一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立及傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)及儲(chǔ)存方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，以及將其傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)及儲(chǔ)存方法，屬于肝細(xì)胞體外培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】；本發(fā)明旨在尋求一種可以替換代價(jià)昂貴的應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)繁殖兔肝球蟲(chóng)病原收集的方法，通過(guò)兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立及傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)及儲(chǔ)存方法體外建立，能夠穩(wěn)定的實(shí)現(xiàn)兔體外肝細(xì)胞快速、便捷、經(jīng)濟(jì)的傳代，以便能夠在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)體外繁殖球蟲(chóng)病原的目的；本發(fā)明通過(guò)摸索和研究兔年齡、擊殺方式、消化酶的選擇、培養(yǎng)方式的選擇、消化時(shí)間、細(xì)胞濃度、血清的選擇、培養(yǎng)瓶的選擇、濕度的控制及貼壁試劑的篩選等，成功的解決了兔單層肝細(xì)胞模型培養(yǎng)的建立并可順利的傳代，并摸索了細(xì)胞的凍存及保存的方式。
【專利說(shuō)明】一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立及傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)及儲(chǔ)存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，以及將其傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)及儲(chǔ)存方法，屬于肝細(xì)胞體外培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]兔球蟲(chóng)是家兔最常見(jiàn)的一種寄生蟲(chóng)，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)危害極大，幼兔感染率高達(dá)90%以上，死亡率高達(dá)40-70%，除兔斯氏艾美爾/肝球蟲(chóng)斯氏艾美爾球蟲(chóng)獨(dú)立寄生于兔肝膽管上皮細(xì)胞外，其余13種都寄生于腸。各類(lèi)球蟲(chóng)免疫沒(méi)有交叉保護(hù)性，腸球蟲(chóng)可以通過(guò)糞便收集提純而獲得蟲(chóng)株，然后進(jìn)行疫苗的研制，但肝球蟲(chóng)的蟲(chóng)株病料不易收集，只能在兔子屠宰后從內(nèi)臟中收集，這樣使得肝球蟲(chóng)蟲(chóng)株提純收集及繁殖受到極大地限制，從而影響疾病的診斷及治療。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)斯氏艾美爾球蟲(chóng)即兔肝球蟲(chóng)的研究不多，對(duì)它造成的危害性也沒(méi)有引起足夠的重視，實(shí)用性的研究成果基本上處于零的狀態(tài)。[0003]如果能夠建立兔體外單層肝細(xì)胞系模型，并得到肝細(xì)胞株的連續(xù)傳代培養(yǎng)及儲(chǔ)存方法，就可以模擬兔斯氏艾美爾/肝球蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)循環(huán)模式，進(jìn)而達(dá)到體外獲得極難取得的病源——具有無(wú)限繁殖能力的球蟲(chóng)蟲(chóng)株的目的。目前通過(guò)殺兔取肝得到球蟲(chóng)蟲(chóng)株，獲得的球蟲(chóng)蟲(chóng)株數(shù)量有限且試驗(yàn)成本很高,遏制了兔肝球蟲(chóng)疫苗的研究。因此體外培養(yǎng)兔肝細(xì)胞并獲得球蟲(chóng)蟲(chóng)株，不僅可以減少對(duì)兔子的殺戮，帶來(lái)動(dòng)物福利；還可以降低成本，減少購(gòu)買(mǎi)兔子的費(fèi)用，最重要的是為解決兔肝球蟲(chóng)疫苗蟲(chóng)株的大量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，為廣大兔養(yǎng)殖戶帶來(lái)更高的經(jīng)濟(jì)效益。
[0004]但是兔肝原代細(xì)胞的培養(yǎng)難度很大，特別是單層細(xì)胞的培養(yǎng)。在產(chǎn)品方面，2013年才從網(wǎng)上查到有一家公司在出售兔肝細(xì)胞，但經(jīng)咨詢后為懸浮細(xì)胞，沒(méi)有貼壁細(xì)胞，且據(jù)說(shuō)僅能傳代10代左右。在理論方面，雖然有論文發(fā)表，但依據(jù)其提供的方法并不能培養(yǎng)成功，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)所需的環(huán)境及技術(shù)要求較高，原代細(xì)胞培養(yǎng)成功后，大部分的報(bào)道不能超過(guò)3代進(jìn)行傳代。