC-GT15A-3′、FGH:5′-FITC-GT15G-3′、FCH:5′-FITC-GT15C-3′)中的每一序列進行反應(yīng)，所以對1個樣品的總RNA共進行3組反應(yīng)。加入5×逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液〔250mM三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)-HCl(pH8.3)、375mM HCl、15mM MgCl2)4μl、100mM二硫蘇糖醇(DTT)2μl、10mM d NTP(dATP、dGTP、dTTP及d CTP)1μl、蒸餾水1μl、逆轉(zhuǎn)錄酶SUPERSCRIPT Ⅱ Rnase H- ReverseTranscriptase(BRL公司)1μl(200單位)混合，室溫靜置10分鐘后，于42℃反應(yīng)50分鐘合成cDNA,90℃加熱5分鐘使反應(yīng)停止。向該反應(yīng)液中加入40μl TE緩沖液〔10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM乙二胺四乙酸鈉(EDTA)(pH8.0)。
向合成的各個cDNA 1μl中加入蒸餾水14.7μl 10×PCR緩沖液[100mM Tris-HCl(pH8.8)、500mM KCl、15mM MgCl2、1％triton X-100]2μl、2.5mM dNTP0.8μl、50μm熒光標記的錨定引物(FAH、FGF、FCH中與合成cDNA時應(yīng)用的為同一種0.3μl、隨機引物(才プロン公司10μM)1μl、DNA聚合酶Gene Taq(日本基因公司，5單位/μl)0.2μl設(shè)置熱循環(huán)。94℃3分鐘、40℃5分鐘、72℃5分鐘反應(yīng)后，95℃15秒、40℃2分鐘72℃1分鐘為一循環(huán)；進行27個循環(huán)的反應(yīng)，最后在72℃反應(yīng)5分鐘完成PCR。因為熒光標記的錨定引物要從上述三種選一種，隨機引物要從オプロン公司的OPD-1～20、OP-有～20及OPV-1～20的60中選1種組合起來進行反應(yīng)，所以共計180組，再表，由于用熒光標記的錨定引物FOH與隨機引物OPB-2(オプロン公司)進行反應(yīng)，對于一個總RNA來說共進行181組反應(yīng)。
向各個PCR反應(yīng)液4μl中加入電泳樣品溶液(95％甲酰胺、0.1％二甲苯腈藍、0.1％溴酚藍)3μl95℃加熱2分鐘后立即冷卻，用6％聚丙烯酰胺于1500V電泳2.5小時。電泳所用緩沖液為89mM Tris、89mM硼酸、2mM EDTA。用熒光測量儀(Molecular Dynamicus)對電泳后的凝膠進行熒光檢測。檢測、比較PCR的擴增片段。與5例健康人相比，5例IgA腎病患者的白細胞中共有顯著增加或減少的帶。再次從其它3名IgA腎病患者和3名健康人獲取完全同樣的總RNA，進行同樣地差異顯示，2次的差異顯示中均看到表達量的增加或減少，大約從凝膠中切出這樣的約197的帶。
向切出的約1/4的凝膠中加入蒸餾水38μl、10×PCR緩沖液5μl、2.5mM dNTP 4μl、熒光未標記的錨定引物(サワデイ一公司34μM)0.6μl、10μM隨機引物2μl、DNA聚合酶Gene Teq0.5μl,94℃加熱3分鐘后，以95℃15秒、40℃2分鐘72℃1分鐘為1個循環(huán)、進行30個循環(huán)的反應(yīng)，最后在72℃反應(yīng)5分鐘，如在進行PCR。錨定引物與隨機引物的組合與最初的差異顯示法中所用的相同。用酚-氯仿(1∶1)萃取反應(yīng)后的溶液，再用氯仿-異戊醇(24∶1)提取后，用乙醇沉淀，為了對此進行純化，在1.5％低融點的瓊脂糖凝膠(SEAPLAQUE GTG:FMC(Bioproduct))下電泳，用溴化乙啡啶染色，切出擴增片段。將此融解于65℃加熱了15分鐘的琉脂糖中，酚-氯仿萃取，由用氯仿-異戊醇萃取后，用乙醇沉淀，在10μl TE緩沖液中溶解。
將擴增片段1μl與PCR片段克隆用的載體pTTBlueT-Vextor(ノバジエン)1μl混合，應(yīng)用DNA連接試劑盒Ver.1，(寶酒造)按照試劑盒的指示，將擴增片段整合到質(zhì)粒中。轉(zhuǎn)化大腸菌DH52，得到氨芐青霉素耐藥株。將該轉(zhuǎn)化株懸浮于20μl蒸餾水中。加入10×PCR緩沖液2.5μl、2.5mM dNTP 2μl、34μM錨定引物0.3μl、10μ隨機引物1μl、DNA聚合酶Gene Taq 0.5μl，在與擴增片段再擴增時相同的條件下進行PCR，電泳，與最初差異顯示時間等長度的片得到擴增，由此可確定擴增片段整合到了質(zhì)粒中。
