一種dc細(xì)胞的快速制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞制備領(lǐng)域，具體地說是一種DC細(xì)胞的快速制備方法，本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，將制備時(shí)間由現(xiàn)有技術(shù)的7-9天縮短至3天；將DC細(xì)胞的活力由現(xiàn)有技術(shù)的68-75%提高至88-95%，純度由現(xiàn)有技術(shù)的60-65%提高至80-90%；采用本發(fā)明方法制備的DC細(xì)胞具有完全成熟表型，表達(dá)趨化因子CCR7，分泌高濃度IL-12細(xì)胞因子并有效促進(jìn)T細(xì)胞增殖。
【專利說明】一種DC細(xì)胞的快速制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞制備領(lǐng)域，具體地說是一種DC細(xì)胞的快速制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DC細(xì)胞，即為樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell)，是機(jī)體免疫系統(tǒng)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，通過攝取、加工處理和提呈抗原，啟動(dòng)抗原特異性免疫應(yīng)答，在機(jī)體免疫系統(tǒng)抵御病毒感染、腫瘤侵襲中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，國內(nèi)外多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)利用抗原特異性DC疫苗治療腫瘤等疾病均已取得令人鼓舞的進(jìn)展，部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。
[0003]但是，DC細(xì)胞數(shù)量稀少,僅占人外周血單個(gè)核細(xì)胞的1%,而DC疫苗需要大量成熟DC細(xì)胞，目前只允許通過分離患者自體單核細(xì)胞，再進(jìn)一步體外誘導(dǎo)擴(kuò)增來獲得。因此，高效大量獲得成熟并具有功能的DC細(xì)胞成為抗原特異性DC疫苗治療疾病成功的決定性環(huán)節(jié)。
[0004]常規(guī)的DC細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增方案，是利用細(xì)胞因子=GM-CSF和IL_4，經(jīng)過5~7天的誘導(dǎo)分化，緊接著再經(jīng)過2天的誘導(dǎo)成熟，從而獲得成熟并具有功能的DC細(xì)胞，總培養(yǎng)時(shí)長在7、天。常規(guī)的DC細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增方案存在操作耗時(shí)長、細(xì)胞純度低、細(xì)胞功能缺失等問題，導(dǎo)致DC疫苗產(chǎn)業(yè)化、批量化生產(chǎn)進(jìn)程緩慢，進(jìn)而難以推廣應(yīng)用。所以，尋找成本低、時(shí)程短的功能性DC細(xì) 胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增方式顯得尤為迫切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種誘導(dǎo)時(shí)間短、細(xì)胞純度高、功能強(qiáng)的DC細(xì)胞的快速制備方法。
[0006]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明是一種DC細(xì)胞的快速制備方法，其特征在于:依次完成如下步驟:步驟一:在3毫升淋巴細(xì)胞分離液中以每分鐘I毫升的速度加入5毫升全血，保持淋巴細(xì)胞分離液液面不被沖破，在室溫狀態(tài)下，采用300g離心力，離心20分鐘，離心過程中提速及減速均不帶剎車；步驟二:用滴管吸取云霧層，加入0.9%的生理鹽水30毫升洗滌一次，在室溫狀態(tài)下，采用300g離心力，離心5分鐘，棄上清；步驟三:用30毫升預(yù)冷的分選緩沖液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，在4攝氏度狀態(tài)下，采用300g離心力，離心10分鐘，棄上清；步驟四:每IxlO7個(gè)細(xì)胞加入30微升預(yù)冷的分選緩沖液、10微升Fe受體阻斷試劑和10微升生物素抗體混合液，進(jìn)行混勻，混勻后，置于溫度為4攝氏度的冰箱內(nèi)，10分鐘后取出；步驟五:每I X