專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞核移植的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物中細(xì)胞核移植的方法，并涉及獲得的遺傳修飾的哺乳動(dòng)物或可通過(guò)該方法獲得的遺傳修飾的動(dòng)物。而且，本發(fā)明涉及卵母細(xì)胞、受精卵、胚胎(其中包括胚泡)的玻璃化方法。
背景技術(shù)：
對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾并將其用于核移植的能力提供了生產(chǎn)遺傳修飾的動(dòng)物的工具，所述遺傳修飾的動(dòng)物可用于例如嚴(yán)重人類(lèi)疾病研究和藥物測(cè)試中的疾病模型。傳統(tǒng)的細(xì)胞核移植技術(shù)包括2步顯微操作。第一步包括成熟卵母細(xì)胞的去核，第二步包括供體細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移。然而，已證明顯微操作具有幾處缺點(diǎn)，例如需要昂貴的設(shè)備，需要高水平技術(shù)人員以及耗時(shí)的工作。最近開(kāi)發(fā)出使用體細(xì)胞作為供體細(xì)胞的改進(jìn)的核移植方法——一種被稱(chēng)為手工克隆(HMC)的方法，其包括使用無(wú)透明帶的卵母細(xì)胞。該方法與傳統(tǒng)的核移植相比，簡(jiǎn)化之處在于不再需要顯微操作。該方法已經(jīng)用在牛中(Vajta等2001Cloning3, 89-95; Vajta等2003Biol.Reprod.68, 571-578;Vajta 等 2005Reprod.Fertil.Dev.17, 1-16;Tecirlioglu等，2004)。而且，已有記錄在牛(Booth 等 2001Cloning Stem Cells3, 139-150;Oback 等Cloning Stem Cells5, 3-12)和豬(Booth 等 2001Cloning Stem Cells3, 191-197)中使用一步顯微操作的無(wú)透明帶核移植的應(yīng)用。該方法技術(shù)要求更低、時(shí)間消耗更少的事實(shí)已促使研究者建議將HMC技術(shù)用于其他物種。然而，大量的技術(shù)問(wèn)題使得HMC在豬中的應(yīng)用比初步設(shè)想的要求更高。所面臨的問(wèn)題`之一涉及豬卵母細(xì)胞的低浮力密度，這包括透明帶完整(ZI)以及尤其是無(wú)透明帶(ZF)的豬卵母細(xì)胞。因此，豬卵母細(xì)胞不沉降到平皿的底部。此外，這些卵母細(xì)胞的表面具有粘性，當(dāng)去除透明帶后很難避免它們之間的附著。而且，ZF豬卵母細(xì)胞非常易碎，很難以對(duì)待牛卵母細(xì)胞中描述的方式將其二分。最近，HMC技術(shù)被應(yīng)用在豬核移植中，但效率低，其中使用遺傳修飾的體細(xì)胞-成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞從而產(chǎn)生遺傳修飾的克隆胚泡(Kragh等2004Reproduction, Fertility and Developmentl6, 315-318)。本發(fā)明改進(jìn)了通過(guò)HMC進(jìn)行體細(xì)胞核移植的技術(shù)，從而產(chǎn)生了提高的胚胎重建率，并因此使獲得遺傳修飾動(dòng)物的機(jī)會(huì)顯著升高。通過(guò)核移植方法大規(guī)模產(chǎn)生遺傳修飾動(dòng)物的障礙之一是無(wú)法通過(guò)應(yīng)用在其他物種上的方法深低溫保藏豬卵母細(xì)胞和胚胎。這是因?yàn)樨i卵母細(xì)胞和胚胎的高脂質(zhì)含量。克隆豬胚胎的深低溫保藏可通過(guò)緩解后勤問(wèn)題而顯著改善體細(xì)胞克隆的產(chǎn)量。然而，最近發(fā)表了一種非侵入性方案，其通過(guò)離心但不需要隨后的顯微操作(Esaki等2004BiolReprod.71，432-6)而對(duì)豬胚胎去脂。發(fā)明概述
本發(fā)明一方面涉及細(xì)胞核移植的方法，其包括以下步驟:a)構(gòu)建具有至少一部分經(jīng)修飾的透明帶的至少一個(gè)卵母細(xì)胞，b)將該卵母細(xì)胞分成至少2部分，從而獲得至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，c)構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核，d)將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合，e)得到重建的胚胎。本發(fā)明第二方面涉及細(xì)胞核移植方法，其包括以下步驟:a)構(gòu)建至少一個(gè)卵母細(xì)胞，b)將該卵母細(xì)胞分成至少3部分，從而獲得至少2個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，c)構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核，d)將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合，e)得到重建的胚胎。本發(fā)明第三方面涉及產(chǎn)生遺傳修飾的或轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的方法，其包括以下步驟:a)構(gòu)建具有至少一部分經(jīng)修飾的透明帶的至少一個(gè)卵母細(xì)胞，b)將該卵母細(xì)胞分成至少2部分，從而獲得具有核的卵母細(xì)胞和至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，c)構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核，d)將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合，
e)得到重建的胚胎，f)活化該重建的胚胎以形成胚胎，g)培養(yǎng)所述胚胎，以及h)將所述的培養(yǎng)胚胎轉(zhuǎn)移到寄主哺乳動(dòng)物中，使得該胚胎發(fā)育成遺傳修飾的胎兒。本發(fā)明第四方面涉及生產(chǎn)遺傳改造的或轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的方法，其包括以下步驟:a)構(gòu)建至少一個(gè)卵母細(xì)胞，b)將該卵母細(xì)胞分成至少3部分，從而獲得至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，c)構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核，d)將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合，e)得到重建的胚胎，f)活化該重建的胚胎以形成胚胎，g)培養(yǎng)所述胚胎，以及h)將所述的培養(yǎng)胚胎轉(zhuǎn)移到寄主哺乳動(dòng)物中，使得該胚胎發(fā)育成遺傳修飾的胎兒。 本發(fā)明第五方面涉及深低溫保藏豬胚胎的方法，其包括以下步驟:a)構(gòu)建至少一個(gè)豬卵母細(xì)胞，b)對(duì)該卵母細(xì)胞去脂，c)活化重建的胚胎以形成胚胎，d)培養(yǎng)所述胚胎，e)將該胚胎玻璃化。本發(fā)明第六方面涉及克隆非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的方法，其包括以下步驟:a)構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的方案獲得的胚胎，任選地解凍胚胎，b)將所述的培養(yǎng)胚胎轉(zhuǎn)移到寄主哺乳動(dòng)物中，使得該胚胎發(fā)育成遺傳修飾的胎兒。本發(fā)明第七方面涉及通過(guò)本文所限定的方法可獲得的遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)本文所限定的方法可獲得的遺傳修飾的非人類(lèi)胚胎。本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)本文所限定的方法可獲得的遺傳修飾的非人類(lèi)胚胎，在其組織細(xì)胞內(nèi)具有來(lái)自至少3個(gè)不同母源的線粒體。本發(fā)明最后一方面涉及培養(yǎng)重建的胚胎(胚胎)的方法，其包括以下步驟:a)構(gòu)建具有至少一部分透明帶的至少一個(gè)卵母細(xì)胞，b)將該卵母細(xì)胞分成至少2部分，從而獲得具有核的卵母細(xì)胞和至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，c)構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核，
d)將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合，e)得到重建的胚胎，f)活化該重建的胚胎以形成胚胎，以及e)培養(yǎng)所述胚胎。


圖1.(a)卵母細(xì)胞三分；(b)用于第一次融合的成纖維細(xì)胞一卵母細(xì)胞碎片偶聯(lián)體；(C)以三聯(lián)體重建的胚胎(注意在AC電流下伸長(zhǎng))；(d)三聯(lián)體融合?？潭瘸?50 μ m。圖2.(a)部分透明帶消化后的體外成熟的卵母細(xì)胞，(b)離心后去脂的卵母細(xì)胞，
(c)去脂的卵母細(xì)胞的二分，(d)用于第一次融合的成纖維細(xì)胞一卵母細(xì)胞碎片偶聯(lián)體，Ce)從去脂的卵母細(xì)胞發(fā)育來(lái)的四細(xì)胞期的重建胚胎，Cf)從完整卵母細(xì)胞發(fā)育來(lái)的四細(xì)胞期重建胚胎，(g)加溫后從去脂的胚胎再膨脹的胚泡，(h)對(duì)加溫后從去脂的胚胎再膨脹的胚泡進(jìn)行Hoechst染色和UV照射。尺代表100 μ m。圖3.在化學(xué)輔助去核中進(jìn)行二分。注意與較小部分(推定的核體)連接的突出錐(extrusion cone)或極體。立體顯微鏡照片。尺代表50 μ m。圖4.有和無(wú)染色質(zhì)的Hoechst染色和UV照射。UB光源，倒置熒光顯微鏡照片。尺代表50 μ m。(a)在推定的細(xì)胞質(zhì)體中沒(méi)有染色質(zhì)(b)在推定的核體中有染色質(zhì)。圖5.使用化學(xué)輔助手工去核(CAHE)產(chǎn)生的第7天胚泡的立體顯微鏡照片。尺代表 50 μ m。圖6.化學(xué)輔助手工去核(CA HE)后發(fā)育而來(lái)的胚泡的Hoechst染色和UV照射。尺代表50 μ m。發(fā)明詳述本發(fā)明提供通過(guò)核移植克隆哺乳動(dòng)物的改進(jìn)方法，其中核移植是指將核酸DNA的完整互補(bǔ)物從一個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入至去核的細(xì)胞。體細(xì)胞核移植在克隆中，將體細(xì)胞的核或體細(xì)胞移植到自身的核被去除(失核或去核)的卵細(xì)胞(卵母細(xì)胞)內(nèi)被稱(chēng)作體細(xì)胞核移植。新的個(gè)體將從這個(gè)重建的胚胎開(kāi)始發(fā)育，并在遺傳上與體細(xì)胞供體相同。在本發(fā)明中，體細(xì)胞核移植方法是一種細(xì)胞核移植方法，其包括以下步驟:a)構(gòu)建具有至少一部分經(jīng)修飾的透明帶的至少一個(gè)卵母細(xì)胞，b)將該卵母細(xì)胞分成至少2部分,從而獲得至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，c)構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核，d)將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合，e)得到重建的胚胎。