用DNA測序儀(Perkin-Elmer公司)確定擴增片段的堿基序列。測定堿基序列所用的試劑及方法是使用Perkin-Elmer公司的DyePrimer cvcle sequencing FS Ready Reaction試劑盒。按照試劑盒的指導(dǎo)進行。用這些所得堿基序列中的限制性酶位點酶切原先差異顯示時的反應(yīng)物，進行電泳，可以證實相當于切下的擴增片段的帶確實在切料的電泳位置，將所得堿基序列與堿基序列數(shù)據(jù)庫GenBank進行比較，在數(shù)據(jù)庫中已有堿基序列中沒有與該序列相一致的堿基序列，在數(shù)據(jù)庫的堿基序列中篩選出66株只與已表達的序列標記(expressedsequence taq)相一致的序列。實施例2用RT-PCR檢測mRNA表達的特異性用單鏈cDNA合成試劑盒Superscript Preampificaton System(BRL公司)，通過試劑盒中配備的olig-dT引物，對實施例1中得到的，從5名IgA腎病患者和5名健康人的白細胞中獲得的總RNA各2μg合成單鏈cDNA。具體的試劑及方法參照試劑盒中配備的方案。向21μl反應(yīng)后的溶液中加入蒸餾水399μl共達420μl，用其中的10μl進行RT-PCR，由此檢測對應(yīng)各擴增片段的mRNA的表達量。即，向白細胞的單鏈cDNA 10μl中加入蒸餾水15.8μl、10×PCR緩沖液4μl、2.,5mM dNTP 3.2μl、DMSO 2μl、10μm基因特異的5′有義引物(序列號6)2μl、10μm基因特異的3′反義引物2μl、稀釋到1單位/μl的DNA聚合酶Gene Tap 2μl,97℃加熱5分鐘。冰浴中冷卻5分鐘后，以94℃30秒、65℃1分鐘、72℃2分鐘為1個循環(huán)進行24～35個循環(huán)的PCR反應(yīng)。在2％瓊脂糖凝膠電泳后，用0.01％サイバ一ダリ一ン(寶酒造)染色，用熒光檢測儀對擴增片段的量進行定量，作為mRNA的相對表達量。
為了對mRNA的量進行校正，對屬于管家基因的甘油醛3-磷酸脫氫酶(G3PDH)基因特異的引物(5′-CCCATCACCATCTTCCAGGAGC-3′、5′-TTCACCACCTTCTTGATGTCATCATA-3′進行同樣的反應(yīng)，各基因的mRNA表達量與G3PDH mRNA的表達量對比校正后，將5名IgA腎病患者的平均值與5名健康人的平均值進行比較，其值有差異的基因31株就作為IgA腎病患者中表達量有變化的基因篩選出來。表1-1和表1-2中是對篩選出的基因的一個歸納。
表1-1

<p>表1-2

1)表示差異顯示時所用錨定引物與隨機引物的組合。2)表示除GTINP332A-21之外差異顯示時擴增片段的長度。3)表達變化表示5例IgA腎病患者mRNA的表達量的平均值/5例健康人mRNA表達量平均值的值。4)RT-PCR引物表示序列表的序號。5)GTINP332A-21不是在差異顯示中得到其擴增片段的基因，與實施例3相同，它是在嘗試從人白細胞cDNA文庫中獲取INP332-A的全長cDNA克隆時，從轉(zhuǎn)化體中得到的cDNA克隆。當用實例4中的方法測定該cDNA的堿基序列的時候，發(fā)現(xiàn)它是與INP332-A的堿基序列不同的新基因的cDNA克隆，以其堿基序列為基礎(chǔ)進行實施例2中的RT-PCR，結(jié)果表明IgA腎病患者白細胞中mRNA的表達比健康人增加，這在表中有所顯示。
利用針對這些基因的引物和由檢測者白細胞mRNA而來的cDNA，通過RT-PCR法進行反應(yīng)，根據(jù)觀察基因擴增的情況可利于IgA腎病的診斷。實施例3INP377-A cDNA的克隆化(1)INP377-A cDNA克隆的分離應(yīng)用Gene TRAPPER cDNA陽性選擇系統(tǒng)(GENE TRAPPERcDNA Positive Selection System Gibco BRL公司)從應(yīng)用pCMVSPORT(Gibco公司)載體的人白細胞cDNA文庫中獲取INP377-AcDNA克隆。即，用GeneⅡ蛋白和核酸外切酶Ⅲ使cDNA文庫成單鏈后，以與INP377-A基因相對應(yīng)的生物素化的互補寡核苷酸(用實施例2)中應(yīng)用的5′端有義引物)作探針進行雜交，再用添加了鏈霉抗生物素蛋白微磁珠將與探針結(jié)合的分離開來。將雜交了的單鏈cDNA克隆從探針上取下，用DNA聚合酶形成雙鏈后轉(zhuǎn)化大腸菌，可出現(xiàn)INP377A cDNA克隆的氨芐青霉素耐藥株。具體的試劑和方法要按照試劑盒中配備的方案進行。將各轉(zhuǎn)化體群懸浮于蒸餾水18μl，加入10×PCR緩沖液2.5μl、2.5mM dNTP2μl、10mM基因特異的5′表義引物1μl、1mM基因特異的3′反義引物1μl、DNA聚合酶Gene Taq0.5μl，在與RT-PCR同樣的條件下進行PCR、電泳、從引物的位置推算約200bp的INP377-A cDNA片段擴增的轉(zhuǎn)化體作為INP377-A cDNA克隆進行分離。
按照眾所周知的方法(分子克隆實驗指南第2版)從該克隆分離質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒命名為pGTINP377A-46C。此外，用限制性酶SaⅡ和NotⅠ(寶酒造)消化質(zhì)粒DNA后，進行瓊脂糖凝膠電泳，cDNA的大小為3kb左右。(2)INP377-A cDNA堿基序列的測定用Perkin-Elmer公司的377DNA測序儀確定pGTINP377A-46C中的INP377-A cDNA的堿基序列。確定堿基序列所用的具體試劑與方法是使用Perkin-Elmer公司的Dye primer eycle sequensingFS Ready Reaction試劑盒，依照試劑盒的指示進行。所得堿基序列的序列號，所示。該堿基序列中從143氨基酸開始形成開放閱讀框架(ORF)。將377-A的cDNA的堿基序列與數(shù)據(jù)庫進行比較，發(fā)現(xiàn)相當于N末端137氨基酸的部分與具有(シヨゥジヨウバエ)的癌抑制基因SxⅠ相同性的人基因相當于LUCA15的N末端137氨基酸的部分相一致，但其后續(xù)接完全無相同性的堿基序列，可知差異顯示中所得序列存在于完全無相同性的堿基序列中。