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)參考了《乳兔和成年兔肝細(xì)胞體外分離及培養(yǎng)的比較研究》，國(guó)外文獻(xiàn)參考了 ((Identification of Carbohydrates on Eimeria stiedai Sporozoitesand Their Role in Invasion of Cultured Cells in vitr0.Department of VeterinaryPhysiology》(Research Center for Molecular Protozoology, Obihiro University ofAgriculture and Veterinary Medicine, Obihiro 080, Japan)。但按其參考文獻(xiàn)的流程程序，均未能培養(yǎng)出單層肝細(xì)胞，尤其是在應(yīng)用胰酶、膠原酶消化的濃度和時(shí)間方面的數(shù)據(jù)，與發(fā)明人的試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有較大出入。同時(shí)文獻(xiàn)中提到的乳兔肝細(xì)胞僅僅能傳代4代、成年兔為2代，不可能培養(yǎng)出連續(xù)性的肝細(xì)胞株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在尋求一種可以替換代價(jià)昂貴的應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)繁殖兔肝球蟲(chóng)(斯氏艾美爾球蟲(chóng))病原收集的方法，通過(guò)兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立及傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)及儲(chǔ)存方法體外建立，能夠穩(wěn)定的實(shí)現(xiàn)兔體外肝細(xì)胞的快速、便捷、經(jīng)濟(jì)的傳代，以便能夠在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)體外繁殖球蟲(chóng)病原的目的。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，包括如下步驟:
a、 兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于消毒液中0.5-2分鐘后取出，浙凈消毒液后，無(wú)菌取出兔子的肝臟放入培養(yǎng)皿中；一般兔子的擊殺方式為頸靜脈放血致死和頸動(dòng)脈放血致死，這兩種方式在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均不能得到貼壁肝細(xì)胞，經(jīng)過(guò)研究人員的縝密探討和大膽嘗試，最終確定了擊打兔子后腦的不放血擊殺方式，且擊殺兔子后應(yīng)盡快獲取肝細(xì)胞；
b、兔子肝臟的預(yù)處理:將兔子肝臟在培養(yǎng)皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊；剪碎過(guò)程中應(yīng)當(dāng)將血管、膽管等肥肝組織剔除；
C、消化得到分散兔子肝細(xì)胞:將剪碎的兔子肝細(xì)胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化8~15分鐘；所述消化液為0.025%胰酶；此處所述珠瓶為盛有玻璃微珠的三角瓶，玻璃微珠占三角瓶體積的1/4左右；吹打分散的方法不能夠很好的適用于本發(fā)明，采用珠瓶，利用震蕩時(shí)玻璃微珠之間及其與瓶壁紙件的摩擦和碰撞，能夠很好的對(duì)剪碎的肝組織進(jìn)行分散；
d、收集細(xì)胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經(jīng)4-6層紗布過(guò)濾到小燒杯內(nèi)，重復(fù)收集步驟4-5次，得到含有消化好的兔子肝細(xì)胞的懸液；
e、離心:將所述懸液分裝入IOmL的離心管中，800_1000r/min離心5-7分鐘；
f、培養(yǎng):棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入180-210 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-6天，得到兔體外單層肝細(xì)胞系模型。所述恒溫培養(yǎng)箱為隔水式。
[0007]上述步驟中b-d、f均需在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。
[0008]本發(fā)明所用的兔子購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，要求體重500g左右的灰色家兔幼兔，體重可在±30g范圍內(nèi)浮動(dòng)。
[0009]本發(fā)明采用的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，瓶蓋有透氣孔，或者瓶蓋旋緊后擰松I圈。
[0010]上述方法中所述的0.025%胰酶可以用1%的I型膠原酶替換；所述消毒液為新潔爾滅消毒液。
[0011]將得到的兔體外肝細(xì)胞單層模型傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
第一步，收集細(xì)胞
將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的原有細(xì)胞生長(zhǎng)液傾出，加入0.02%的Versene溶液2mL，搖晃3_6次倒掉，重復(fù)該操作一次，然后加入Versene胰蛋白酶溶液，放置至細(xì)胞培養(yǎng)瓶的邊緣有小點(diǎn)狀的透明出現(xiàn)，立刻倒掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的液體，以手拍擊細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞呈流沙樣脫落；若細(xì)胞未呈流沙樣脫落，則利用傾倒后細(xì)胞培養(yǎng)瓶中剩余的液體繼續(xù)放置一段時(shí)間，直至出現(xiàn)流沙樣情況；然后加入DMEM液2mL，吹打細(xì)胞直至瓶壁透亮，得到細(xì)胞懸液；