IO7個(gè)細(xì)胞加入30微升預(yù)冷的分選緩沖液和20微升抗生物素微磁珠，進(jìn)行混勻，混勻后，置于溫度為4攝氏度的冰箱內(nèi)，15分鐘后取出；步驟六:加入1-2微升預(yù)冷的分選緩沖液，在4攝氏度狀態(tài)下，采用300g離心力，離心10分鐘，棄上清，加入500微升預(yù)冷的分選緩沖液重懸細(xì)胞；步驟七:MS柱置于磁架上，加入500微升預(yù)冷的分選緩沖液，待液體完全流干后，加入500微升細(xì)胞懸液，收集流出的細(xì)胞，該流出的細(xì)胞即為CD14+的單核細(xì)胞；步驟八:待液體完全流干后，加入500微升預(yù)冷的分選緩沖液洗柱，重復(fù)兩次；步驟九:計(jì)數(shù)收集的細(xì)胞數(shù)量，在4攝氏度狀態(tài)下，采用300g離心力，離心10分鐘，棄上清；步驟十:用DC細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至0.5-0.6xl06個(gè)/毫升，將細(xì)胞懸液鋪入6孔板中，每孔3毫升；步驟十一:將6孔板置于溫度為37攝氏度，二氧化碳濃度為5%的孵箱內(nèi)，培養(yǎng)48小時(shí)后，補(bǔ)充加入誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟的混合因子；步驟十二:繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力、細(xì)胞表型及功能。
[0007]所述的步驟二中，所述的云霧層為單個(gè)核細(xì)胞層。
[0008]所述的步驟十中，所述的DC細(xì)胞培養(yǎng)基為GT551無血清培養(yǎng)基加入1000 U/mL粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和500 U/mL白細(xì)胞介素4。
[0009]所述的步驟十一中，所述的誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟的混合因子為1000 U/mL腫瘤壞死因子、10000 U/mL白細(xì)胞介素1、1000 U/mL干擾素r、I微摩爾/升前列腺素E2、500 ng/mLCD40LU0 ng/mL 脂多糖、2.5 微克 / 毫升 R848。
[0010]本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，將制備時(shí)間由現(xiàn)有技術(shù)的7-9天縮短至3天；將DC細(xì)胞的活力由現(xiàn)有技術(shù)的68-75%提高至88-95%，純度由現(xiàn)有技術(shù)的60-65%提高至80-90% ;采用本發(fā)明方法制備的DC細(xì)胞具有完全成熟表型，表達(dá)趨化因子CCR7，分泌高濃度IL-12細(xì)胞因子并有效促進(jìn)T細(xì)胞增殖。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)制備的DC樹突狀細(xì)胞的MHC II類分子及共刺激分子表達(dá)水平對(duì)比圖。
[0012]圖2為本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)制備的DC樹突狀細(xì)胞的趨化因子受體CCR7表達(dá)水平對(duì)比圖。
[0013]圖3為本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)制備的DC樹突狀細(xì)胞的分泌白細(xì)胞介素12水平對(duì)比圖。
[0014]圖4為本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)制備的DC樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖能力的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]現(xiàn)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
[0016]本發(fā)明是一種DC細(xì)胞的快速制備方法，其特征在于:依次完成如下步驟:步驟一:在3毫升淋巴細(xì)胞分離液中以每分鐘I毫升的速度加入5毫升全血，保持淋巴細(xì)胞分離液液面不被沖破，在室溫狀態(tài)下，采用300g離心力，離心20分鐘，離心過程中提速及減速均不帶剎車。
[0017]步驟二:用滴管緩慢吸取云霧層，吸取云霧層時(shí)，不要帶入很多分離液，云霧層為單個(gè)核細(xì)胞層，加入0.9%的生理鹽水30毫升洗滌一次，在室溫狀態(tài)下，采用300g離心力，離心5分鐘，棄上清。
[0018]步驟三:用30毫升預(yù)冷的分選緩沖液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，在4攝氏度狀態(tài)下，采用300g離心力，離心10分鐘，棄上清。