然而，本發(fā)明也涉及細(xì)胞核移植的方法，其包含以下步驟:)構(gòu)建至少一個(gè)卵母細(xì)胞，b)將該卵母細(xì)胞分成至少3部分，從而獲得至少2個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，c)構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核，d)將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合，e)得到重建的胚胎。可改變所列步驟中的參數(shù)以獲得對(duì)給定動(dòng)物物種最有效的核移植。下文詳細(xì)描述了多種參數(shù)。卵母細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明所述的術(shù)語(yǔ)“卵母細(xì)胞”是指未成熟的雌性生殖細(xì)胞，其未完成形成卵子(配子)的成熟過(guò)程。在本發(fā)明中，去核的卵母細(xì)胞是核移植過(guò)程中的受體細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明所述的卵母細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物的輸卵管和/或卵巢中分離而來(lái)的。通常，卵母細(xì)胞取自死亡的動(dòng)物，然而也可以從活動(dòng)物的輸卵管和/或卵巢中分離而來(lái)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，卵母細(xì)胞通過(guò)輸卵管回收方法或經(jīng)陰道的回收方法而分離。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，卵母細(xì)胞通過(guò)吸取而分離。卵母細(xì)胞在去核前，通常在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種培養(yǎng)基中成熟。卵母細(xì)胞也可以從剛處死動(dòng)物的卵巢或者冷凍和/或解凍的卵巢中分離。優(yōu)選地，卵母細(xì)胞新鮮地分離自輸卵管。卵母細(xì)胞或細(xì)胞質(zhì)體也可以在使用前被深低溫保藏。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到新鮮分離的、成熟的卵母細(xì)胞是優(yōu)選的，也應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到在收集后或成熟后深低溫保藏卵母細(xì)胞是可以的。如果使用深低溫保藏的卵母細(xì)胞，那么這些卵母細(xì)胞必須在置于成熟培養(yǎng)基內(nèi)之前先進(jìn)行解凍。解凍深低溫保藏的物質(zhì)從而使其在解凍過(guò)程之后具有活性的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。然而，通常卵母細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)體的深低溫保藏是要求非常高的程序，其在豬中尤其難，這是因?yàn)樯衔奶岬降呢i卵母細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)體的普遍易碎，以及高脂質(zhì)含量使其對(duì)寒冷傷害(即，在冷卻和加溫程序中在+15至+5°C之間發(fā)生的傷害)十分敏感。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，收集在體內(nèi)成熟的成熟(分裂中期II)卵母細(xì)胞并用于本文中公開(kāi)的核移植方法?；旧希瑥姆浅瑪?shù)排卵或超數(shù)排卵的哺乳動(dòng)物開(kāi)始發(fā)情后或者注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)或相似的激素后35-48小時(shí)，通過(guò)外科手術(shù)收集成熟的分裂中期II卵母細(xì)胞。當(dāng)卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，可去除可能已積累的在體內(nèi)圍繞在卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞以提供處于對(duì)去核更合適的成熟階段的卵母細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)吹打或渦旋來(lái)去除卵丘細(xì)胞，例如存在0.1-5%透明質(zhì)酸酶，例如0.2-5%透明質(zhì)酸酶，例如0.5-5%透明質(zhì)酸酶，例如0.2-3%透明質(zhì)酸酶，例如0.5-3%透明質(zhì)酸酶，例如0.5-2%透明質(zhì)酸酶，例如0.5_1%透明質(zhì)酸酶，例如0.5%透明質(zhì)酸酶。優(yōu)選方法中的第一步包括從合適的動(dòng)物中分離受體卵母細(xì)胞。在這一點(diǎn)上，卵母細(xì)胞可以從任何動(dòng)物來(lái)源并在任何成熟階段而獲得。已報(bào)道進(jìn)行去核以及核移植的卵母細(xì)胞的成熟階段對(duì)核移植方法的成功十分重要。經(jīng)常通過(guò)吸取從哺乳動(dòng)物卵巢收獲未成熟的(前期I)的卵母細(xì)胞。為應(yīng)用如遺傳改造、核移植和克隆的技術(shù)，這些收獲的卵母細(xì)胞在用作核移植的受體細(xì)胞前，優(yōu)選地在體外成熟。優(yōu)選地，成功的哺乳動(dòng) 物胚胎克隆使用中期II階段的卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞，因?yàn)檎J(rèn)為在此成熟階段的卵母細(xì)胞能夠被或者已被充分活化從而將被導(dǎo)入的核視作一個(gè)授精精子來(lái)處理。然而，本發(fā)明涉及適用于進(jìn)行體細(xì)胞核移植的任何成熟階段的卵母細(xì)胞，通過(guò)本發(fā)明的體細(xì)胞核移植方法可獲得的胚胎、胚泡和/或動(dòng)物。卵母細(xì)胞的體外成熟通常在成熟培養(yǎng)基中進(jìn)行，直到卵母細(xì)胞到達(dá)中期II階段或排出第一極體。未成熟卵母細(xì)胞到達(dá)成熟所用的時(shí)間被稱(chēng)為成熟期。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，卵母細(xì)胞來(lái)自大母豬或小母豬，優(yōu)選地來(lái)自大母豬。動(dòng)物在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞核移植方法中涉及的供體(體細(xì)胞或體細(xì)胞的核)和受體(細(xì)胞質(zhì)體)是非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。同樣地，根據(jù)本發(fā)明可以被植入重建胚胎的動(dòng)物是非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物可以是有蹄類(lèi)動(dòng)物，所述有蹄類(lèi)動(dòng)物選自由如下家養(yǎng)的或野生的代表動(dòng)物組成的組:?？?、羊科、鹿科、豬科、馬科和駱駝科。在特別的具體實(shí)施方式
中，哺乳動(dòng)物是母?；蚬！⒁芭?、美洲野牛、綿羊、大角羊、馬、矮馬、驢、騾子、鹿、麋鹿、北美馴鹿、山羊、水牛、駱駝、駱馬、羊駝或豬。在本發(fā)明一個(gè)特別的具體實(shí)施方式
中，哺乳動(dòng)物是豬。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，豬是野豬。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中,豬是家豬(Susscrofa或S.domesticus)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及小型豬，但也涉及近交系豬。在一個(gè)特別的具體實(shí)施方式
中，豬可選自如下構(gòu)成的組:蘭德瑞斯豬、約克夏豬、漢普夏豬、杜洛克豬、中國(guó)梅山豬、波克夏豬和皮特蘭豬。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及由蘭德瑞斯豬、約克夏豬、漢普夏豬和杜洛克豬構(gòu)成的組。然而，本發(fā)明也涉及由蘭德瑞斯豬、杜洛克豬和中國(guó)梅山豬構(gòu)成的組。相似地，由波克夏豬、皮特蘭豬、蘭德瑞斯豬和中國(guó)梅山豬構(gòu)成的組可以是本發(fā)明的對(duì)象。但由蘭德瑞斯豬和中國(guó)梅山豬構(gòu)成的組也是本發(fā)明的對(duì)象。在一個(gè)特別的具體實(shí)施方式
中，豬是蘭德瑞斯豬或約克夏豬。在一個(gè)特別的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及漢普夏品種的豬和杜洛克品種的豬。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，豬是中國(guó)梅山品種的豬。然而，波克夏豬也包括在本發(fā)明內(nèi)，而且在特別的具體實(shí)施方式
中，皮特蘭豬也包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
涉及選自如下組的小型豬:戈丁根豬(Goettingen)、尤卡坦豬(Yucatan)、巴馬香豬、五指山豬、西雙版納豬。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及由戈丁根豬和尤卡坦豬構(gòu)成的組。另外地，本發(fā)明涉及由巴馬香豬、五指山豬、西雙版納豬構(gòu)成的組。特別地，本發(fā)明涉及戈丁根豬。但尤卡坦豬也與本發(fā)明相關(guān)。相似地，巴馬香豬包括在本發(fā)明內(nèi)，五指山豬以及尤其是西雙版納豬也包括在本發(fā)明內(nèi)。 根據(jù)本發(fā)明的供體哺乳動(dòng)物可以是雌性或雄性。所述哺乳動(dòng)物的年齡可以是任何年齡，例如成年，或例如胎兒。胚胎根據(jù)本發(fā)明，重建的胚胎(S卩，單細(xì)胞胚胎)包含供體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。隨后，重建的胚胎在有絲分裂開(kāi)始后，逐漸分裂成多細(xì)胞胚胎。在體外，通常通過(guò)本文所述的活化來(lái)誘導(dǎo)有絲分裂的開(kāi)始。 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“胚胎”也指重建的胚胎，其是在核移植過(guò)程后，在經(jīng)活化而開(kāi)始有絲分裂后形成的胚胎。重建的胚胎在體外培養(yǎng)。當(dāng)胚胎包括大約12 - 16個(gè)細(xì)胞時(shí)，其被稱(chēng)作“桑椹胚”。隨后，胚胎進(jìn)一步分裂并形成許多細(xì)胞，并且在其中心產(chǎn)生了充滿液體的囊腔一囊胚腔。在此階段，胚胎被稱(chēng)作“胚泡”。在為植入做好準(zhǔn)備之時(shí)發(fā)育階段的“受精的”卵母細(xì)胞，其來(lái)自桑椹胚并由內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、內(nèi)腔和被稱(chēng)為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的外層細(xì)胞組成。根據(jù)本發(fā)明的胚泡可被植入到寄主哺乳動(dòng)物的子宮內(nèi)，并繼續(xù)生長(zhǎng)成胎兒直至動(dòng)物。