一種判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，具體包括待判斷花鱸組織總RNA抽提、cDNA第一條鏈合成，PCR擴(kuò)增催乳素受體基因，最后通過觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳照片上是否有催乳素受體基因表達(dá)條帶來判斷所檢測的花鱸是淡水養(yǎng)殖還是海水養(yǎng)殖。本發(fā)明公開的方法簡單、準(zhǔn)確，可應(yīng)用于水產(chǎn)品領(lǐng)域的監(jiān)管。
【專利說明】一種判斷花I盧養(yǎng)殖水體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，其可以確定所檢測花鱸是淡水還是海
水養(yǎng)殖的產(chǎn)品。
【背景技術(shù)】
[0002]花自盧{lateolabrax japonicus)為近海中下層經(jīng)濟(jì)魚類，也是目前海水主要養(yǎng)殖種類，該魚病害少、生長快、易捕撈、產(chǎn)量高、效益好、肉質(zhì)嫩、味道美、營養(yǎng)豐富，有生肌補(bǔ)血和滋補(bǔ)強(qiáng)身等保健作用，深受人們喜愛。經(jīng)過淡化和馴養(yǎng)，花鱸也開始淡水中大面積養(yǎng)殖。
[0003]包括花鱸在內(nèi)的廣鹽性魚類，其在淡水養(yǎng)殖和海水養(yǎng)殖的魚類品質(zhì)存在差異，商品價(jià)格也有差異，因此需要建立一種鑒別此魚類是淡水養(yǎng)殖還是海水養(yǎng)殖產(chǎn)品的技術(shù)方法，以防淡水魚冒充海水魚的出現(xiàn)，從而保障消費(fèi)者權(quán)益；而目前還沒有關(guān)于此類技術(shù)方法的報(bào)道。
[0004]催乳素受體基因(prolactin receptor, PRLR)參與魚類適應(yīng)鹽度變化的適應(yīng)調(diào)節(jié)，海水和淡水養(yǎng)殖魚類不同組織的PRLR基因的表達(dá)水平存在差異，可用來檢測花鱸的養(yǎng)
殖鹽度差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，以確定花鱸是淡水養(yǎng)殖還是海水養(yǎng)殖，為區(qū)分養(yǎng)殖花鱸產(chǎn)品提供質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。
[0006]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，包括以下步驟:
(1)提取待判斷花鱸組織的總RNA，所述組織為鰓或腎臟組織；
(2)根據(jù)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒的操作說明，以上述總RNA為反應(yīng)物合成cDNA第一條
鏈；
(3)分別以引物SEQID N0.1和SEQ ID N0.2為正向引物和反向引物，以上述cDNA第一條鏈為模板，在PCR buffer、dNTP、Taq酶以及滅菌的去離子水存在下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
(4)利用凝膠電泳檢測上述擴(kuò)增產(chǎn)物，如果電泳圖上有催乳素受體基因表達(dá)條帶，則待判斷花鱸的養(yǎng)殖水體為海水，如果電泳圖上沒有催乳素受體基因表達(dá)條帶，則待判斷花鱸的養(yǎng)殖水體為淡水；即完成花鱸養(yǎng)殖水體的判斷；
其中，SEQ ID N0.1 為 5，- CAACATCACCGTGGTGGCCACCAACGC-3，； SEQ ID N0.2 為5， -TCGCAGCTGCCCCGGCCGGAGT-3，。
[0007]優(yōu)選的技術(shù)方·案，步驟(1)中，所述組織為鰓。
[0008]上述技術(shù)方案中，步驟(1)中，提取待判斷花鱸組織的總RNA的具體步驟為:將組織放入研缽中，加入液氮，待液氮揮發(fā)后把組織研磨成粉末；把組織粉末放入離心管，加入Trizol試劑裂解5~10分鐘，然后加入氯仿室溫靜置15~20分鐘，在離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15~20分鐘，取上清，加入異丙醇靜置10~20分鐘；然后以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10~15分鐘，倒去上清，加75%酒精洗滌沉淀，離心后倒掉上清，剩余物即為待判斷花鱸組織的總RNA。[0009]上述技術(shù)方案中，步驟(3)中，正向引物、反向引物、cDNA第一條鏈、PCR buffer、dNTP、Taq酶以及滅菌的去離子水的體積比為1: 1: 1: 2.5: 2: 0.1: 17.4。
[0010]上述技術(shù)方案中，步驟(3)中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:951:預(yù)變性51^11，941:變性30s，退火溫度68°C，退火時(shí)間30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C lOmin。
