專利名稱：布萊凱特黑牛pdss1基因單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性及其檢測，特別涉及一種布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法。
背景技術(shù)：
布萊凱特黑牛是一種優(yōu)質(zhì)肉牛新品種，其牛肉含有豐富的蛋白質(zhì)，氨基酸組成比豬肉更接近人體需要，能提高機(jī)體抗病能力，同時(shí)CoQltl含量也相對(duì)較高，具有營養(yǎng)心肌、增強(qiáng)抵抗力的功能，是我國肉牛品種中不可多得的優(yōu)質(zhì)肉牛新種質(zhì)，因此如何利用分子生物學(xué)技術(shù)更加快速高效的培育肉質(zhì)、營養(yǎng)更加優(yōu)良的肉牛品種是當(dāng)務(wù)之急。CoQ是生物有氧呼吸電子傳遞鏈中的必要成分，它不僅對(duì)于能量產(chǎn)生至關(guān)重要，還有其它功能，如活性氧自由基的清除、基因表達(dá)的調(diào)控及通過調(diào)控NAD+/NADH比率來控制細(xì)胞的氧化還原態(tài)等。而CoQltl除具備以上功能外，還是人體唯一可利用的CoQ類。因此人們對(duì)CoQltl的研究也越來越多，且主要集中在微生物轉(zhuǎn)基因工程、發(fā)酵工程及人類臨床醫(yī)學(xué)方面。研究發(fā)現(xiàn)像粟酒裂殖酵母(S.pombe)的聚十異戍二烯焦磷酸合成酶(Decaprenyldiphosphate synthase, DPPS) 一樣，小鼠mSPSl和mDLPl只有在形成異源四聚體后,才能催化CoQltl側(cè)鏈的合成，這在人類hDPSl和hDLPl上也同樣被證實(shí)，且具有專一性，是重要的限速酶。還有研究表明，人體中PDSSl或PDSS2基因的突變，都會(huì)引起少見的嬰幼兒臟器疾病。對(duì)于rossi基因，在其催化區(qū)的一個(gè)隱性點(diǎn)突變，都會(huì)引起早發(fā)型腦神經(jīng)病、失聰和網(wǎng)狀青斑；對(duì)于TOSS2基因，其一個(gè)復(fù)合雜合子突變也會(huì)引發(fā)腎病、肌病和一種稱作Leigh綜合征的激進(jìn)式神經(jīng)退行 性疾病，除了 CoQltl的初級(jí)缺乏癥，食用CoQltl補(bǔ)充劑對(duì)嚙齒類動(dòng)物的神經(jīng)退行性疾病如肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、亨廷頓氏病和帕金森氏病等有顯著療效。還有研究報(bào)導(dǎo)，通過對(duì)人類PDSSl基因12個(gè)外顯子的直接測序，發(fā)現(xiàn)在第977位(外顯子10內(nèi))處純合子T — G的替換導(dǎo)致蛋白質(zhì)中高度保守的天冬氨酸變?yōu)楣劝彼?D308E)。而人類roSSl基因和C0Q2基因的突變，都會(huì)引起氧化磷酸化不足。目前，本實(shí)驗(yàn)室正在利用分子遺傳標(biāo)記輔助育種技術(shù)對(duì)布萊凱黑特黑牛進(jìn)行改良。前期董懿為等已利用10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了魯西黃牛、布萊凱特肉牛、渤海黑牛和日本和牛4個(gè)肉牛群體，結(jié)果表明本試驗(yàn)利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析的4個(gè)肉牛群體內(nèi)和群體間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系是有效的，可為正確評(píng)估布萊凱特肉牛新品種遺傳多樣性的資源價(jià)值、制定合理可行的保種方案提供分子水平的遺傳學(xué)依據(jù)，這同時(shí)也為今后的分子遺傳標(biāo)記育種實(shí)驗(yàn)提供了理論指導(dǎo)。對(duì)于CoQltl的研究在其他大型哺乳動(dòng)物方面還甚少，本研究首次以布萊凱特黑牛為試驗(yàn)對(duì)象，研究CoQltl合成過程中關(guān)鍵酶基因rossi，目的是對(duì)布萊凱特黑牛PDSSl基因的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，并進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，為進(jìn)一步研究該基因與布萊凱特黑牛胴體內(nèi)CoQltl含量、肉質(zhì)性狀的相關(guān)性及基因定位奠定理論基礎(chǔ)，從而促進(jìn)新品種的培育。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化。單核苷酸多態(tài)性具有數(shù)量多、分布廣和穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)，是一種進(jìn)行分子遺傳育種的優(yōu)良手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，尋找到與布萊凱特黑牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的SNP，為其分子標(biāo)記育種奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性序列，是在布萊凱特黑牛PDSSl基因第4外顯子第122位為A或G的堿基多態(tài)性序列。布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法包括以下步驟:以包含PDSSl基因的待測布萊凱特黑牛全基因組DNA序列為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增布萊凱特黑牛PDSSl基因第4外顯子；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測并對(duì)基因分型；對(duì)基因分型的純合子測序得到布萊凱特黑牛rossi基因單核苷酸多態(tài)性序列。所述的引物對(duì)P為:上游引物:5’-CGTTTTGTGTAGTTATGCCA-3’下游引物:5’-TGCTGAAGTTGCTCTCCC-3’所述PCR 反應(yīng)體系為:10 X PCR Buffer2 u L, 25mM 的 MgCl22 u L, 2.5mM 的 dNTPMixture2 u L, IOuM 的上、下游引物各 0.4u L, 5U/ y L 的 Taq DNA 聚合酶 0.2 u L, 50ng/ u L的基因組 DNAl u L, ddH2012 u L,總計(jì) 20 u L。