在本文提供的用于產(chǎn)生遺傳修飾的或轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物、用于克隆非人類(lèi)哺乳動(dòng)物、用于培養(yǎng)重建的胚胎和/或用于深低溫保藏豬胚胎的方法中，胚胎可以在體外培養(yǎng)。胚胎可以例如進(jìn)行序貫培養(yǎng)(sequential culture) 0應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到胚胎可以是正常胚胎，或在本文其它地方限定的重建的胚胎。細(xì)胞質(zhì)體核被去除的卵母細(xì)胞或卵母細(xì)胞的一部分。供體細(xì)胞本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“供體細(xì)胞”表示體細(xì)胞和/或來(lái)自生殖系的細(xì)胞。本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“體細(xì)胞”表示來(lái)自任何發(fā)育階段的動(dòng)物的任何(體)細(xì)胞。例如體細(xì)胞可源自胎兒或成體組織。特別優(yōu)選的體細(xì)胞是胎兒起源的那些細(xì)胞。然而，也可以使用來(lái)自生殖系的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，供體細(xì)胞是體細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，供體細(xì)胞是從生殖細(xì)胞系衍生而來(lái)的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，供體細(xì)胞具有所需的遺傳特性。然而，供體細(xì)胞可具有通過(guò)在本文其它地方描述的遺傳操作而得到的所需遺傳特性。體細(xì)胞選自如下構(gòu)成的組:上皮細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞)，紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核的細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞和其它肌細(xì)胞。這些細(xì)胞可從不同的器官中獲得，例如，皮膚、肺、胰腺、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎臟、尿道和其它泌尿器官。可從中取得體細(xì)胞的動(dòng)物在本文的其它地方有描述。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
使用與受體卵母細(xì)胞(細(xì)胞質(zhì)體)相同物種來(lái)源的體細(xì)胞。優(yōu)選地，體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，其可從發(fā)育中的胎兒和成體動(dòng)物大量地獲得。此夕卜，成纖維細(xì)胞可在體外容易地繁殖。最優(yōu)選地，體細(xì)胞是胎兒來(lái)源的、體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，體細(xì)胞被遺傳修飾。在另一個(gè)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，體細(xì)胞是豬細(xì)胞，并且優(yōu)選的是胎兒來(lái)源，或例如來(lái)自成體。去核卵母細(xì)胞的去核的方法可選自下述方法構(gòu)成的組:吸取、物理去除、使用DNA特異的熒光染料、暴露于紫外光下和/或化學(xué)輔助的去核。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及DNA特異熒光染料的應(yīng)用。然而，可以通過(guò)暴露于紫外光下來(lái)進(jìn)行去核。在特別的具體實(shí)施方式
中，在物理去除核之前對(duì)去核施以化學(xué)輔助。使用例如抗腫瘤試劑(如秋水仙胺(N 一去乙?；?N —甲基I秋水仙堿))，和/或例如依托泊苷或相關(guān)試劑的化學(xué)輔助去核可在對(duì)透明帶的酶促修飾前實(shí)施。化學(xué)輔助去核包括在成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)成熟的C0C，所述成熟培養(yǎng)基在本文其它地方被描述并在特定的時(shí)間段內(nèi)添加秋水仙胺。可向成熟培養(yǎng)基中添加 0.1 μ g/ml — 10 μ g/ml,如 0.2 μ g/ml — 10 μ g/ml,例如 0.3 μ g/ml — 10 μ g/ml,如 0.25 μ g/ml — 5 μ g/ml,例如 0.3 μ g/ml — I μ g/ml,如 0.25 μ g/ml — 0.5 μ g/ml,例如0.4 μ g/ml的秋水仙胺。相似地，可向成熟培養(yǎng)基中添加依托泊苷，例如0.1 μ g/ml 一10 μ g/ml,如 0.2 μ g/ml — 10 μ g/ml，例如 0.3 μ g/ml — 10 μ g/ml,如 0.25 μ g/ml — 5 μ g/ml,例如 0.3 μ g/ml — I μ g/ml,如 0.25 μ g/ml — 0.5 μ g/ml,例如 0.4 μ g/ml。在有抗腫瘤試劑時(shí)的COC培養(yǎng)時(shí)間是10分鐘一 5小時(shí)，如30分鐘一 5小時(shí)，例如10分鐘一 2小時(shí)，例如30分鐘一 2小時(shí)，例如10分鐘一 1.5小時(shí)，如20分鐘一 3小時(shí)，例如10分鐘一 3小時(shí)，如30分鐘一 1.5小時(shí)，例如45分鐘。在特別的具體實(shí)施方式
中，化學(xué)輔助去核通過(guò)使用0.45 μ g/ml的秋水仙胺和/或依托泊苷添加到成熟培養(yǎng)基中45分鐘來(lái)完成。在特別的具體實(shí)施方式
中，去核優(yōu)選地通過(guò)物理去除核來(lái)進(jìn)行。物理去除可通過(guò)分離完成，例如通過(guò)二分卵母細(xì)胞成兩半(2個(gè)部分)一包含核的一半以及去核的卵母細(xì)胞一半(被稱(chēng)為細(xì)胞質(zhì)體)，去除卵母細(xì)胞的有核一半并選擇所得的細(xì)胞質(zhì)體用于本發(fā)明的進(jìn)一步步驟?；蛘?，分離通過(guò)三分完成，從而產(chǎn)生 3部分，其中2部分是細(xì)胞質(zhì)體。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，卵母細(xì)胞可以被分成4部分，從而產(chǎn)生3個(gè)細(xì)胞質(zhì)體。卵母細(xì)胞甚至可通過(guò)物理去除被分成5部分，產(chǎn)生4個(gè)細(xì)胞質(zhì)體。相似地,卵母細(xì)胞可以被分成6部分，例如7部分，如8部分，例如9部分，如10部分或更多部分。卵母細(xì)胞的物理分離以及隨后的卵母細(xì)胞有核部分的去除可通過(guò)使用顯微外科刀片來(lái)完成。可篩選卵母細(xì)胞以鑒定哪一些卵母細(xì)胞被成功去核。含有核DNA的卵母細(xì)胞部分可通過(guò)使用Hoechst熒光染料的染色來(lái)鑒定，其染色程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。丟棄含有核DNA的卵母細(xì)胞部分，選擇去核的卵母細(xì)胞(細(xì)胞質(zhì)體)用于以后的程序。透明帶透明帶是厚的、透明的、非細(xì)胞性層或膜，其以均一厚度圍繞在卵母細(xì)胞周?chē)?。因?yàn)樵S多要素，所以通常認(rèn)為完整的透明帶在細(xì)胞核移植中是重要的。要素之一是維持極體靠近卵母細(xì)胞的中期板，以顯示去核的合適位置。另一個(gè)要素涉及在融合前和融合期間，維持供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)體接近。也認(rèn)為透明帶在融合期間保護(hù)了供體細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)體。最后，認(rèn)為重建和活化后的胚胎發(fā)育受到透明帶的支持。

可通過(guò)多種方法對(duì)至少一部分透明帶進(jìn)行修飾。例如，可使用物理操作來(lái)修飾透明帶。但也可使用利用如酸性溶液(臺(tái)氏酸性液)的試劑的化學(xué)處理。可在本發(fā)明中使用的化學(xué)試劑的一個(gè)實(shí)例是酸性溶液，例如臺(tái)氏液(Tyrode)。在本發(fā)明的一個(gè)特別的具體實(shí)施方式
中，通過(guò)酶促消化修飾透明帶。這樣的酶促消化可通過(guò)包含例如胰蛋白酶的酶類(lèi)而進(jìn)行。另外地，可使用特殊的蛋白酶，如鏈霉蛋白酶。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，酶促消化導(dǎo)致透明帶的一部分至少部分消化，其在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中表示透明帶的至少一部分被去除，或者透明帶被部分地去除。在這里，透明帶沒(méi)有被完全去除。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
，透明帶被部分消化的部分的特征在于:透明帶仍然可見(jiàn)，并且事實(shí)上卵母細(xì)胞沒(méi)有變形。可通過(guò)暴露于蛋白酶來(lái)實(shí)現(xiàn)部分消化。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可通過(guò)使用鏈霉蛋白酶來(lái)完成部分消化。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可通過(guò)蛋白酶和鏈霉蛋白酶的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)部分消化。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，鏈霉蛋白酶的濃度范圍是0.lmg/ml 一 10mg/ml，如0.5mg/ml — 10mg/ml,例如 lmg/ml — 10mg/ml,如 1.5mg/ml — lOmg/ml,例如 2mg/ml —lOmg/ml,如 2.5mg/ml — lOmg/ml,例如 2.75mg/ml — lOmg/ml,如 3mg/ml — lOmg/ml,例如
3.25mg/ml — lOmg/ml,如 3.3mg/ml — lOmg/ml,例如 3.5mg/ml — 10mg/ml。優(yōu)選的具體實(shí)施方式
的鏈霉蛋白酶濃度范圍是2mg/ml — 5mg/ml,如2.25mg/ml 一5mg/ml,例如 2.5mg/ml — 5mg/ml,如 2.75mg/ml — 5mg/ml,例如 2.8mg/ml — 5mg/ml,如2.9mg/ml — 5mg/ml，例如 3mg/ml — 5mg/ml，如 3.lmg/ml — 5mg/ml，例如 3.2mg/ml — 5mg/ml,如 3.3mg/ml — 5mg/ml。本發(fā)明特別的具體實(shí)施方式
的鏈霉蛋白酶濃度范圍是lmg/ml — 4mg/ml,例如lmg/ml — 3.9mg/ml,如 lmg/ml — 3.8mg/ml,例如 lmg/ml — 3.7mg/ml,如 lmg/ml — 3.6mg/ml,例如 lmg/ml — 3.5mg/ml,如 lmg/ml — 3.4mg/ml,例如 lmg/ml — 3.3mg/ml。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，鏈霉蛋白酶濃度范圍是2.5mg/ml 一 3.5mg/ml,如2.75mg/ml 一 3.5mg/ml,例如3mg/ml — 3.5mg/ml。在特殊的具體實(shí)施方式
中，鏈霉蛋白酶濃度是3.3mg/mL.