[0019]步驟四:每I X IO7個(gè)細(xì)胞加入30微升預(yù)冷的分選緩沖液、10微升Fe受體阻斷試劑和10微升生物素抗體混合液，進(jìn)行混勻，混勻后，置于溫度為4攝氏度的冰箱內(nèi)，10分鐘后取出。[0020] 步驟五:每I X IO7個(gè)細(xì)胞加入30微升預(yù)冷的分選緩沖液和20微升抗生物素微磁珠，進(jìn)行混勻，混勻后，置于溫度為4攝氏度的冰箱內(nèi)，15分鐘后取出。
[0021]步驟六:加入1-2微升預(yù)冷的分選緩沖液，在4攝氏度狀態(tài)下，采用300g離心力，離心10分鐘，棄上清，加入500微升預(yù)冷的分選緩沖液重懸細(xì)胞。
[0022]步驟七:MS柱置于磁架上，加入500微升預(yù)冷的分選緩沖液，待液體完全流干后，加入500微升細(xì)胞懸液，收集流出的細(xì)胞，該流出的細(xì)胞即為CD14+的單核細(xì)胞。
[0023]步驟八:待液體完全流干后，加入500微升預(yù)冷的分選緩沖液洗柱，重復(fù)兩次。
[0024]步驟九:計(jì)數(shù)收集的細(xì)胞數(shù)量，在4攝氏度狀態(tài)下，采用300g離心力，離心10分鐘，棄上清。
[0025]步驟十:用DC細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至0.5-0.6xl06個(gè)/毫升，將細(xì)胞懸液鋪入6孔板中，每孔3毫升，DC細(xì)胞培養(yǎng)基為寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的GT551無血清培養(yǎng)基加入1000 U/mL派普泰克公司生產(chǎn)的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和500 U/mL派普泰克公司生產(chǎn)的白細(xì)胞介素4。
[0026]步驟^^一:將6孔板置于溫度為37攝氏度，二氧化碳濃度為5%的孵箱內(nèi)，培養(yǎng)48小時(shí)后，補(bǔ)充加入誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟的混合因子。所述的誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟的混合因子為1000U/mL派普泰克公司生產(chǎn)的腫瘤壞死因子、10000 U/mL派普泰克公司生產(chǎn)的白細(xì)胞介素1、1000 U/mL派普泰克公司生產(chǎn)的干擾素r、l微摩爾/升西格瑪奧德里奇公司生產(chǎn)的前列腺素 E2、500 ng/mL CD40LU0 ng/mL 脂多糖、2.5 微克 / 毫升 R848，R848 為 TLR7/8 的一種配體。
[0027]步驟十二:繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力、細(xì)胞表型及功能。
[0028]本發(fā)明中，淋巴細(xì)胞分離液為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，在第四、第五步驟用到單核細(xì)胞分選試劑盒為德國美天旎公司生產(chǎn)，分選緩沖液為德國美天旎公司生產(chǎn)。
[0029]常規(guī)DC細(xì)胞制備需要7-9天，本發(fā)明制備DC細(xì)胞僅需3天，實(shí)驗(yàn)時(shí)間大大縮短。
[0030]常規(guī)方法制備的DC細(xì)胞通?；盍?8-75%和純度為60_65%，活力和純度都較低，本發(fā)明制備的DC細(xì)胞活力為88-95%和純度為80-90%，活力和純度都明顯提高。
[0031]參見圖1，其中左側(cè)一列為同型對(duì)照?qǐng)D，中間一列為常規(guī)DC細(xì)胞培養(yǎng)法的MHC II類分子及共刺激分子表達(dá)水平圖，右側(cè)一列為本發(fā)明的DC細(xì)胞培養(yǎng)法的MHC II類分子及共刺激分子表達(dá)水平圖，與常規(guī)DC細(xì)胞制備方式相比，本發(fā)明制備的DC細(xì)胞具有完全成熟表型，
參見圖2，其中左側(cè)為同型對(duì)照?qǐng)D，中間為常規(guī)DC細(xì)胞培養(yǎng)法的趨化因子受體CCR7表達(dá)水平圖，右側(cè)為本發(fā)明的DC細(xì)胞培養(yǎng)法的趨化因子受體CCR7表達(dá)水平圖，與常規(guī)DC細(xì)胞制備方式相比，本發(fā)明制備的DC細(xì)胞表達(dá)趨化因子CCR7。
[0032]參見圖3，分泌白細(xì)胞介素12水平對(duì)比圖，其中左側(cè)為常規(guī)DC細(xì)胞培養(yǎng)法的分泌白細(xì)胞介素12水平，右側(cè)為本發(fā)明的DC細(xì)胞培養(yǎng)法的分泌白細(xì)胞介素12水平，與常規(guī)DC細(xì)胞制備方式相比，本發(fā)明制備的DC細(xì)胞分泌高濃度白細(xì)胞介素12細(xì)胞因子。