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性應(yīng)用本發(fā)明所得的新基因可進行IgA腎病的治療和治療。[序列表]序列號1序列的長度2689序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)線性序列的種類cDNA起源生物名人組織種類白細胞序列GTTGGAGGTT CTGGGGCGCA GAACCGCTAC TGCTGCTTCG GTCTCTCCTT GGGAAAAAAT60AAAATTTGAA CCTTTTGGAG CTGTGTGCTA AATCTTCAGT GGGACA ATG GGT TCA 115Met Gly Ser1GAC AAA AGA GTG AGT AGA ACA GAG CGT AGT GGA AGA TAC GGT TCC ATC 163Asp Lys Arg Val Ser Arg Thr Glu Arg Ser Gly Arg Tyr Gly Ser Ile5 10 15ATA GAC AGG GAT GAC CGT GAT GAG CGT GAA TCC CGA AGC AGG CGG AGG 211Ile Asp Arg Asp Asp Arg Asp Glu Arg Glu Ser Arg Ser Arg Arg Arg20 25 30 35GAC TCA GAT TAC AAA AGA TCT AGT GAT GAT CGG AGG GGT GAT AGA TAT 259Asp Ser Asp Tyr Lys Arg Ser Ser Asp Asp Arg Arg Gly Asp Arg Tyr40 45 50GAT GAC TAC CGA GAC TAT GAC ACT CCA GAG AGA GAG CGT GAA AGA AGG 307Asp Asp Tyr Arg Asp Tyr Asp Ser Pro Glu Arg Glu Arg Glu Arg Arg55 60 65AAC AGT GAC CGA TCC GAA GAT GGC TAC CAT TCA GAT GGT GAC TAT GGT 355Asn Ser Asp Arg Ser Glu Asp Gly Tyr His Ser Asp Gly Asp Tyr Gly70 75 80GAG CAC GAC TAT AGG CAT GAC ATC AGT GAC GAG AGG GAG AGC AAG ACC 403Glu His Asp Tyr Arg His Asp Ile Ser Asp Glu Arg Glu Ser Lys Thr85 90 95ATC ATG CTG CGC GGC CTT CCC ATC ACC ATC ACA GAG AGC GAT ATT CGA 451Ile Met Leu Arg Gly Leu Pro Ile Thr Ile Thr Glu Ser Asp Ile Arg100 105 110 115GAA ATG ATG GAG TCC TTC GAA GGC CCT CAG CCT GCG GAT GTG AGG CTG 499Glu Met Met Glu Ser Phe Glu Gly Pro Gln Pro Ala Asp Val Arg Leu120-125 130ATG AAG AGG AAA ACA GGT GAG AGC TTG CTT AGT TCC TGATATTATT 545Met Lys Arg Lys Thr Gly Glu Ser Leu Leu Ser Ser135 140GTTCTCTTCC CCATTCCCAC CTCAGTCCCT AAAGAACATC CTGATTCCCC CAGTCTTCAA 605GCACATGAAT TCAGAATGAA AGGTTTGCCA TGGCTAAGGA ATGTGACTCT TTGAAAACCA 665TGTTAGCATC TGAGGAACTT TTTTAAACTT TGTTTTAGGG ACTTTTTTTT CCTTAGGTAA 725GTAATGATTT ATAAACTCCT TTTTTTTTTT TTGACTATAG TCGGTTGCAT GGTTACTTTA 785AGCGTGGAAT CAAATGGAGT GGCATTTAGT TCAGGCGGCT TGTTCCTTGC CATGGCAAAG 845TATCAAGAAG ATCCCCAAGT CAAGTCACAT TTGTAAAGCT GCTTCCCAAT TGGCTTTGTC 905ACGCAGTGTT GAAGCAGTGG GAGAGAGATT CACCTGTTAT AAAGGAACTG ACTAACACAA 965GTATCCCGTC TATATCTGAA TGCTGTCTCT AGGTGTAAGC CGTGGTTTCG CCTTCGTGGA 1025GTTTTATCAC TTGCAAGATG CTACCAGCTG GATGGAAGCC AATCAGGTTG CTTCACTCAC 1085CAAGTCTAGA TATTCATGAA AATGGAACAA GTCTGTACAA TTTTAAAAAA AGGTTGAAGG 1145AGTGGTTTGT TCCAAAGGAG TGACTTTTTT