[0011]上述技術(shù)方案中，步驟(4)中利用凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)的瓊脂糖凝膠濃度為0.1%。
[0012]本發(fā)明中，步驟(2)所合成的cDNA第一條鏈置于_20°C保存或立即用作下一步的PCR擴(kuò)增的模板；步驟(3)的正向引物與反向引物以催乳素受體基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的體積沒有特別限定，可以為總共25μ 1的PCR反應(yīng)體系，也可以為總共50 μ 1的PCR反應(yīng)體系。催乳素受體基因(prolactin receptor, PRLR)參與魚類適應(yīng)鹽度變化的適應(yīng)調(diào)節(jié)，海水和淡水養(yǎng)殖魚類不同組織的PRLR基因的表達(dá)水平存在差異，可用來檢測花鱸的養(yǎng)殖鹽度差異。
[0013]由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有相比有如下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明首次公開了一種判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，通過檢測花鱸催乳素受體基因在花鱸鰓或腎臟組織的表達(dá)有無，可有效鑒別花鱸是淡水養(yǎng)殖或是海水養(yǎng)殖的產(chǎn)品；該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可應(yīng)用在水產(chǎn)品市場的監(jiān)管領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為實(shí)施例中海水養(yǎng)殖花鱸和淡水養(yǎng)殖花鱸各組織催乳素受體(PRLR)基因與β -actin基因的表達(dá)電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例與附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。
[0016]實(shí)施例1
(1)總RNA提取:把海水養(yǎng)殖花鱸的鰓組織50mg分別放入研缽中，加入液氮，待液氮揮發(fā)后把組織研磨成粉末。把組織粉末放入1.5ml離心管，加入Trizol試劑(購自Invitrogen公司)裂解5-10分鐘，然后加入氯仿室溫靜置15分鐘,然后在尚心機(jī)中尚心15分鐘(12000轉(zhuǎn)/分鐘)，取500ul的上清，加入異丙醇靜置lOmin，然后離心10min( 12000轉(zhuǎn)/分鐘)，倒去上清，加75%酒精洗滌沉淀，離心后倒掉上清得到海水養(yǎng)殖花鱸的鰓組織的總RNA，加入40 μ 1 DEPC水溶解備用；
(2)cDNA第一條鏈的合成:利用購自Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行。取1 μ 1體積以上抽提的總RNA，與2 μ 1 Τ(18)引物混勻，70度5分鐘，立即冰浴5分鐘，加5 μ 1緩沖液，5 μ 1 dNTP, 1 μ 1RNA酶抑制劑，1.5ul M-MLV RT逆轉(zhuǎn)錄酶，再用DEPC水補(bǔ)足為25 μ 1發(fā)應(yīng)總體積，置于37°C溫浴1小時(shí)后再94度5分鐘，所合成的cDNA第一條鏈立即用作下一步的PCR擴(kuò)增的模板；
(3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增催乳素受體基因:擴(kuò)增反應(yīng)在總共25μ 1的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括:1μ 1以上合成的cDNA第一條鏈，2.5μ 1 PCR buffer (購自Promega公司)，2 μ 1dNTP (購自 Promega 公司)，1 μ 1 正向引物 SEQ ID N0.1，1 μ 1 反向引物 SEQ ID N0.2，
0.1 μ 1 Taq酶(購自Promega公司)，其余的為滅菌的去離子水。擴(kuò)增發(fā)應(yīng)條件變性5min，94°C變性30s，退火溫度68 °C，退火時(shí)間30s，72 °C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄；其中，SEQ ID N0.1 為 5’ - CAACATCACCGTGGTGGCCACCAACGC-3，； SEQ ID N0.2 為5， - TCGCAGCTGCCCCGGCCGGAGT-3，；
(4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增β -actin基因:擴(kuò)增反應(yīng)在總共25 μ 1的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括:1 μ 1 以上合成的 cDNA 第一條鏈，2.5 μ 1 PCR buffer (購自 Promega 公司)，2 μ 1 dNTP(購自 Promega 公司)，1μ 1正向引物 SEQ ID N0.3，1 μ 1 反向引物 SEQ ID N0.4,0.1μ 1 Taq酶(購自Promega公司),其余的為滅菌的去離子水。擴(kuò)增發(fā)應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min,94°C變性30s，退火溫度54°C，退火時(shí)間30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄；