[0033]參見圖4，其中第一行為采用常規(guī)DC細(xì)胞培養(yǎng)法制備第四天的DC樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖能力圖，第二行為本發(fā)明的DC細(xì)胞培養(yǎng)法制備第四天的DC樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖能力圖，第三行為采用常規(guī)DC細(xì)胞培養(yǎng)法制備第六天的DC樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖能力圖，第四行為本發(fā)明的DC細(xì)胞培養(yǎng)法制備第六天的DC樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖能力圖，與常規(guī)DC細(xì)胞制備方式相比，本發(fā)明制備的DC細(xì)胞有效誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖 。
【權(quán)利要求】
1.一種DC細(xì)胞的快速制備方法，其特征在于:依次完成如下步驟:步驟一:在3毫升淋巴細(xì)胞分離液中以每分鐘I毫升的速度加入5毫升全血，保持淋巴細(xì)胞分離液液面不被沖破，在室溫狀態(tài)下，采用300g離心力，離心20分鐘，離心過程中提速及減速均不帶剎車；步驟二:用滴管吸取云霧層，加入0.9%的生理鹽水30毫升洗滌一次，在室溫狀態(tài)下，采用.300g離心力，離心5分鐘，棄上清；步驟三:用30毫升預(yù)冷的分選緩沖液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，在4攝氏度狀態(tài)下，采用300g離心力，離心10分鐘，棄上清；步驟四:每I X IO7個(gè)細(xì)胞加入30微升預(yù)冷的分選緩沖液、10微升Fe受體阻斷試劑和10微升生物素抗體混合液，進(jìn)行混勻，混勻后，置于溫度為4攝氏度的冰箱內(nèi)，10分鐘后取出；步驟五:每IxlO7個(gè)細(xì)胞加入30微升預(yù)冷的分選緩沖液和20微升抗生物素微磁珠，進(jìn)行混勻，混勻后，置于溫度為4攝氏度的冰箱內(nèi)，15分鐘后取出；步驟六:加入1-2微升預(yù)冷的分選緩沖液，在4攝氏度狀態(tài)下，采用300g離心力，離心10分鐘，棄上清，加入500微升預(yù)冷的分選緩沖液重懸細(xì)胞；步驟七:MS柱置于磁架上，加入500微升預(yù)冷的分選緩沖液，待液體完全流干后，加入500微升細(xì)胞懸液，收集流出的細(xì)胞，該流出的細(xì)胞即為CD14+的單核細(xì)胞；步驟八:待液體完全流干后，加入500微升預(yù)冷的分選緩沖液洗柱，重復(fù)兩次；步驟九:計(jì)數(shù)收集的細(xì)胞數(shù)量，在4攝氏度狀態(tài)下，采用300g離心力，離心10分鐘，棄上清；步驟十:用DC細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至0.5-0.6xl06個(gè)/毫升，將細(xì)胞懸液鋪入6孔板中，每孔3毫升；步驟.1:將6孔板置于溫度為37攝氏度,二氧化碳濃度為5%的孵箱內(nèi)，培養(yǎng)48小時(shí)后,補(bǔ)充加入誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟的混合因子；步驟十二:繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力、細(xì)胞表型及功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DC細(xì)胞的快速制備方法，其特征在于:所述的步驟二中，所述的云霧層為單個(gè)核細(xì)胞層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DC細(xì)胞的快速制備方法，其特征在于:所述的步驟十中，所述的DC細(xì)胞培養(yǎng)基為GT551無血清培養(yǎng)基加入1000 U/mL粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和500 U/mL白細(xì)胞介素4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DC細(xì)胞的快速制備方法，其特征在于:所述的步驟十一中，所述的誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟的混合因子為1000 U/mL腫瘤壞死因子、10000 U/mL白細(xì)胞介* UlOOO U/mL干擾素r、l微摩爾/升前列腺素E2、500 ng/mL CD40LU0 ng/mL脂多糖、.2.5微克/毫升R848。
【文檔編號(hào)】C12N5/0784GK103589685SQ201310610764
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】?jī)?chǔ)以微, 駱菲菲, 鄭秀娟, 張丹 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)