TTAAAAAAAA AAGCTTTGTA TATATTAAAA 1205TTGATGTTAC TAGAATAAGT ACAGTACCAA GGACTTCATT ATAGAATTTG TTCTGCCTTT 1265AAACATGGCT ACCTACCTGG CAGGGCTTTG TTAACTACTG AATACCTGTC TGGTAATCAC 1325TAAAACATCT TAATGTTTCC CTTTTTTCTA GTTTGTTATA TTCCTATTAT GTCCATTGAG 1385AGTAAGCTTA GTATATCAAA CTCTCCATTT GACAGTGAAG AGAACATAGT GAAAGTCTGT 1445GGCGGCATTT TTATAAGTAA TTCCTTATTT CTGCCTGAAG ACCACAAAGC CTCCTGGAGG 1505CGTAACTGCT CAGACCGGTC TTCAGGGAAT ATTTAAGGAC TTAGTGGAAT TTATGAACAA 1565TAAGTCTGAT GAGATTAGCC TGGGAGTGGT GTCCTGCAGC TGTCTAATCT AGTTAGAGTG 1625GCATTAACAT TCTAATCTCC TTGAGAATGC CTTTTATAGT CTGTTCAAAG CAAGTCATTG 1685ATGGTTCTTC GAGGTAGTGT TAACTGAAGT GTTCTTCAGT TTGTCAAGAT AATGTTCAGT 1745GCTTGGCACT TAAATAACAT TTTTTGCAAG AACTCCAAGG CACATTATTG AATGCCTTTA 1805ACCAAGTGCA TTCTGGGAAG TTTGCTTGAC TCATTATCTT GCTTTTCTGC AGCATTCTGT 1865GATTTGAGTC ATCCATGAAT CCATGAATAA AAGTTACATT CTTTGATTGG TAATATTGCC 1925ATTTATAACA AGACTCACTA ATGAGGGTAT CACTTTGACT GACTGATTTG TTAAAGTTTT 1985TAAGCCTCTC ATTTTCCTAA CCCAGAAATC ACAGCCTGAT TTTATTAAAA GTAGAGCTTC 2045ATTCATTTCA TACCATAGAT ACCATCCTAG TAAATCCAGA ACATATACAA GGTTCATGTG 2105AGTCTGCTTT CTTGACATGA TAGCATTGTT TGATGCAGTG GATATGTCAG AATGACTAAC 2165CTAGGAGTTT AAAACTCCTA AGAAACTAAA ACCTGTAAGA CATTTAAAAG TCTCCACAAT 2225TTTAATGTAT ACAAAGCTAT GTTACTGTGT AACACATTAC AGTTCAAATT CACTCCAGAA 2285ATAAAAGGCC AGTAGGATTA GGGACTCACT GGTAGTTTGG AGTCTCCCAG CACACATCCC 2345TCCTAGTGGG ATGATCTATT CACATATCTC CCAGCTTTTT TATTTTTGCT TCTGTATATC 2405ACAGTGAGTG GATGGCCCTT CAGCTTTTTC TCTCCTGGCC AGACATGCAG TCTTGCCTTT 2465AGATATCGCA GAGACAAAAT TCACAGCATG TCTTAAATCT TCCAGGATTT GCAAGAACCA 2525AATTGCTCAA CAGTATGTAT GTTTAGAGGG GTTAGACTCC TTTTTAAAAT CTGGATATCT 2585AACCACCTAC TTAAATCTGT TTGATAGTGT CAAACCACCC CCACCCTTGA TCCTCCCACC 2645CCCAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 2689序列號1序列的長度2660序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)線性序列的種類cDNA起源生物名人組織種類白細胞序列CCCACGCGTC CGGTTGGAGG TTCTGGGGCG CAGAACCGCT ACTGCTGCTT CGGTCTCTCC60TTGGGAAAAA ATAAAATTTG AACCTTTTGG AGCTGTGTGC TAAATCTTCA GTGGGACA 118ATG GGT TCA GAC AAA AGA GTG AGT AGA ACA GAG CGT AGT GGA AGA TAC 166Met Gly Ser Asp Lys Arg Val Ser Arg Thr Glu Arg Ser Gly Arg Tyr1 5 10 15GGT TCC ATC ATA GAC AGG GAT GAC CGT GAT GAG CGT GAA TCC CGA AGC 214Gly Ser Ile Ile Asp Arg Asp Asp Arg Asp Glu Arg Glu Ser Arg Ser20 25 30AGG 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CCATTCCCAC CTCAGTCCCT