對(duì)技術(shù)人員明顯的是鏈霉蛋白酶應(yīng)當(dāng)溶解在合適的培養(yǎng)基中，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的培養(yǎng)基是T33(H印es緩沖的TCM199培養(yǎng)基，其中含有33%的牛血清)(之前在Vajta,等，2003中有描述)。卵母細(xì)胞在鏈霉蛋白酶溶液中溫育的時(shí)間范圍是I秒一30秒，如2秒一30秒，例如3秒一 30秒，如4秒一 30秒，如5秒一 30秒。在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
中，溫育的時(shí)間范圍是2秒一 15秒，如2秒一 14秒，例如2秒一 13秒,如2秒一 12秒,例如2秒一 11秒,如2秒一 10秒,例如2秒一 9秒,例如2秒一 8秒,例如2秒一 7秒，如2 — 6秒,例如2秒一 5秒。在本發(fā)明的特別具體實(shí)施方式
中，溫育的時(shí)間范圍是3秒一10秒，如3秒一9秒，例如4秒一 10秒，如3秒一 8秒,例如4秒一 9秒，如3秒一 7秒,例如4秒一 8秒,例如3秒一6秒,例如4秒一7秒,如3 — 5秒,例如4秒一6秒,如4秒一5秒。特別優(yōu)選的溫育時(shí)間是5秒。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，卵母細(xì)胞在3.3mg/ml鏈霉蛋白酶溶液中，于39 °C下處理5秒鐘。重建的胚胎術(shù)語(yǔ)“重建的胚胎”是指通過(guò)將供體細(xì)胞或供體細(xì)胞的核插入到去核卵母細(xì)胞中而形成的細(xì)胞，其相當(dāng)于受精卵(在正常受精中)。然而，術(shù)語(yǔ)“重建的胚胎”也指“重組的細(xì)胞”。在本發(fā)明中，供體細(xì)胞是體細(xì)胞。然而，供體細(xì)胞也可以從生殖系細(xì)胞衍生而來(lái)。融合根據(jù)本發(fā)明是通過(guò)融合將供體細(xì)胞或來(lái)自供體細(xì)胞的膜包圍的核移植到至少細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)。在下文的情景下，術(shù)語(yǔ)“供`體細(xì)胞”也指來(lái)自供體細(xì)胞的膜包圍的核?？赏ㄟ^(guò)多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)融合。融合可發(fā)生在供體細(xì)胞和至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間，如在供體細(xì)胞和至少2個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間，例如在供體細(xì)胞和至少2個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間，如在供體細(xì)胞和至少3個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間,如在供體細(xì)胞和至少4個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間，例如在供體細(xì)胞和至少5個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間，如在供體細(xì)胞和至少6個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間，例如在供體細(xì)胞和至少7個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間，如在供體細(xì)胞和至少8個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間?？赏瑫r(shí)或依次根據(jù)上文所列的組合進(jìn)行融合。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，同時(shí)進(jìn)行融合。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，依次進(jìn)行至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體和供體細(xì)胞的融合。例如，可通過(guò)化學(xué)融合來(lái)實(shí)現(xiàn)融合，其中供體細(xì)胞和至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體暴露于融合促進(jìn)試劑，融合促進(jìn)試劑例如蛋白質(zhì)、糖蛋白或碳水化合物，或其組合。多種融合促進(jìn)試劑是已知的，例如聚乙二醇(PEG)、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMS0)、外源凝集素、凝集素、病毒和仙臺(tái)病毒。優(yōu)選地使用植物凝集素(PHA)。然而也可以使用甘露醇和或聚乙烯醇。另外地，可通過(guò)使用穿過(guò)融合平面的直流電(DC)的誘導(dǎo)來(lái)完成融合。經(jīng)常使用交流電(AC)使供體和受體細(xì)胞排列對(duì)準(zhǔn)。電融合產(chǎn)生了足夠高的電脈沖，從而能瞬間打破細(xì)胞質(zhì)體和供體細(xì)胞的膜并隨后重新形成膜。其結(jié)果是在供體細(xì)胞和受體細(xì)胞之間打開(kāi)了小通道。在供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的膜相連的情況下，小通道會(huì)逐漸增加并且最終2個(gè)細(xì)胞會(huì)融合成I個(gè)細(xì)胞。
可使用交流電使少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體和供體細(xì)胞排列對(duì)準(zhǔn)，所述交流電的范圍是0.06 - 0.5KV/cm，如0.1 — 0.4KV/cm，例如0.15 — 0.3KV/cm。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，使用0.2KV/cm的交流電使至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體和供體細(xì)胞排列對(duì)準(zhǔn)?？赏ㄟ^(guò)使用穿過(guò)至少I(mǎi)個(gè)細(xì)胞質(zhì)體和供體細(xì)胞的融合平面的直流電來(lái)誘導(dǎo)融合。直流電的范圍是 0.5 - 5KV/cm,如 0.75 — 5KV/cm,例如 I — 5KV/cm,如 1.5 — 5KV/cm,例如2 - 5KV/cm。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
使用的直流電范圍是0.5 一 2KV/cm。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，直流電是2KV/cm。直流電優(yōu)選的使用時(shí)間范圍是I — 15微秒，如5 — 15微秒，例如5 — IO微秒。特別的具體實(shí)施方式
中是9微秒。在特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，使用直流電的融合可使用2KV/cm、9微秒的直流電。然而可以將電融合和化學(xué)融合組合。通常，電融合在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的融合室內(nèi)進(jìn)行。融合可以以至少I(mǎi)步,如2步,例如3步,如4步,例如5步,如6步,例如7步,如8步進(jìn)行。融合可以在例如第一步中進(jìn)行，其中至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與供體細(xì)胞融合。融合的第二步可包括將融合的一對(duì)(細(xì)胞質(zhì)體一供體細(xì)胞，重建的胚胎)與至少I(mǎi)個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，如至少2個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，例如3個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，如4個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，例如5個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，如6個(gè)細(xì)胞質(zhì)體,例如7個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，如8個(gè)細(xì)胞質(zhì)體融合。融合至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體和融合的一對(duì)的融合第二步可依次或同時(shí)進(jìn)行。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，至少2個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與融合的一對(duì)同時(shí)融合。在另一個(gè)具體實(shí) 施方式中，至少2個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與融合的一對(duì)依次融合。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，融合的第二步也可以是活化步驟，其中重建的胚胎被活化而進(jìn)入有絲分裂。如在本文其它地方所描述?；罨趦?yōu)選的具體實(shí)施方式
中，可使重建的胚胎在活化前靜置一段時(shí)間，以使供體細(xì)胞的核在去核細(xì)胞質(zhì)體的全新環(huán)境下，重排其基因組并獲得全能性。重建的胚胎可以在活化前例如靜置I小時(shí)。優(yōu)選地，可活化重建的胚胎以誘導(dǎo)有絲分裂?；罨姆椒▋?yōu)選地選自如下構(gòu)成的組:電脈沖、化學(xué)誘導(dǎo)休克、升高胞內(nèi)二價(jià)陽(yáng)離子水平或減少磷酸化。優(yōu)選所述方法的組合用于活化。在本發(fā)明的一個(gè)特別的具體實(shí)施方式
中，活化和融合的第二步可同時(shí)進(jìn)行。然而，重建的胚胎的活化和重建的胚胎與至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間融合的至少一個(gè)附加步驟可依次進(jìn)行。減少重建的胚胎內(nèi)細(xì)胞蛋白的磷酸化可活化重建的胚胎，其中減少磷酸化可通過(guò)例如添加激酶抑制劑的已知方法進(jìn)行。優(yōu)選的具體實(shí)施方式
可包括使用抑制蛋白質(zhì)合成的試劑，例如放線菌酮。另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