第二步，細(xì)胞的傳代培養(yǎng)將細(xì)胞懸液分成兩份接種到2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入200 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱。
[0012]根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，也可以按1:2-4將細(xì)胞懸液分裝到培養(yǎng)瓶中。
[0013]得到的連續(xù)性肝細(xì)胞株的儲(chǔ)存方法，包括如下步驟:
用Versene胰蛋白酶溶液常規(guī)消化培養(yǎng)得到的細(xì)胞單層，然后以500 Xg離心10min收集細(xì)胞；按照25mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)7-9天的細(xì)胞消化離心后收集到的細(xì)胞添加ImL細(xì)胞冷凍保存液于I只安瓶；
將安瓶集中放在盒中，分三步緩慢降溫:(1)4°C放置2h，(2)-20°C放置lh，(3)置于_70°C超低溫冰箱或液氮中保存。
[0014]所述安瓶降溫步驟的第(2)步，_20°C放置的時(shí)間嚴(yán)禁超過(guò)lh。
[0015]冷凍后的兔傳代肝細(xì)胞株的復(fù)蘇方法，包括如下步驟:
(1)迅速解凍，取出安瓶后拿止血鉗夾好，立即投入37°C水浴中，至全部溶解；不可讓水沒(méi)過(guò)管蓋；
(2)用70%酒精浸泡消毒后打開(kāi)安瓶，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)液，以500 Xg離心10min后，倒掉液體；
(3)加細(xì)胞生長(zhǎng)液使細(xì)胞濃度為0.2% ;按I只安瓶復(fù)蘇I瓶25mL的細(xì)胞；
(4)觀察細(xì)胞貼壁后，輕輕倒出舊細(xì)胞生長(zhǎng)液，換新的細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下有益效果。
[0017]1、兔肝細(xì)胞是兔斯氏艾美爾/肝球蟲(chóng)高選擇性的生長(zhǎng)部位，本發(fā)明建立了兔體外單層肝細(xì)胞系模型及傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)及儲(chǔ)存方法，從而使得模擬兔斯氏艾美爾/肝球蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)循環(huán)模式，達(dá)到球蟲(chóng)蟲(chóng)株無(wú)限制的繁殖，體外獲得極難取得的病源能夠?qū)崿F(xiàn)，解決了兔肝球蟲(chóng)疫苗蟲(chóng)株難以大量生產(chǎn)的遏制瓶頸。
[0018]2、本發(fā)明 不僅可以成功的培養(yǎng)出兔體外單層肝細(xì)胞模型，同時(shí)又將其連續(xù)不斷的培養(yǎng)繁殖下去，成功的建立了肝細(xì)胞株；同時(shí)將方法進(jìn)行簡(jiǎn)化，使細(xì)胞培養(yǎng)由原來(lái)繁瑣的步驟改變?yōu)榭焖?、便捷的培養(yǎng)方式。從而建立起兔體外單層肝原代細(xì)胞體外培養(yǎng)方式，同時(shí)又保持了兔肝細(xì)胞良好的結(jié)構(gòu)和功能，為后續(xù)的科研奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0019]3、本發(fā)明得到的兔肝原代細(xì)胞為貼壁細(xì)胞。通過(guò)研究得出的連續(xù)性兔肝貼壁細(xì)胞株能夠很好的保持兔肝細(xì)胞的生理生化性狀，在篩選細(xì)胞時(shí)，形成特有的細(xì)胞株，并且有別于現(xiàn)有的兔肝懸浮細(xì)胞，可以供研究和觀察兔肝球蟲(chóng)的生命周期及繁殖。
[0020]4、本發(fā)明建立的兔體外單層肝細(xì)胞系模型，能夠順利的傳代至11代，且得到的11代細(xì)胞仍具有良好的活性，能夠繼續(xù)傳代。同時(shí)并摸索了傳代細(xì)胞的凍存和保存方式，從而形成連續(xù)性兔肝細(xì)胞株，為兔肝球蟲(chóng)疫苗的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0021]5、本發(fā)明通過(guò)體外培養(yǎng)兔肝原代細(xì)胞株，替代了實(shí)驗(yàn)兔的選用，極大地節(jié)約了研發(fā)成本。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為采用0.025胰酶消化IOmin的兔肝。
[0023]圖2為胰酶消化的兔肝細(xì)胞生長(zhǎng)5天的貼壁情況。
[0024]圖3為培養(yǎng)23天的單核和雙核的兔肝細(xì)胞。【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0026]實(shí)施例1
一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，包括如下步驟:
a、兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于新潔爾滅消毒液中2分鐘后取出，浙凈消毒液后，無(wú)菌取出兔子的肝臟放入培養(yǎng)皿中；
b、兔子肝臟的預(yù)處理:將兔子肝臟在培養(yǎng)皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊；
C、消化得到分散兔子肝細(xì)胞:將剪碎的兔子肝細(xì)胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化8分鐘；所述消化液為0.025%胰酶；