AAAGAACATC CTGATTCCCC 607CAGTCTTCAA GCACATGAAT TCAGAATGAA AGGTTTGCCA TGGCTAAGGA ATGTGACTCT 667TTGAAAACCA TGTTAGCATC TGAGGAACTT TTTTAAACTT TGTTTTAGGG ACTTTTTTTT 727CCTTAGGTAA GTAATGATTT ATAAACTCCT TTTTTTTTTT TTGACTATAG TCGGTTGCAT 787GGTTACTTTA AGCGTGGAAT CAAATGGAGT GGCATTTAGT TCAGGCGGCT TGTTCCTTGC 847CATGGCAAAG TATCAAGAAG ATCCCCAAGT CAAGTCACAT TTGTAAAGCT GCTTCCCAAT 907TGGCTTTGTC ACGCAGTGTT GAAGCAGTGG GAGAGAGATT CACCTGTTAT AAAGGAACTG 967ACTAACACAA GTATCCCGTC TATATCTGAA TGCTGTCTCT AGGTGTAAGC CGTGGTTTCG 1027CCTTCGTGGA GTTTTATCAC TTGCAAGATG CTACCAGCTG GATGGAAGCC AATCAGGTTG 1087CTTCACTCAC CAAGTCTAGA TATTCATGAA AATGGAACAA GTCTGTACAA TTTTAAAAAA 1147AGGTTGAAGG AGTGGTTTGT TCCAAAGGAG TGACTTTTTT TTAAAAAAAA AAGCTTTGTA 1207TATATTAAAA TTGATGTTAC TAGAATAAGT ACAGTACCAA GGACTTCATT ATAGAATTTG 1267TTCTGCCTTT AAACATGGCT ACCTACCTGG CAGGGCTTTG TTAACTACTG AATACCTGTC 1327TGGTAATCAC TAAAACATCT TAATGTTTCC CTTTTTTCTA GTTTGTTATA TTCCTATTAT 1387GTCCATTGAG AGTAAGCTTA GTATATCAAA CTCTCCATTT GACAGTGAAG AGAACATAGT 1447GAAAGTCTGT GGCGGCATTT TTATAAGTAA TTCCTTATTT CTGCCTGAAG ACCACAAAGC 1507CTCCTGGAGG CGTAACTGCT CAGACCGGTC TTCAGGGAAT ATTTAAGGAC TTAGTGGAAT 1567TTATGAACAA TAAGTCTGAT GAGATTAGCC TGGGAGTGGT GTCCTGCAGC TGTCTAATCT 1627AGTTAGAGTG GCATTAACAT TCTAATCTCC TTGAGAATGC CTTTTATAGT CTGTTCAAAG 1687CAAGTCATTG ATGGTTCTTC GAGGTAGTGT TAACTGAAGT GTTCTTCAGT TTGTCAAGAT 1747AATGTTCAGT GCTTGGCACT TAAATAACAT TTTTTGCAAG AACTCCAAGG CACATTATTG 1807AATGCCTTTA ACCAAGTGCA TTCTGGGAAG TTTGCTTGAC TCATTATCTT GCTTTTCTGC 1867AGCATTCTGT GATTTGAGTC ATCCATGAAT CCATGAATAA AAGTTACATT CTTTGATTGG 1927TAATATTGCC ATTTATAACA AGACTCACTA ATGAGGGTAT CACTTTGACT GACTGATTTG 1987TTAAAGTTTT TAAGCCTCTC ATTTTCCTAA CCCAGAAATC ACAGCCTGAT TTTATTAAAA 2047GTAGAGCTTC ATTCATTTCA TACCATAGAT ACCATCCTAG TAAATCCAGA ACATATACAA 2107GGTTCATGTG AGTCTGCTTT CTTGACATGA TAGCATTGTT TGATGCAGTG GATATGTCAG 2167AATGACTAAC CTAGGAGTTT AAAACTCCTA AGAAACTAAA ACCTGTAAGA CATTTAAAAG 2227TCTCCACAAT TTTAATGTAT ACAAAGCTAT GTTACTGTGT AACACATTAC AGTTCAAATT 2287CACTCCAGAA ATAAAAGGCC AGTAGGATTA GGGACTCACT GGTAGTTTGG AGTCTCCCAG 2347CACACATCCC TCCTAGTGGG ATGATCTATT CACATATCTC CCAGCTTTTT TATTTTTGCT 2407TCTGTATATC ACAGTGAGTG GATGGCCCTT CAGCTTTTTC TCTCCTGGCC AGACATGCAG 2467TCTTGCCTTT AGATATCGCA GAGACAAAAT TCACAGCATG TCTTAAATCT TCCAGGATTT 2527GCAAGAACCA AATTGCTCAA CAGTATGTAT GTTTAGAGGG GTTAGACTCC TTTTTAAAAT 2587CTGGATATCT AACCACCTAC TTAAATCTGT