所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，59°C退火30s，72°C延伸lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0所述SSCP檢測應(yīng)用5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。所述的布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性序列及檢測方法還可以包括對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率和遺傳多樣性指標(biāo)的檢測。所述的遺傳多樣性指標(biāo)為雜合度He、有效等位基因數(shù)Ne和多態(tài)信息含量PIC。所述的布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性序列及檢測方法還可以包括PDSSl基因第4外顯子變異前后對(duì)聚十異戊二烯焦磷酸合成酶亞基蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。所述蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析采用Garnier-Roboson分析法。本發(fā)明的有益效果是:首次在布萊凱特黑牛中pDSS1基因第4外顯子第122bp處發(fā)現(xiàn)A — G的突變，且弓I起相應(yīng)氨基酸的改變N — S (即蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變)；從而導(dǎo)致PDSSl蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中a -螺旋的數(shù)目由20個(gè)減至19個(gè)，& -折疊的數(shù)目由24個(gè)減至23個(gè)；PDSS1作為形成聚十異戊二烯焦磷酸合成酶(DPPS)的亞基，是由一條具有特定三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的，而其一、二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，勢必會(huì)導(dǎo)致三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變一般會(huì)引起其功能的改變。由此可見，利用分子遺傳標(biāo)記輔助布萊凱特黑牛的品種是一種比較科學(xué)而有效的方式。此外，PDSSl基因是CoQltl合成過程中關(guān)鍵的限速酶基因之一，起著重要作用。布萊凱特黑牛體內(nèi)CoQltl含量的高低或許會(huì)影響到其胴體的肉質(zhì)性狀(如色澤、風(fēng)味、系水力、多汁性、嫩度等)。因此，將rossi基因作為影響布萊凱特黑牛體內(nèi)CoQltl合成及胴體肉質(zhì)性狀的候選基因是有理論依據(jù)的，同時(shí)這也為今后布萊凱特黑牛分子標(biāo)記輔助育種奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。布萊凱特黑牛rossi基因第4外顯子中單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的雜合度為0.448，有效等位基因數(shù)為1.812，多態(tài)信息含量(PIC)為0.348，這表明第4外顯子內(nèi)第122bp處A — G的突變?yōu)橹卸榷鄳B(tài)，這對(duì)今后布萊凱特黑牛的分子遺傳標(biāo)記輔助選育工作具有重要指導(dǎo)意義。針對(duì)上述布萊凱特黑牛PDSSl基因SNP多態(tài)性，本發(fā)明提供的檢測方法簡單、快速、成本低廉、精確度高。


圖1是布萊凱特黑?；蚪MDNA瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果；圖2是布萊凱特黑牛PDSSl基因各目的片段的擴(kuò)增效果，圖中，M為DL2000DNAMarker ;1 9分別對(duì)應(yīng)Pl P9目的片段；圖3是布萊凱特黑牛PDSSl基因各目的片段的PCR-SSCP檢測結(jié)果；圖4是PDSSl基因目的片段P4的PCR-SSCP檢測結(jié)果；圖5a和圖5b分別是布萊凱特黑牛PDSSl基因第4外顯子擴(kuò)增片段AA、BB基因型測序峰圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā) 明做進(jìn)一步說明。1.基因組DNA提取分別采取96頭成年布萊凱特黑牛耳樣，使用天根生化科技(北京)有限公司的組織基因組DNA提取試劑盒從布萊凱特黑牛耳組織中提取基因組DNA，具體步驟如下:(I)稱取IOmg布萊凱特黑牛耳樣組織放于1.5mL離心管內(nèi)，用消毒后的手術(shù)剪盡量剪碎，取200 u L緩沖液GA加入其中，震蕩，使其徹底懸浮。(2)加入20iiL的蛋白酶K溶液，混勻。放入水浴鍋內(nèi)56°C水浴1.5h，期間顛倒混勻樣品2-3次，至完全消化，然后簡短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠。(3)加入200 u L緩沖液GB，顛倒混勻，70°C水浴鍋內(nèi)放置lOmin，溶液變清亮，簡短