可使用抑制紡錘體形成的試劑，例如細(xì)胞松弛素B。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可提高二價(jià)陽(yáng)離子的細(xì)胞內(nèi)水平。二價(jià)陽(yáng)離子例如鈣可以包括在活化培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，陽(yáng)離子進(jìn)入重建的胚胎，特別在使重建的胚胎接受電脈沖的時(shí)候更是如此。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，電脈沖可引起鈣進(jìn)入重建的胚胎。使用直流電施加電脈沖可以是活化步驟。然而，在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，用于活化的電脈沖還可作為附加的融合步驟。在使用直流電施加電脈沖之前，可通過(guò)應(yīng)用交流電將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體和至少一個(gè)重建的胚胎排列對(duì)準(zhǔn)。交流 電的范圍可以是0.06 - 0.5KV/cm，如0.1 — 0.4KV/cm，例如0.15 - 0.3KV/cm。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，使用0.2KV/cm的交流電將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體和供體細(xì)胞排列對(duì)準(zhǔn)?？赏ㄟ^(guò)應(yīng)用穿過(guò)至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體和供體細(xì)胞的融合平面的直流電來(lái)誘導(dǎo)活化。直流電的范圍是0.2 — 5KV/cm，如0.4 — 5KV/cm，例如0.5_5KV/cm。本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
應(yīng)用0.5 - 2KV/cm的直流電。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，直流電是0.7KV/cm。直流電優(yōu)選的使用時(shí)間范圍是10 - 200微秒，如25 — 150微秒，例如50 — 100
微秒。在一個(gè)特別的具體實(shí)施方式
中是80微秒。在特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，使用直流電的融合可使用0.7KV/cm、80微秒的直流電。根據(jù)本發(fā)明的活化的一個(gè)特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
將電脈沖與使重建的胚胎與抑制蛋白合成、紡錘體形成的試劑和二價(jià)陽(yáng)離子接觸相組合使用?？赏ㄟ^(guò)上述方法的任何組合進(jìn)行活化。遺傳修飾的類(lèi)型可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法遺傳修飾供體細(xì)胞。遺傳修飾可以是通過(guò)缺失、插入、復(fù)制和/或其它形式的突變(包括點(diǎn)突變)的基因組DNA的修飾。修飾可以在編碼序列和/或非編碼序列中實(shí)施。用于插入的DNA構(gòu)建體可含有目的基因和/或如啟動(dòng)子、絕緣子、增強(qiáng)子、抑制子或核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的調(diào)節(jié)序列。在某些具體實(shí)施方式
中，只向基因組中導(dǎo)入一個(gè)遺傳修飾。然而在其它具體實(shí)施方式
中，基因組在一個(gè)以上的位點(diǎn)被修飾。對(duì)如成纖維細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的遺傳修飾的合適技術(shù)包括:例如通過(guò)非同源重組的基因添加、通過(guò)同源重組的基因置換和基因編輯技術(shù)。這包括使用逆轉(zhuǎn)錄病毒插入、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移和/或人工染色體技術(shù)。非同源DNA重組可以例如根據(jù)Kragh等(2004)R印rod.Fert.Dev.16:290 或 Kragh 等(2004) Reprod.Fert.Dev.16:315 中描述的進(jìn)行，基于轉(zhuǎn)座子的基因轉(zhuǎn)移可根據(jù)Izsvak等(1997) Cell91:501描述的進(jìn)行。通過(guò)同源重組的基因置換可例如包括Urnow等(2005)Nature435:646所描述的技術(shù)?；蚓庉嫷募夹g(shù)在Andersen等(2002) J.Mol.Med.80:770，Liu 等(2002) Gene Ther.9:118 和Sorensen等(2005) J.Mol.Med.83:39中得到描述。胚胎的體外培養(yǎng)本發(fā)明一方面涉及體外培養(yǎng)胚胎的方法，由此胚泡率升高到25.3%。這樣，培養(yǎng)重建的胚胎的方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其包括以下步驟:a)構(gòu)建具有至少一部分透明帶的至少一個(gè)卵母細(xì)胞，b)將該卵母細(xì)胞分成至少2部分，從而獲得具有核的卵母細(xì)胞和至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，c)構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核，d)將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合，e)得到重建的胚胎，f)活化該重建的胚胎以形成胚胎，
e)培養(yǎng)所述胚胎。
本發(fā)明另一方面涉及細(xì)胞核移植的方法，其中包括培養(yǎng)胚胎的步驟。在與本文描述的方法相關(guān)的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，胚胎在依序的一組培養(yǎng)基中培養(yǎng)。優(yōu)選地，胚泡生長(zhǎng)在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基中，所述傳統(tǒng)的培養(yǎng)基例如NCSU37或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等同的培養(yǎng)基，其中去除葡萄糖并用其它試劑替代。一種試劑可以是丙酮酸鹽。另一種試劑可以是乳酸鹽。這些試劑也可以組合并替代傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的葡萄糖。胚胎可以在如上所述替代的培養(yǎng)基中培養(yǎng)從第O天至第3天，例如從第O天至第2天。丙酮酸鹽的濃度范圍是0.05 -1mM，如0.1 — ImM，例如0.125 — ImM，如0.15 —ImM。然而丙酮酸鈉的濃度范圍也可以是0.05mM — 0.9mM，如0.05 — 0.8mM，例如0.05 —0.7mM,如 0.05 — 0.6mM,例如 0.05 — 0.5mM,如 0.05 — 0.4mM,例如 0.05 — 0.3mM,如0.05 - 0.2mM。優(yōu)選的濃度范圍是0.05 一 0.17mM。丙酮酸鈉的優(yōu)選濃度是0.17mM。乳酸鹽的濃度范圍是0.5 — 10mM，如 0.75 — 10mM，例如 I — 10mM，如 1.5 — IOmM,如1.75 — 10mM ，例如2 — 10mM，如2.5— IOmM.然而乳酸鈉的濃度范圍也可以是0.5mM —9mM,如 0.5 — 8mM,例如 0.5 — 7mM,如 0.5 — 6mM,例如 0.5 — 5mM,如 0.5 — 4mM,例如0.5 - 03mM。優(yōu)選的濃度范圍是I — 5mM，如2 — 4mM，例如2 — 3mM。乳酸鈉的優(yōu)選濃度是
2.73mM。在初始無(wú)葡萄糖的溫育后，培養(yǎng)基葡萄糖再次替代丙酮酸鹽和乳酸。胚胎可在含葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)從第4天至第3天，優(yōu)選從第3天至第7天。葡萄糖的濃度范圍是I 一10mM，如2 — 10mM，例如3 — 10mM，如4— 10mM，例如5 — 10mM。然而，葡萄糖濃度也可以是I — 9mM,如2 — 8mM,例如3 — 7mM,如4 — 6mM。根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖的優(yōu)選濃度是5.5mM。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，胚胎是豬胚胎。遺傳修飾的動(dòng)物根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
，提供具有所需基因型的遺傳修飾的或轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明不包括修飾動(dòng)物的遺傳身份的步驟或從這些步驟得到的動(dòng)物，這些步驟可能使動(dòng)物痛苦而對(duì)人類(lèi)或動(dòng)物無(wú)任何實(shí)質(zhì)性醫(yī)學(xué)益處。本發(fā)明涉及產(chǎn)生遺傳修飾或轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的方法，其包括以下步驟:a)構(gòu)建具有至少一部分經(jīng)修飾的透明帶的至少一個(gè)卵母細(xì)胞，b)將該卵母細(xì)胞分成至少2部分，從而獲得具有核的卵母細(xì)胞和至少I(mǎi)個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，c)構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核，d)將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合，e)得到重建的胚胎，f )活化該重建的胚胎以形成胚胎，g)培養(yǎng)所述胚胎，以及h)將所述培養(yǎng)的胚胎轉(zhuǎn)移到寄主哺乳動(dòng)物中，使得該胚胎發(fā)育成遺傳修飾的胎兒。然而，遺傳改造或轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物也可通過(guò)包括以下步驟的方法產(chǎn)生:a)構(gòu)建至少一個(gè)卵母細(xì)胞，b)將該卵母細(xì)胞分成至少3部分，從而獲得具有核的卵母細(xì)胞和至少I(mǎi)個(gè)細(xì)胞質(zhì)體，c)構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核，d)將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合，e)得到重建的胚胎，f )活化該重建的胚胎以形成胚胎，g)培養(yǎng)所述胚胎，以及h)將所述培養(yǎng)的胚胎轉(zhuǎn)移到寄主哺乳動(dòng)物中，使得該胚胎發(fā)育成遺傳修飾的胎兒。器官或組織捐獻(xiàn)