TTGATAGTGT CAAACCACCC CCACCCTTGA 2647TCYTCCCACC CCC 2660序列號2序列的長度155序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)線性序列的種類cDNA起源生物名人組織種類白細胞序列CACTTATAAA ATGTTAGGGC TTAATATTAT TCATAGATCG AGGATAGTTT CATTCTTAGT 60CGCCTCCTTA GTCACTCTTC CTATACCAAT CTGAGACCAT TTTACAATTT AGAAAAGACA 120AATAACTGGT TGGGTTACTT GATAGTATAA TAACC 155序列號3序列的長度305序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)線性序列的種類cDNA起源生物名人組織種類白細胞序列TCATGAAGTG AAGCCAACTG TTTAGACTAG AATGTTATGA GATTAAACCC ACNNNNNNTT 60ATTCATAGAC ATAAACCCTC ATTTTAATTA GTGGATCTGG ATTTTTGTCA TATGTGGAAT 120CATAATTTAA ACAAAATCAA CTAAGATGAT CCAAGTTCCA CACAACTGCA CTTCAATATT 180CAAGTCGGTG TGAAGATGCC TGACTACTGC 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CCTACAGCT 219序列號17序列的長度191序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)線性序列的種類cDNA起源生物名人組織種類白細胞序列ACAGTGAGTG TGGCTGAAAC CTAAGCTGAA GGAAGGGAGG AGCAGGCACT GCCATGAGGG60GTCCCTGGAC AGAAACTCTT CAGCAGGCCT TGAAGTTTAG TTCAGGGGCT ACATGGAATA 120CCACTATTTA GCACACAGGT GTGATCTGAG GTGAGGGACT ACCTTTTCGA TCTTGGTTTT 180CTCATTTATT T191序列號18序列的長度148序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)線性序列的種類cDNA起源生物名人組織種類白細胞序列CTGGAGGTGA AGGGAAGGAA AGAAAGGAAA AACTATCTAC CTGGCAGGAA AAGAGATAAG60CTCCCAAGAA CACCAAAGCA GATGATGAGT CTAGCTCTAC CCAGCCTTCC TCCCCACGAA 120TCCAGATCAT AGTAAGAAAC TCTGGGCT 148序列號19序列的長度306序列類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓樸學(xué)線性序列的種類cDNA起源生物名人組織種類白細胞序列CCACCACCAG AAATGAACAA AAAGCATTTT ACCTAAAAAT ACACCAGCAA AATGTACTCA60GCTTCAATCA CAAATACGAC TGCTTAAAAC CGCAGAAATT TCCTCAACAC TCAGCCTTTA 120TCACTCAGCT GGATTTTTTC CTTCAACAAT CACTACTCCA AGCATTGGGG AACACAACTT 180TTAATCATAC TCCAGTCGTT TCACAATGCA TTCTAATAGC AGCGGGATCA GAACAGTACT 240GCATTTACTT GCCAACAGAA CAGACAGACC TGAAGTCAAG ACAACTGCAT TCTCTGTGAA 300GTCTGT 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GCAA序列號49序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTTCTGCTCT CAGCAGATTG GTTA序列號50序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GCCAACATCT GAACTAAATA CTGC序列號51序列的長度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTTCAGTGAA TGTTACCTAG AAACA序列號52序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GGAGTGAAAA CTGTCTTGTT CATC序列號53序列的長度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTATGACAAA TAGTTTCTGC CTGAT序列號54序列的長度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GATTAACAAA GATGTACAGA CTGAG序列號55序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GAGACAGCAT