其中，所述的 SEQ ID N0.3 的序列為 5，-TGTGCAAAGCCGGATTCG-3’ ； SEQ ID N0.4 的序列為 5’ - CCTCTCTTGCTCTGGGCTTCA-3’。
[0017]實(shí)施例2
具體步驟同實(shí)施例1，不同之處為所采用的組織為海水養(yǎng)殖花鱸的腎臟。
[0018]實(shí)施例3
具體步驟同實(shí)施例1，不同之處為所采用的組織為淡水養(yǎng)殖花鱸的鰓。
[0019]實(shí)施例4
具體步驟同實(shí)施例1，不同之處為所采用的組織為淡水養(yǎng)殖花鱸的腎臟。
[0020]對(duì)比例
具體步驟同實(shí)施例1，不同之處為所采用的組織分別為:海水養(yǎng)殖花鱸的皮、海水養(yǎng)殖花鱸的脾臟、海水養(yǎng)殖花鱸的肝臟、海水養(yǎng)殖花鱸的心臟、海水養(yǎng)殖花鱸的肌肉、淡水養(yǎng)殖花鱸的皮、淡水養(yǎng)殖花鱸的脾臟、淡水養(yǎng)殖花鱸的肝臟、淡水養(yǎng)殖花鱸的心臟、淡水養(yǎng)殖花鱸的肌肉。
[0021]附圖1為上述海水養(yǎng)殖花鱸和淡水養(yǎng)殖花鱸各組織催乳素受體(PRLR)基因和β-actin基因的表達(dá)電泳圖；從圖1中可明顯看出β-actin基因各個(gè)組織均有較為穩(wěn)定的表達(dá)，表明擴(kuò)增起始總RNA的濃度是相近的，催乳素受體(PRLR)基因只有在海水養(yǎng)殖花鱸的鰓和腎臟組織中有表達(dá)，而在淡水養(yǎng)殖花鱸的包括鰓和腎臟在內(nèi)的各組織都沒有表達(dá)，因此，檢測花鱸鰓或腎臟組織是否有催乳素受體(PRLR)基因表達(dá)條帶，就可有效鑒別花鱸是經(jīng)過海水養(yǎng)殖還是淡水養(yǎng)殖。
[0022]實(shí)施例5
除了步驟(3)，其余步驟同實(shí)施例1，步驟(3)為:擴(kuò)增反應(yīng)在總共25 μ 1的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括:1 U 1以上合成的cDNA第一條鏈,2.5 μ 1 PCR buffer (購自Promega公司)，2μ1 dNTP (購自 Promega 公司)，1μ 1 正向引物 SEQ ID Ν0.1，1 μ 1 反向引物 SEQ IDN0.2,0.1μ 1 Taq酶(購自Promega公司)，其余的為滅菌的去離子水。擴(kuò)增發(fā)應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，退火溫度68 °C，退火時(shí)間30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72°C lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄(Bio-Rad公司)。
[0023]實(shí)施例6
除了步驟(3)，其余步驟同實(shí)施例1，步驟(3)為:擴(kuò)增反應(yīng)在總共50 μ 1的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括:1 U 1以上合成的cDNA第一條鏈,5 μ 1 PCR buffer (購自Promega公司)，4μ1 dNTP (購自 Promega 公司)，2 μ 1 正向引物 SEQ ID N0.1，2 μ 1 反向引物 SEQ IDN0.2,0.25 μ 1 Taq酶(購自Promega公司)，其余的為滅菌的去離子水。擴(kuò)增發(fā)應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，退火溫度68 °C，退火時(shí)間30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄(Bio-Rad公司)。
[0024]實(shí)施例7
(1)組織解剖:取待判斷養(yǎng)殖花鱸50mg鰓組織；
(2)總RNA提取:把50mg組織放入研缽中，加入液氮，待液氮揮發(fā)后把組織研磨成粉末。把組織粉末放入1.5ml離心管，加入Trizol試劑(購自Invitrogen公司)裂解5-10分鐘，然后加入氯仿室溫靜置15分鐘，然后在離心機(jī)中離心15分鐘(12000轉(zhuǎn)/分鐘)，取500ul的上清，加入異丙醇靜置lOmin，然后離心lOmin (12000轉(zhuǎn)/分鐘)，倒去上清，加75%酒精洗滌沉淀，離心后倒掉上清得到待判斷養(yǎng)殖花鱸的鰓組織的總RNA，加入40 μ 1 DEPC水溶解備用；