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的動(dòng)物被用作人類(lèi)或其它動(dòng)物(相同物種的動(dòng)物或其它物種的動(dòng)物)的器官或組織捐獻(xiàn)的來(lái)源。物種之間的轉(zhuǎn)移經(jīng)常被稱(chēng)為異種移植?？梢砸浦驳耐暾鞴侔ㄐ呐K、腎臟、肝臟、胰腺或肺。另外地，器官的部分(如特殊的器官組織)可以被移植或轉(zhuǎn)移到人類(lèi)或其它動(dòng)物中。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，為治療目的將來(lái)自本發(fā)明動(dòng)物的單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞的群體轉(zhuǎn)移到人類(lèi)或另一動(dòng)物中。疾病模型本發(fā)明也涉及克隆根據(jù)本發(fā)明方法的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的方法。這樣，本發(fā)明一方面涉及包括以下步驟的克隆非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的方法:a)構(gòu)建如本文描述的胚泡，任選地解凍胚胎，b)將所述培養(yǎng)的胚胎轉(zhuǎn)移到寄主哺乳動(dòng)物中，使得胚胎發(fā)育成遺傳修飾的胎兒。遺傳修飾的胎兒可發(fā)育成非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。本發(fā)明也涵蓋通過(guò)本文描述的方法可獲得的、作為疾病模型的遺傳修飾的動(dòng)物。因此，本發(fā)明第二方面是通過(guò)本文描述的方法可獲得的遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。另一方面涉及通過(guò)本文描述的方法可獲得的遺傳修飾的非人類(lèi)胚胎。本文所描述的方法不包括在非人類(lèi)機(jī)體上進(jìn)行的外科手術(shù)步驟。本發(fā)明的用于細(xì)胞核移植的方法提供了產(chǎn)生用于任何相關(guān)疾病的模型動(dòng)物的工具，希望設(shè)計(jì)所述模型動(dòng)物以研究疾病的發(fā)生、潛在的治療方案，藥物測(cè)試和預(yù)防。所選擇的疾病不局限在任何特定的疾病組。本發(fā)明開(kāi)發(fā)遺傳修飾的動(dòng)物疾病模型的應(yīng)用實(shí)例顯示在下文中。然而，本發(fā)明不局限于下文所列的實(shí)例。在通過(guò)HMC技術(shù)進(jìn)行SCNT之前將遺傳修飾導(dǎo)入到體細(xì)胞內(nèi)。然而，在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可以在手工克隆(HMC)期間導(dǎo)入遺傳修飾，例如在HMC程序的不同步驟時(shí)加入轉(zhuǎn)基因，而轉(zhuǎn)基因會(huì)找到到達(dá)胚胎基因組的途徑。遺傳修飾包括致病基因、突變基因隨機(jī)整合入體細(xì)胞基因組。也可以是正常非突變基因的隨機(jī)整合，所述 正常非突變基因當(dāng)表達(dá)在特定的組織或在特定的表達(dá)水平時(shí)引起疾病。導(dǎo)入的基因或轉(zhuǎn)基因可來(lái)源于任何物種，其中包括細(xì)菌、豬、人類(lèi)、小鼠、大鼠、酵母、無(wú)脊椎動(dòng)物或植物。轉(zhuǎn)基因的調(diào)節(jié)序列可驅(qū)動(dòng)普遍的或可誘導(dǎo)的或者組織和/或時(shí)間特異的表達(dá)，并且也可以來(lái)源于任何物種，其中包括豬、人類(lèi)、小鼠、大鼠、酵母、無(wú)脊椎動(dòng)物或植物。重要的是，通過(guò)同源重組靶向構(gòu)建體或通過(guò)基因編輯程序可將體細(xì)胞中的遺傳修飾靶向到豬基因組中的特定區(qū)域。特定基因的失活(例如敲除)可以引起疾病或表型，或者特定突變整合(敲入)到特定基因內(nèi)可以引起疾病。同樣，可通過(guò)同源重組方法將引起疾病的轉(zhuǎn)基因整合到豬基因組的特定調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)。在HMC程序之前或期間導(dǎo)入到豬基因組中的遺傳修飾也可以是外遺傳修飾(例如DNA甲基化或者組蛋白的甲基化或乙?；?去乙酰化)，通過(guò)將體細(xì)胞、卵母細(xì)胞或重建的HMC胚胎與化學(xué)成分(如Tricostatin或具有相似作用的化合物)溫育。本發(fā)明涉及作為疾病模型的遺傳修飾的動(dòng)物，疾病模型例如是變性疾病、線粒體相關(guān)蛋白折疊疾病、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病或硬化癥的模型。然而，遺傳性阿爾茨海默病模型也是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，疾病模型可以包括所有類(lèi)型的癌癥疾病，例如乳腺癌。但可以研究所有的癌癥，如結(jié)腸癌或肺癌。其它具體實(shí)施方式
涉及用于治療性活性分子或柔性脂質(zhì)體皮膚滲透的分析的具有遺傳傳感器系統(tǒng)的模型。另一個(gè)具體實(shí)施方式
涉及用于傷口愈合或潰瘍治療的疾病模型。而且，例如通過(guò)整形外科治療畸形的疾病模型在本發(fā)明的范圍內(nèi)。同樣地，與組織改造(例如細(xì)胞移植、組織移植、器官移植)相關(guān)的疾病模型在本發(fā)明的范圍內(nèi)。其它的疾病模型是牛皮癬疾病模型和/或表皮松解性疾病(例如單純性大皰性表皮松解癥)的疾病模型。同樣地，治療和預(yù)防由動(dòng)脈粥樣硬化癥、缺血性心臟病引起的疾病的模型是本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。模型也包括代謝疾病的模型，所述代謝疾病導(dǎo)致廣泛的常見(jiàn)疾病，例如糖尿病和肥胖癥。但動(dòng)脈粥樣硬化癥和心血管疾病最初也可由代謝疾病所引起。腎臟衰竭是可由代謝功能障礙引起的疾病的另一個(gè)實(shí)例。同樣地，高血壓最初也可因代謝功能障礙病引起并可在代謝疾病的遺傳修飾動(dòng)物模型中被研究。同樣還有，線粒體蛋白突變引起的疾病，例如短鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏、神經(jīng)肌肉虛弱、鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺失變體的表達(dá)引起的變性。玻璃化術(shù)語(yǔ)深低溫保藏用于在活細(xì)胞的冷凍、儲(chǔ)存和解凍過(guò)程中涉及的不同的細(xì)胞冷凍技術(shù)。玻璃化是深低溫保藏的一種形式，其中快速冷卻活細(xì)胞使得細(xì)胞的液體不形成冰。這樣，玻璃化涉及冷卻步驟，其中通過(guò)冷卻到低的零下溫度，例如(通常是)_80°C或_196°C (液氮的沸點(diǎn))來(lái)保存細(xì)胞或整個(gè)組織。在這些低溫下，任何生物活性都被有效地停止，所述生物活性包括能導(dǎo)致細(xì)胞死亡 的生化反應(yīng)。然而，玻璃化是指特殊的方法，其中在培養(yǎng)基、保存的細(xì)胞或組織中不允許形成冰?？赏ㄟ^(guò)使用高濃度的冷凍保護(hù)劑溶液和極高的冷卻速度來(lái)實(shí)現(xiàn)此無(wú)冰冷卻。加溫也要以溫度的快速升高來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明一方面涉及玻璃化(深低溫保藏)卵母細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)體、細(xì)胞、胚胎或胚泡的能力。這樣，本發(fā)明公開(kāi)了包括以下步驟的豬胚胎深低溫保藏的方法:a)構(gòu)建至少一個(gè)豬卵母細(xì)胞，b)使該卵母細(xì)胞去脂，c)活化重建的胚胎以形成胚胎，d)培養(yǎng)所述胚胎，e)玻璃化該胚胎。而且，可如本文其它地方所述的將去脂的卵母細(xì)胞分離成至少2部分，從而獲得具有核的卵母細(xì)胞和至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體。特別地，本發(fā)明涉及卵母細(xì)胞的玻璃化，然而，本發(fā)明也涉及胚胎的玻璃化，優(yōu)選地胚胎處于胚泡期。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，在玻璃化前將胚胎培養(yǎng)到胚泡期。本發(fā)明尤其涵蓋豬胚胎。同樣地，本發(fā)明涵蓋玻璃化的細(xì)胞質(zhì)體，以及細(xì)胞。本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)本文描述的細(xì)胞核移植方法獲得的豬胚胎的深低溫保藏，其包括玻璃化豬胚胎的步驟。本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)本文提供的方法獲得的或可獲得的豬胚胎。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“深低溫保藏”可以指對(duì)本發(fā)明的卵母細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)體、細(xì)胞、胚胎或動(dòng)物的玻璃化。深低溫保藏中使用的溫度優(yōu)選地低于_80°C，更優(yōu)選地低于_196°C。本發(fā)明的卵母細(xì)胞、細(xì)胞和胚胎可以深低溫保藏?zé)o限量的時(shí)間。已知生物材料可以深低溫保藏大于50年。當(dāng)使用方法以產(chǎn)生遺傳改造的或轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物時(shí)，在移植到寄主哺乳動(dòng)物前可深低溫保藏胚胎，而這包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。移植前的這種深低溫保藏可在胚胎發(fā)育的胚泡期進(jìn)行。
本發(fā)明一方面涉及通過(guò)使用酶類(lèi)試劑(例如鏈霉蛋白酶)的溫和處理對(duì)卵母細(xì)胞非侵入性去脂。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，鏈霉蛋白酶優(yōu)選的濃度范圍是0.5 - 5mg/ml，如0.5mg/ml — 3mg/ml,例如0.5mg/ml — 2mg/ml。優(yōu)選地,鏈霉蛋白酶的濃度是lmg/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，通過(guò)使用濃度為3.3mg/ml的鏈霉蛋白酶處理來(lái)獲得卵母細(xì)胞的非侵入性去脂。在有合適的培養(yǎng)基存在下進(jìn)行卵母細(xì)胞的去脂，例如包含50%牛血清的培養(yǎng)基?？墒谷ブ襟E進(jìn)行一段時(shí)間，優(yōu)選的范圍是I 一 5分鐘，特別是3分鐘。然而，在鏈霉蛋白酶的濃度為2.5mg/ml — 5mg/ml范圍內(nèi)的情況下，允許進(jìn)行去脂步驟的時(shí)間段是5秒一 15秒,例如5秒一 10秒,如10秒一 15秒。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
是使用3.3mg/ml的鏈霉蛋白酶對(duì)卵母細(xì)胞去脂10秒。優(yōu)選地，其后在合適的培養(yǎng)基中洗滌卵母細(xì)胞，例如添加了牛血清的Hepes緩沖的TCM - 199培養(yǎng)基，所述牛血清例如是20%。鏈霉蛋白酶消化和洗滌的卵母細(xì)胞優(yōu)選地以