TCAGATATAG ACGG序列號56序列的長度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GCGTGGAATC AAATGGAGTG GC序列號57序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GATGGCCTGT GTGAACAGAT TAAT序列號58序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GAGAGAGATG TCAGAGTCAT TAGC序列號59序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GATCCCCACA ATTTCTTGTG ATTG序列號60序列的長度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTTCCCCTAA AATAATGTGG TAATG序列號61序列的長度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GAGGATACTC TCCAATGGTG ATG序列號62序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTCTTAACAT CTAGCCTACT GGAG序列號63序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GAGAGGAGCC ATGTATACAA ACCA序列號64序列的長度26序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GCACGCAGGA TCAGATATAG TAATTC序列號65序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GCTGAAACCT AAGCTGAAGGAAGG序列號66序列的長度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTCCCTCACC TCAGATCACA CC序列號67序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GCTATCTACC TGGCAGGAAA AGAG序列號68序列的長度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GAGTTTCTTA CTATGATCTG GATTC序列號69序列的長度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GCAAAATGTA CTCAGCTTCA ATCAC序列號70序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTAAATGCAG TACTGTTCTG ATCC序列號71序列的長度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GAATGCTTCA TTCTCATTGT TTAAGG序列號72序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTCACTAGGA TTCCACAGAA CTTC序列號73序列的長度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GAGGTAGGGC TTCCCTTCGC TA序列號74序列的長度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GCATAACAAG TGACAGGGTT AGTTA序列號75序列的長度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GGTGCTCCTT CCTTACACTG GT序列號76序列的長度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GACTACACAT AAACCCACCC CAG序列號77序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GGGTACAGGA TTTCTAAGAA GTGG序列號78序列的長度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GGAGAAAATT TCAGCTCATC TGAAG序列號79序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GCTGAAGTTA AGCATTAATA CGCC序列號80序列的長度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GCGGCTGTAA TGTGCAATGA TGT序列號81序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GACAGCAACC TAATAACAGC TGTC序列號82序列的長度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTCCTAGGCA CTTGTCACTA GG序列號83序列的長度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GAGGGGACTT CCAAGAGTCT CT序列號84序列的長度25序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTCTTCAGGA AAATTGTAGT TACAG序列號85序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTTACAAACA CACACGAAGT TCCT序列號86序列的長度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GACTTCCTAA GGCACACTCA GC序列號87序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTTTAACTAC CTCTCAGGTC ATGA序列號88序列的長度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GTCGCCAAGG CTGTAGTGCA AT序列號89序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GAAATAGGTA TCCCTTGATG TCGA序列號90序列的長度24序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GACCAAGAAT TCAGTTCATC AGTT序列號91序列的長度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GAATGAACCA GAGCCAGGAC AG序列號92序列的長度22序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列GCCTTGTATG TATGCCTGTG CC序列號93序列的長度21序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列AAGAGTCCAC CAGGCCATGG A序列號94序列的長度23序列類型核酸鏈數(shù)單鏈拓樸學(xué)線性序列的種類其它核酸、合成cDNA序列TACCTTGTGT ACTTCTAGCT GAG
權(quán)利要求
1．具有序列號1～31中堿基序列的IgA腎病相關(guān)基因的DNA。
2．在嚴格條件下與具有權(quán)利要求1中堿基序列的DNA進行雜交的DNA。
3．包含權(quán)利要求1和2中DNA堿基序列的一部分的寡核苷酸。
4．包含權(quán)利要求1和2中DNA互補堿基序列的一部分的寡核苷酸。
5．應(yīng)用權(quán)利要求3和4中寡核苷酸檢測IgA腎病相關(guān)基因mRNA的方法。
6．包含權(quán)利要求3和4中寡核苷酸的IgA腎病診斷藥物。
7．應(yīng)用權(quán)利要求3和4中寡核苷酸抑制IgA腎病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和該mRNA翻譯的方法。
8．包含權(quán)利要求3和4中寡核苷酸的IgA腎病治療藥物。
9．用差異顯示法從IgA腎病患者白細胞中獲取IgA腎病相關(guān)基因的方法。
10．具有序列號32中氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
11．編碼權(quán)利要求10中蛋白質(zhì)的DNA。
12．權(quán)利要求11中的DNA，它具有序列號1中的堿基序列。
13．在嚴格條件下與具有權(quán)利要求12中堿基序列的DNA進行雜交的DNA
14．由權(quán)利要求11～13中的DNA和載體構(gòu)成的重組載體。
15．將權(quán)利要求14中的重組載體導(dǎo)入宿主細胞而得到的轉(zhuǎn)化體。
16．蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求15中的轉(zhuǎn)化體，在培養(yǎng)物中生成并積聚權(quán)利要求10中的蛋白質(zhì)，以及從培養(yǎng)物中回收該蛋白質(zhì)。
17．與權(quán)利要求10中的蛋白質(zhì)進行特異反應(yīng)的抗體。
18．用權(quán)利要求17中的抗體對該蛋白質(zhì)進行免疫學(xué)檢測的方法。
19．含有權(quán)利要求17中抗體的IgA腎病診斷藥物。
20．含有權(quán)利要求17中抗體的IgA腎病治療藥物。
全文摘要
用差異顯示法從IgA腎病患者白細胞中取得新基因的方法;含有以本發(fā)明DNA堿基序列為基礎(chǔ)的寡核苷酸用于IgA腎病的診斷藥物和治療藥物。
文檔編號C12N15/12GK1214735SQ97193370
公開日1999年4月21日 申請日期1997年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月5日
發(fā)明者石渡哲義, 桜田干子, 西村彩子, 中川智, 西達也, 久我哲郎, 澤田滋正, 武井正美 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社