(3)cDNA第一條鏈的合成:利用購自Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行。取1 μ 1體積以上抽提的總RNA，與2 μ 1 Τ(18)引物混勻，70度5分鐘，立即冰浴5分鐘，加5 μ 1緩沖液，5 μ 1 dNTP, 1 μ 1RNA酶抑制劑，1.5ul M-MLV RT逆轉(zhuǎn)錄酶，再用DEPC水補(bǔ)足為25 μ 1發(fā)應(yīng)總體積，置于37°C溫浴1小時(shí)后再94度5分鐘，所合成的cDNA第一條鏈立即用作下一步的PCR擴(kuò)增的模板；
(4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增催乳素受體基因:擴(kuò)增反應(yīng)在總共25μ 1的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括:1 μ 1 以上合成的 cDNA 第一條鏈，2.5 μ 1 PCR buffer (購自 Promega 公司)，2 μ 1 dNTP(購自 Promega 公司)，1μ 1正向引物 SEQ ID N0.1，1μ 1反向引物 SEQ ID N0.2,0.1μ 1 Taq酶(購自Promega公司),其余的為滅菌的去離子水。擴(kuò)增發(fā)應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min,94°C變性30s，退火溫度68°C，退火時(shí)間30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分·離后，用Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄；凝膠照片上有催乳素受體基因表達(dá)條帶的，為海水養(yǎng)殖的花鱸，否則為淡水養(yǎng)殖的花鱸。
【權(quán)利要求】
1.一種判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)提取待判斷花鱸組織的總RNA，所述組織為鰓或腎臟組織；(2)根據(jù)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒的操作說明，以上述總RNA為反應(yīng)物合成cDNA第一條鏈；(3)分別以引物SEQID N0.1和SEQ ID N0.2為正向引物和反向引物，以上述cDNA第一條鏈為模板，在PCR buffer、dNTP、Taq酶以及滅菌的去離子水存在下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)利用凝膠電泳檢測上述擴(kuò)增產(chǎn)物，如果電泳圖上有催乳素受體基因表達(dá)條帶，則待判斷花鱸的養(yǎng)殖水體為海水，如果電泳圖上沒有催乳素受體基因表達(dá)條帶，則待判斷花鱸的養(yǎng)殖水體為淡水；即完成花鱸養(yǎng)殖水體的判斷；其中，SEQ ID N0.1 為 5，- CAACATCACCGTGGTGGCCACCAACGC-3，； SEQ ID N0.2 為 5，-TCGCAGCTGCCCCGGCCGGAGT-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述組織為觸或腎臟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，其特征在于，步驟(1)中，提取待判斷花鱸組織的總RNA的具體步驟為:將組織放入研缽中，加入液氮，待液氮揮發(fā)后把組織研磨成粉末；把組織粉末放入離心管，加入Trizol試劑裂解5~10分鐘，然后加入氯仿室溫靜置15~20分鐘，在離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15~20分鐘，取上清，加入異丙醇靜置10~20分鐘；然后以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10~15分鐘，倒去上清，加75%酒精洗滌沉淀，離心后倒掉上清，剩余物即為待判斷花鱸組織的總RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，其特征在于，步驟(3)中，正向引物、反向引物、cDNA第一條鏈、P`CR buffer、dNTP、Taq酶以及滅菌的去離子水的體積比為1: 1: 1: 2.5: 2: 0.1: 17.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，退火溫度68°C，退火時(shí)間30s，72°C延伸30s, 30個(gè)循環(huán)，最后72。。lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述判斷花鱸養(yǎng)殖水體的方法，其特征在于，步驟(4)中，利用凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)的瓊脂糖凝膠濃度為0.1%。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667518SQ201410008057
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】唐雪生, 王國清, 鮑寶龍, 張鋮, 陳文君, 劉小玉 申請(qǐng)人:蘇州市陽澄湖國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)發(fā)展有限公司