8,000 - 15, OOOx g，例如9，000 — 14，OOOx g進(jìn)行離心。在特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，卵母細(xì)胞以12，OOOx g進(jìn)行離心。離心可以進(jìn)行10 — 30分鐘，如20分鐘。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，卵母細(xì)胞通過(guò)濃度為lmg/ml的鏈霉蛋白酶去脂3分鐘，其后洗滌卵母細(xì)胞并隨后以12，OOOx g離心20分鐘。在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，可玻璃化去脂的卵母細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
，去脂的卵母細(xì)胞可以被玻璃化并隨后被加溫以用于根據(jù)本發(fā)明的方法中。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，去脂的卵母細(xì)胞可用于本文中所描述的方法以生產(chǎn)例如胚胎，特別是優(yōu)選地被玻璃化的胚泡期的胚胎。玻璃化的卵母細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)體、細(xì)胞、胚胎或胚泡期的胚胎可如此被玻璃化。通過(guò)本發(fā)明的玻璃化步驟而產(chǎn)生的玻璃化的胚泡可儲(chǔ)存并經(jīng)加溫植入合適的非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物中以產(chǎn)生根據(jù)本文細(xì)胞核移植方法的遺傳修飾的哺乳動(dòng)物。線粒體通過(guò)本發(fā)明可獲得的遺傳修飾的非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物和/或非人類(lèi)的胚胎的組織細(xì)胞可含有不同母源的線粒體。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物和/或非人類(lèi)的胚胎可含有來(lái)自唯一母源的線粒體，然而，在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物和/或非人類(lèi)的胚胎可含有來(lái)自至少2個(gè)母源，如3個(gè)母源，例如4個(gè)母源，如5個(gè)母源，例如6個(gè)母源，如7個(gè)母源，例如8個(gè)母源，如9個(gè)母源，例如10個(gè)母源的線粒體。具有特定數(shù)目母源的可能性可基于觀察到的線粒體類(lèi)型來(lái)計(jì)算。
實(shí)施例除非另有指明，所有的化學(xué)試劑購(gòu)自Sigma Chemical C0.(St Louis, MO, USA)。卵母細(xì)胞收集和體外成熟(IVM)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)從屠宰場(chǎng)獲得的大母豬和小母豬卵巢的2 - 6mm卵泡中吸取。50個(gè)為一組的COC在400 μ I添加10%(ν/ν)牛血清(CS)、10%(ν/ν)豬卵泡液、10IU/ml eCG、5IU/ml hCG (Suigonan Vet; Skovlunde, Denmark)的碳酸氫鹽緩沖的TCM-199 (GIBCO BRL)中，于"Submarine Incubation System" (SIS; Vajta,等 1997)內(nèi)，在
38.5°C、5%C02、濕潤(rùn)空氣中成熟41-44小時(shí)。體外受精(IVF)使用體外成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行3次相同重復(fù)的IVF實(shí)驗(yàn)。在成熟后，使用含2mM咖啡因的mTBM UTBMfert)洗滌COC兩次并以50個(gè)為一組轉(zhuǎn)移至400 μ I HiTBMfert中。如前所述(Booth等，發(fā)表中)處理新鮮射出的精液。在38.5°C、5%C02、濕潤(rùn)空氣中獲能2小時(shí)后，精子以IxlO5個(gè)精子/ml的調(diào)整后終濃度添加到卵母細(xì)胞中。受精在38.5°C、5%C02、濕潤(rùn)空氣中，于SIS內(nèi)進(jìn)行3小時(shí)。授精后，假定的受精卵在HiYBMtet中渦旋以去除卵丘細(xì)胞，然后用IVC培養(yǎng)液洗滌并置于培養(yǎng)皿中(參見(jiàn)胚胎培養(yǎng)和評(píng)估)。手工克隆(HMC)所應(yīng)用的HMC方法基于我們之前在牛和豬中的工作(Kragh，等，2004; Peura和Vajta, 2003; Vajta等，2003)，但具有顯著的修改。簡(jiǎn)單的說(shuō)，成熟開(kāi)始后41小時(shí)，通過(guò)在含lmg/ml透明質(zhì)酸酶的Hepes緩沖的TCM199中反復(fù)吹打來(lái)去除COC上的卵丘包埋。從此開(kāi)始(除另有說(shuō)明的地方)，所有的操作在調(diào)節(jié)到39°C的加熱臺(tái)上進(jìn)行，所有用于操作卵母細(xì)胞的液滴都是20 μ I體積并用礦物油覆蓋。卵母細(xì)胞在溶解有3.3mg/ml鏈霉蛋白酶的T33 (T代表Hepes緩沖的TCM199培養(yǎng)基；數(shù)字表示CS添加的百分比(v/v)，在此是33% )中簡(jiǎn)短溫育5秒鐘。在卵母細(xì)胞在鏈霉蛋白酶溶液中開(kāi)始變形前，取出卵母細(xì)胞并在T2和T20液滴中快速洗滌。具有部分消化但仍可見(jiàn)的透明帶的卵母細(xì)胞在含3mg/ml聚乙烯醇(TPVA)和2.5 μ g/ml細(xì)胞松弛素B的T2液滴中排列成行。在立體顯微鏡監(jiān)控下用Ultra Sharp Splitting Blades (ABTechnology, Pullman, WA, USA;圖la)手工進(jìn)行三分而不是二分。收集三分的卵母細(xì)胞的碎片，并用5 μ g/ml的Hoechst33342熒光染料在TPVA液滴中染色5分鐘，其后置于60mmFalcon Petri皿底部的I μ I TPVA培養(yǎng)基的液滴中，并覆油(每滴3 — 4個(gè)碎片)。使用倒置顯微鏡和UV光，登記沒(méi)有染色質(zhì)染色的碎片(細(xì)胞質(zhì)體)的位置，并隨后在立體顯微鏡下收集到TlO液滴中直到開(kāi)始融合。如前所述(Kragh等，發(fā)表中)制備胎兒成纖維細(xì)胞。融合以2步進(jìn)行，其中第二步也包括起始活化。對(duì)于第一步，使用三分之一的所選細(xì)胞質(zhì)體(優(yōu)選地是較小的部分)。使用細(xì)拉并用火磨光的玻璃吸液管，將10個(gè)細(xì)胞質(zhì)體作為一組轉(zhuǎn)移到lmg/ml植物凝集素(PHA;ICN Pharmaceuticals, Australia)中放置3秒鐘，隨后分別快速滴到幾個(gè)成纖維細(xì)胞中的一個(gè)上,所述成纖維細(xì)胞沉淀在T2液滴中。結(jié)合后，10個(gè)細(xì)胞質(zhì)體一成纖維細(xì)胞對(duì)在融合培養(yǎng)基(0.3M甘露醇和0.01%PVA)中平衡10秒鐘。使用0.6KV/cm、700KHz的交流電(AC)，將細(xì)胞對(duì)排列到融合室(BTX顯微鏡載片0.5mm融合室，450型；BTX, SanDiego, CA, USA)的金屬絲上，而供體細(xì)胞離金屬絲最遠(yuǎn)(圖lb)，然后使用2.0KV/cm的直流電(DC)融合9 μ S。在電脈沖后，小心地將細(xì)胞對(duì)從金屬絲上移開(kāi)，轉(zhuǎn)移到TlO液滴中并溫育以觀察是否發(fā)生融合。第一次融合后大約I小時(shí)，融合的細(xì)胞對(duì)和剩余的三分之二細(xì)胞質(zhì)體在活化培養(yǎng)基液滴(0.3Μ甘露醇、0.1mM MgS04、0.1mM CaCl2和0.01%聚乙烯醇(PVA))中分別平衡。在
0.6KV/cm AC下，以10個(gè)一組細(xì)胞質(zhì)體一融合的細(xì)胞對(duì) 一細(xì)胞質(zhì)體的三聯(lián)體順次排列到金屬絲上，其中融合的細(xì)胞對(duì)位于中間(圖lc)。使用0.7KV/cm、80y s的單DC脈沖用于第二次融合和起始活化。其后將三聯(lián)體從金屬絲上移開(kāi)并小心地轉(zhuǎn)移到Tio液滴中以檢查融合(圖1d)。在添加5 μ g/ml細(xì)胞松弛素B和10 μ g/ml放線菌酮的培養(yǎng)基(參見(jiàn)胚胎培養(yǎng)和評(píng)估)中，在38.5°C、5%C02、5%02和90%N2及最大濕度下，溫育重建的胚胎4小時(shí)，其后在培養(yǎng)前，在IVC培養(yǎng)基中徹底洗滌3次。孤雌激活(PA)分別或與HMC平行產(chǎn)生孤雌激活的卵母細(xì)胞。除了使用鏈霉蛋白酶更長(zhǎng)時(shí)間溫育以使透明帶完全去除外，使用與上述一樣的方法剝離卵母細(xì)胞。無(wú)透明帶(ZF)的卵母細(xì)胞隨后在活化培養(yǎng)基(0.3M甘露醇、0.1mM MgS04、0.1mM CaCl2和0.01%PVA)中平衡10秒鐘，并轉(zhuǎn)移到融合室(BTX顯微鏡載片0.5mm融合室，450型；BTX，SanDiego, CA, USA)中。使用BLS CF-150/B 細(xì)胞融合器(BLS, Budapest, Hungary)產(chǎn)生 0.85KV/cm、80 μ s 的單 DC 脈沖，并用于ZF卵母細(xì)胞。對(duì)于透明帶完整(ZI)的卵母細(xì)胞，使用1.25Κν/(:πι、80μ8的單DC脈沖(其根據(jù)我們未發(fā)表的預(yù)實(shí)驗(yàn)，這些參數(shù)分別對(duì)ZI和ZF卵母細(xì)胞產(chǎn)生最高的活化和隨后的體外發(fā)育)。電脈沖后的程序與HMC重建胚胎中的程序相同。胚胎培養(yǎng)和評(píng)估通過(guò)上述處理產(chǎn)生的所有豬胚胎培養(yǎng)在含有4mg/ml BSA的改進(jìn)NCSU37培養(yǎng)基(Kikuchi等，2002)中，以及38.5°C、5%C02、5%02和90%N2及最大濕度下。培養(yǎng)基從第O天(受精和活化的那天)至第2天添加0.17mm丙酮酸鈉和2.73mm乳酸鈉，其后從第2天至第7天用5.5mm葡萄糖代替丙酮酸鈉和乳酸鈉。所有的ZF胚胎培養(yǎng)在與上文所用相同的培養(yǎng)基和混合氣體，以及WOW系統(tǒng)(Vajta等，2000)中，在第2天不從WOW中移出胚胎而小心地更換培養(yǎng)基。在第7天登記胚泡率。為確定細(xì)胞總數(shù)，在含20 μ g/μ I H0echst33342熒光染料的甘油中固定胚泡并涂在玻璃顯微鏡載玻片上。染色24小時(shí)后，在具有落射熒光結(jié)合和UV-2A濾片的Diaphot200倒置顯微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)下觀察胚胎。實(shí)施例1`
大母豬(2.5歲，體重170Kg)所得的卵母細(xì)胞和小母豬(5.5 6個(gè)月，體重75Kg)所得的卵母細(xì)胞之間的發(fā)育能力差異通過(guò)44小時(shí)體外成熟后的ZF和ZI PA來(lái)研究。以3次相同重復(fù)研究了 4個(gè)混合組:(I)從大母豬得到的ZF卵母細(xì)胞(2)從大母豬得到的ZI卵母細(xì)胞(3)從小母豬得到的ZF卵母細(xì)胞(4)從小母豬得到的ZI卵母細(xì)胞。對(duì)于ZF活化，應(yīng)用0.85KV/cm、80 μ s的單DC脈沖，而1.25KV/cm單脈沖用于活化ZI卵母細(xì)胞。如上所述培養(yǎng)7天后，測(cè)定每個(gè)活化胚胎的胚泡百分比。研究了從大母豬或小母豬得到的孤雌激活的卵母細(xì)胞的體外發(fā)育能力。如表I所示，在ZF或ZI PA后，從大母豬得到的孤雌激活的卵母細(xì)胞的胚泡率顯著大于從小母豬得到的卵母細(xì)胞。表1.孤雌激活的大母豬和小母豬卵母細(xì)胞在第7天的胚泡發(fā)育