d、收集細(xì)胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經(jīng)4層紗布過(guò)濾到小燒杯內(nèi)，重復(fù)收集步驟4次，得到含有消化好的兔子肝細(xì)胞的懸液；
e、離心:將所述懸液分裝入IOmL的離心管中，800r/min離心6分鐘；
f、培養(yǎng):棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入180 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，得到兔體外單層肝細(xì)胞系模型；
所述步驟b-d、e均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。
[0027]實(shí)施例2
一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，包括如下步驟:
a、兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于新潔爾滅消毒液中0.5分鐘后取出，浙凈消毒液后，無(wú)菌取出兔子的肝臟放入培養(yǎng)皿中；
b、兔子肝臟的預(yù)處理:將兔子肝臟在培養(yǎng)皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊；
C、消化得到分散兔子肝細(xì)胞:將剪碎的兔子肝細(xì)胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化10分鐘；所述消化液為0.025%胰酶；
d、收集細(xì)胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經(jīng)5層紗布過(guò)濾到小燒杯內(nèi)，重復(fù)收集步驟4次，得到含有消化好的兔子肝細(xì)胞的懸液；
e、離心:將所述懸液分裝入IOmL的離心管中，900r/min離心6分鐘；
f、培養(yǎng):棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入190 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，得到兔體外單層肝細(xì)胞系模型；
所述步驟b-d、e均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。
[0028]實(shí)施例3
一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，包括如下步驟:
a、兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于新潔爾滅消毒液中I分鐘后取出，浙凈消毒液后，無(wú)菌取出兔子的肝臟放入培養(yǎng)皿中；
b、兔子肝臟的預(yù)處理:將兔子肝臟在培養(yǎng)皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊；C、消化得到分散兔子肝細(xì)胞:將剪碎的兔子肝細(xì)胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化12分鐘；所述消化液為0.025%胰酶；
d、收集細(xì)胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經(jīng)4層紗布過(guò)濾到小燒杯內(nèi)，重復(fù)收集步驟5次，得到含有消化好的兔子肝細(xì)胞的懸液；
e、離心:將所述懸液分裝入IOmL的離心管中,800r/min離心7分鐘；
f、培養(yǎng):棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入200 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，得到兔體外單層肝細(xì)胞系模型；
所述步驟b-d、e均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。
[0029]實(shí)施例4
一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，包括如下步驟:
a、兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于新潔爾滅消毒液中1.5分鐘后取出，浙凈消毒液后，無(wú)菌取出兔子的肝臟放入培養(yǎng)皿中；
b、兔子肝臟的預(yù)處理:將兔子肝臟在培養(yǎng)皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊；
C、消化得到分散兔子肝細(xì)胞:將剪碎的兔子肝細(xì)胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化15分鐘；所述消化液為0.025%胰酶；
d、收集細(xì)胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經(jīng)6層紗布過(guò)濾到小燒杯內(nèi)，重復(fù)收集步驟5次，得到含有消化好的兔子肝細(xì)胞的懸液；
e、離心:將所述懸液分裝入IOmL的離心管中，1000r/min離心5分鐘；
f、培養(yǎng):棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入210 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，得到兔體外單層肝細(xì)胞系模型；
所述步驟b-d、e均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。
[0030]實(shí)施例5
以實(shí)施例3得到的原代兔體外單層肝細(xì)胞系模型為例，一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