離心除去管蓋內(nèi)水珠。(4)取200 L無水乙醇加入上述溶液，振蕩器上振蕩混勻15sec，簡短離心除去管蓋內(nèi)水珠。(5)將上一步所得溶液和絮狀物全部都加入到一個(gè)吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，于離心機(jī)12000rpm離心30sec，倒掉廢液后將吸附柱再放回收集管中。(6)向吸附柱中加入500 ii L已加了無水乙醇的緩沖液⑶，12000rpm離心30sec，棄廢液后吸附柱放于收集管中。(7)加入700 ii L已加了無水乙醇的漂洗液PW進(jìn)行漂洗，12000rpm離心30sec,棄廢液后吸附柱再放入收集管中。(8)重復(fù)操作步驟7，再漂洗一遍。(9)吸附柱放于收集管中后，12000rpm離心2min，倒掉廢液后，將吸附柱放于室溫10分鐘，徹底晾干材料中殘余的漂洗液，聞一下無乙醇的氣味。(10)將上述吸附柱放入一個(gè)干凈的剪去上蓋的離心管中，懸空向吸附柱吸附膜中間部位滴加100 u L洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min。(11)為增加基因組DNA的得率，將上述得到的溶液再次懸空加入到吸附柱吸附膜上，室溫放置2min, 12000rpm離心2min。(12)將得到的基因組DNA溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管內(nèi)，取2 y L該溶液以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及濃度，剩下的放于_20°C冰箱中保存。部分基因組DNA電泳結(jié)果如圖1所示，可知所提取基因組DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，說明DNA完整性較好，濃度較高，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。2.引物設(shè)計(jì)與合成參照Esembl Genome Browser數(shù)據(jù)庫公布的牛F1DSSl基因全序列，利用PrimerPremier5.0軟件針對(duì)11個(gè)外顯子設(shè)計(jì)了 9對(duì)引物(表1)，并由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行引物的合成。表1布萊凱特黑牛rossi基因各目的片段的擴(kuò)增引物
權(quán)利要求
1.一種布萊凱特黑牛rossi基因單核苷酸多態(tài)性序列，其特征在于，所述序列是布萊凱特黑牛PDSSl基因第4外顯子第122位為A或G的堿基多態(tài)性序列。
2.—種布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 以包含rossi基因的待測布萊凱特黑牛全基因組DNA序列為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增布萊凱特黑牛PDSSl基因第4外顯子；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測并對(duì)基因分型；對(duì)基因分型的純合子測序得到布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的引物對(duì)P為: 上游引物:5’ -CGITITGTGTAGTTATGCCA-3’ 下游引物:5’ -TGCTGAAGITGCTCTCCC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述 PCR 反應(yīng)體系為:10 XPCR Buffer2 u L,25mM 的 MgCl22y L，2.5mM 的 dNTPMixture2 u L, IOuM 的上、下游引物各 0.4u L, 5U/ y L 的 Taq DNA 聚合酶 0.2 u L, 50ng/ u L的基因組 DNAl u L, ddH2012 u L,總計(jì) 20 u L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，59°C退火30s，72°C延伸lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述SSCP檢測應(yīng)用5%非變性 聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性序列及檢測方法還可以包括對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率和遺傳多樣性指標(biāo)的檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的遺傳多樣性指標(biāo)為雜合度He、有效等位基因數(shù)Ne和多態(tài)信息含量PIC。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛PDSSl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的布萊凱特黑牛rossi基因單核苷酸多態(tài)性序列及檢測方法還可以包括PDSSl基因第4外顯子變異前后對(duì)聚十異戊二烯焦磷酸合成酶亞基蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的布萊凱特黑牛rossi基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析采用Garnier-Roboson分析法。
全文摘要
本發(fā)明公開了布萊凱特黑牛PDSS1基因第4外顯子部分序列的多態(tài)位點(diǎn)及其檢測方法，以包含PDSS1基因的待測布萊凱特黑牛全基因組DNA序列為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增布萊凱特黑牛PDSS1基因第4外顯子；對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測并對(duì)基因分型；對(duì)基因分型的純合子測序得到布萊凱特黑牛PDSS1基因單核苷酸多態(tài)性序列。根據(jù)PCR-SSCP及測序結(jié)果分析顯示，PDSS1基因第4外顯子第122位為A或G。PDSS1基因?qū)oQ10合成量和合成速度及肉質(zhì)的影響具有重大意義，因此對(duì)其SNP的檢測及分析可以作為優(yōu)質(zhì)肉牛品種選育的分子標(biāo)記，為布萊凱特黑牛優(yōu)良種質(zhì)的選育奠定了重要的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103243094SQ20131010240
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日
發(fā)明者董雅娟, 楊莉 申請(qǐng)人:董雅娟