第一步，收集細(xì)胞
將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的原有細(xì)胞生長(zhǎng)液傾出，加入0.02%的Versene溶液2mL，搖晃3_6次倒掉，重復(fù)該操作一次，然后加入Versene胰蛋白酶溶液，放置至細(xì)胞培養(yǎng)瓶的邊緣有小點(diǎn)狀的透明出現(xiàn)，立刻倒掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的液體，以手拍擊細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞呈流沙樣脫落，然后加入細(xì)胞生長(zhǎng)液2mL，吹打細(xì)胞直至瓶壁透亮；上述步驟以手拍擊細(xì)胞培養(yǎng)瓶時(shí)，若細(xì)胞未呈流沙樣脫落，則利用傾倒后細(xì)胞培養(yǎng)瓶中剩余的液體繼續(xù)放置一段時(shí)間，直至出現(xiàn)流沙樣情況；
第二步，細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
將吹打分散后的細(xì)胞分成兩份，每份裝入一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入200 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱。
[0031]一、所用Versene溶液(0.02%)米用如下原料配制:
NaCl 8.0g, KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4 1.15g (或 Na2HPO4* 12H20 2.90g)、乙二胺四醋酸二鈉(EDTA) 0.2g、雙蒸水lOOOmL。
[0032]配好后于121 °C高壓滅菌15min，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033]二、所用Versene胰蛋白酶溶液采用如下原料配制:
無(wú)鈣、鎂PBS胰蛋白酶溶液(0.25%) 0.2mL、上述Versene溶液(0.02%) 2mL。
[0034]三、無(wú)鈣、鎂磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制:
NaCl 8.0g, KCl 0. 2g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4 0.2g、雙蒸水 1000mL ;
依次稱取各試劑并依次溶解在雙蒸水中，將得到的溶液于121°C下15min高壓滅菌，冷卻后裝入滅菌瓶，取樣檢驗(yàn)無(wú)菌后置于普通冰箱貯存。
[0035]四、無(wú)鈣、鎂PBS胰蛋白酶溶液(0.25%)的配制:
原料:上述無(wú)鈣、鎂PBS lOOOmL、胰蛋白酶(1:250) 2.5g ；
將胰蛋白酶加入上述無(wú)鈣、鎂PBS中攪拌至溶解，用賽氏濾器過(guò)濾除菌，裝入滅菌瓶中，取樣檢驗(yàn)無(wú)菌后于_20°C貯存。
[0036]實(shí)施例6
一種兔體外肝細(xì)胞單層模型傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的儲(chǔ)存方法，包括如下步驟:
用Versene胰蛋白酶溶液常規(guī)消化培養(yǎng)得到的細(xì)胞單層，然后以500 Xg離心10min收集細(xì)胞；按照25mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)7-9天的細(xì)胞消化離心后收集到的細(xì)胞添加ImL細(xì)胞冷凍保存液于I只安瓶；
將安瓶集中放在盒中，分三步緩慢降溫:(1)4°C放置2h，(2)-20°C放置lh，(3)置于_70°C超低溫冰箱或液氮中保存。
[0037]所述安瓶降溫步驟的第(2)步，_20°C放置的時(shí)間不得超過(guò)lh。
[0038]細(xì)胞冷凍后的復(fù)蘇方法為:
(1)迅速解凍，取出安瓶后拿止血鉗夾好，立即投入37°C水浴中，至全部溶解；不可讓水沒(méi)過(guò)管蓋；
(2)用70%酒精浸泡消毒后打開(kāi)安瓶，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)液，以500 Xg離心10min后，倒掉液體；
(3)加細(xì)胞生長(zhǎng)液使細(xì)胞濃度為0.2% ;按I只安瓶復(fù)蘇I瓶25mL的細(xì)胞；
(4)觀察細(xì)胞貼壁后，輕輕倒出舊細(xì)胞生長(zhǎng)液，換新的細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
[0039]本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來(lái)概述。因此，無(wú)論從那一點(diǎn)來(lái)看，本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明而不能限制發(fā)明，權(quán)利要求書(shū)指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說(shuō)明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何變化，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，其特征在于包括如下步驟: a、兔子肝臟的獲取:將兔子擊昏腦部致死后，置于消毒液中0.5-2分鐘后取出，浙凈消毒液后，無(wú)菌取出兔子的肝臟放入培養(yǎng)皿中； b、兔子肝臟的預(yù)處理:將兔子肝臟在培養(yǎng)皿中用平衡鹽溶液洗凈血液后，更換新的平衡鹽溶液，將兔子肝臟邊剪碎邊用平衡鹽溶液清洗，將兔子肝臟剪成約Imm3的碎塊； C、消化得到分散的兔子肝細(xì)胞:將剪碎的兔子肝細(xì)胞放入珠瓶中，震蕩打散，然后加入消化液，將珠瓶放入37°C的恒溫水浴箱中消化8~15分鐘；所述消化液為0.025%胰酶； d、收集細(xì)胞懸液:取出珠瓶，加入DMEM液充分震蕩至溶液渾濁，經(jīng)4-6層紗布過(guò)濾到小燒杯內(nèi)，重復(fù)收集步驟4-5次，得到含有消化好的兔子肝細(xì)胞的懸液； e、離心:將所述懸液分裝入1OmL的離心管中，800_1000r/min離心5-7分鐘； f、培養(yǎng):棄去上清液，將離心管中的沉淀加少量DMEM液吹打，打散倒入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入180-210 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-6天，得到兔體外單層肝細(xì)胞系模型； 所述步驟b-d、f均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，其特征在于:作為肝臟來(lái)源的兔子為體重470-530g的幼兔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，其特征在于:所述步驟e離心后得到的壓積的肝細(xì)胞進(jìn)行步驟f的培養(yǎng)操作時(shí)，按照每ImL細(xì)胞傳6個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，其特征在于:所述0.025%胰酶替換為1%的I型膠原酶，消化時(shí)間則為13-16min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兔體外單層肝細(xì)胞系模型建立方法，其特征在于:所述消毒液為新潔爾滅消毒液。
6.一種權(quán)利要求1得到的兔體外肝細(xì)胞單層模型傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟: 第一步，收集細(xì)胞 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的原有細(xì)胞生長(zhǎng)液傾出，加入0.02%的Versene溶液2mL，搖晃3_6次倒掉，重復(fù)該操作一次，然后加入Versene胰蛋白酶溶液，放置至細(xì)胞培養(yǎng)瓶的邊緣有小點(diǎn)狀的透明出現(xiàn)，立刻倒掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的液體，以手拍擊細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞呈流沙樣脫落，然后加入DMEM液2mL，吹打細(xì)胞直至瓶壁透亮，得到細(xì)胞懸液； 第二步，細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 將細(xì)胞懸液分成兩份接種到2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入200 μ L雙抗、ImL胎牛血清，用DMEM液定溶至刻度線，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的兔體外肝細(xì)胞單層模型傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的培養(yǎng)方法，其特征在于:以手拍擊細(xì)胞培養(yǎng)瓶時(shí)，若細(xì)胞未呈流沙樣脫落，則利用傾倒后細(xì)胞培養(yǎng)瓶中剩余的液體繼續(xù)放置一段時(shí)間，直至出現(xiàn)流沙樣情況，再進(jìn)行后續(xù)操作。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的兔體外肝細(xì)胞單層模型傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的儲(chǔ)存方法，其特征在于包括如下步驟: 用Versene胰蛋白酶溶液 常規(guī)消化培養(yǎng)得到的細(xì)胞單層，然后以500 Xg離心10min收集細(xì)胞；按照25mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)7-9天的細(xì)胞消化離心后收集到的細(xì)胞添加1ml細(xì)胞冷凍保存液于1只安瓶； 將安瓶集中放在盒中，分三步緩慢降溫:(1) 4°C放置2h，(2)-20°C放置lh，(3)置于_70°C超低溫冰箱或液氮中保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的兔體外肝細(xì)胞單層模型傳代為連續(xù)性肝細(xì)胞株的儲(chǔ)存方法，其特征在于:所述安瓶降溫步驟的第(2)步，_20°C放置的時(shí)間不得超過(guò)lh。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞冷凍后的復(fù)蘇方法，其特征在于包括如下步驟: (1)迅速解凍，取出安瓶后拿止血鉗夾好，立即投入37°C水浴中，至全部溶解；不可讓水沒(méi)過(guò)管蓋； (2)用70%酒精浸泡消毒后打開(kāi)安瓶，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)液，以.500 Xg離心10min后，倒掉液體； (3)加細(xì)胞生長(zhǎng)液使細(xì)胞濃度為0.2% ;按1只安瓶復(fù)蘇I瓶25mL的細(xì)胞； (4)觀察細(xì)胞貼壁后，輕輕倒出舊細(xì)胞生長(zhǎng)液，換新的細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103923875SQ201410159927
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】鞏紅霞, 鞏強(qiáng), 張祖維, 田文霞, 傅英文, 賈廣樂(lè), 雷宇平, 王芬, 宋歡, 安偉 申請(qǐng)人:鞏紅霞