尤邊雜進(jìn)靜名畫(huà)激活的卵母細(xì)氤活的卵母細(xì)_胞的數(shù)量 (%) * 跑的數(shù)量(%) *
大母豬10343 ( 42 ±4) *HO61 (S5±6) c
小母豬85I (2§±2) *13 36 ( 26 ±5) a
a_b不同的上標(biāo)表示顯著性差異(ρ〈0.05 )。e_d不同的上標(biāo)表示顯著性差異(ρ〈0.05 )。*發(fā)育至胚泡的胚胎百分比(平均值土S.E.M)。分別在體外生產(chǎn)(IVP)和體細(xì)胞核移植(SCNT)胚胎中檢測(cè)大母豬和小母豬之間的卵母細(xì)胞發(fā)育能力的差異，得到與其它研究小組較早發(fā)表文獻(xiàn)(Sherrer等，2004;Hyun等，2003)中相似的結(jié)論，即從大母豬得到的卵母細(xì)胞而來(lái)的胚胎在支持胚泡發(fā)育方面，優(yōu)于從小母豬得到的卵母細(xì)胞的胚胎。盡管在我們的研究中使用的小母豬處在成熟的邊緣，但PA后第7日的胚泡率之間的差異十分顯著，證明大母豬卵母細(xì)胞較高的發(fā)育能力。實(shí)施例2在6次相同的重復(fù)中研究改進(jìn)的豬HMC的可行性，以IVF和平行的ZF PA作為對(duì)照。在實(shí)施例2中使用能力更高的大母豬卵母細(xì)胞(根據(jù)實(shí)施例1)。重建和/或活化后的第7天，確定每重建胚胎的胚泡數(shù)量和隨機(jī)選擇的胚泡的總細(xì)胞數(shù)量。三分后，大于90%的從形態(tài)完整的卵母細(xì)胞得到的卵母細(xì)胞碎片可回收用于HMC。平均從100個(gè)成熟的卵母細(xì)胞可重建37個(gè)胚胎。所有來(lái)源的豬胚胎的發(fā)育能力見(jiàn)表2。在第7天，17±4%的重建胚胎發(fā)育至胚泡期，其平均細(xì)胞數(shù)量是46±5，而IVF和ZF PA的胚泡率分別是 30 ±6% 和 47±4%(η=243, 170，97)。表2.HMC, IVF和ZF PA所產(chǎn)生的胚胎的體外發(fā)育
權(quán)利要求
1.細(xì)胞核移植方法，其包括以下步驟: a.構(gòu)建具有至少一部分經(jīng)修飾的透明帶的至少一個(gè)卵母細(xì)胞， b.將該卵母細(xì)胞分成至少2部分，從而獲得至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體， c.構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核， d.將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合， e.得到重建的胚胎。
2.細(xì)胞核移植方法，其包括以下步驟: a.構(gòu)建至少一個(gè)卵母細(xì)胞， b.將該卵母細(xì)胞分成至少3部分，從而獲得至少2個(gè)細(xì)胞質(zhì)體， c.構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核， d.將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合， e.得到重建的胚胎。
3.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中至少一部分透明帶被部分地去除。
4.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中至少一部分透明帶被酶促部分地去除。
5.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中卵母細(xì)胞分成至少3部分，從而獲得至少2個(gè)細(xì)胞質(zhì)體。
6.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中通過(guò)突變、缺失和/或插入對(duì)所需一個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)行修飾而獲得供體細(xì)胞或細(xì)胞核的所需遺傳特性。
7.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中融合方法選自化學(xué)融合、電融合和生物融合。
8.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中融合以至少一步進(jìn)行。
9.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中融合以至少兩步進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中融合的第一步位于至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體和供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核之間。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中融合的第二步位于權(quán)利要求8的至少一個(gè)融合對(duì)和至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體之間。
12.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中供體細(xì)胞是體細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中體細(xì)胞選自如下構(gòu)成的組:上皮細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞)、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核的細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞和其它肌細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中體細(xì)胞從以下構(gòu)成的組中獲得:皮膚細(xì)胞、肺細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、胃細(xì)胞、腸細(xì)胞、心臟細(xì)胞、生殖器官細(xì)胞、膀胱細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、尿道細(xì)胞和其它泌尿器官細(xì)胞。
15.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
16.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中體細(xì)胞是來(lái)源于哺乳動(dòng)物的成纖維細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中哺乳動(dòng)物是豬。
18.根據(jù)權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2所述的方法，其中供體細(xì)胞來(lái)源于生殖系細(xì)胞。
19.根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中卵母細(xì)胞來(lái)源于豬。
20.產(chǎn)生遺傳修飾的或轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的方法，其包括如下步驟: a.構(gòu)建具有至少一部分經(jīng)修飾的透明帶的至少一個(gè)卵母細(xì)胞， b.將該卵母細(xì)胞分成至少2部分，從而獲得具有核的卵母細(xì)胞和至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體， c.構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核， d.將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合， e.得到重建的胚胎， f.活化該重建的胚胎以形成胚胎， g.培養(yǎng)所述胚胎，以及 h.將所述培養(yǎng)的胚胎轉(zhuǎn)移到寄主哺乳動(dòng)物中，使得該胚胎發(fā)育成遺傳修飾的胎兒。
21.產(chǎn)生遺傳改造的或轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的方法，其包括如下步驟: a.構(gòu)建至少一個(gè)卵母細(xì)胞， b.將該卵母細(xì)胞分成至少3部分，從而獲得至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體， c.構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核， d.將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合， e.得到重建的胚胎， f.活化該重建的胚胎以形成胚胎， g.培養(yǎng)所述胚胎，以及 h.將所述培養(yǎng)的胚胎轉(zhuǎn)移到寄主哺乳動(dòng)物中，使得該胚胎發(fā)育成遺傳修飾的胎兒。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，所述方法包括一個(gè)或多個(gè)在以上任一項(xiàng)權(quán)利要求中限定的特性，其中用于活化重建的胚胎的方法選自如下構(gòu)成的組:電脈沖、化學(xué)誘導(dǎo)休克、升高胞內(nèi)二價(jià)陽(yáng)離子水平和減少磷酸化。
23.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，所述方法包括一個(gè)或多個(gè)在以上任一項(xiàng)權(quán)利要求中限定的特性，其中步驟d)和f)順次或同時(shí)進(jìn)行。
24.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，所述方法包括一個(gè)或多個(gè)在以上任一項(xiàng)權(quán)利要求中限定的特性，其中胚胎在體外培養(yǎng)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中胚胎在序貫培養(yǎng)中進(jìn)行培養(yǎng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，所述方法包括一個(gè)或多個(gè)在以上任一項(xiàng)權(quán)利要求中限定的特性，其中胚胎在轉(zhuǎn)移到寄主哺乳動(dòng)物前被深低溫保藏。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中胚胎處于胚泡期。
28.深低溫保藏豬胚胎的方法，其包括以下步驟: a)構(gòu)建至少一個(gè)豬卵母細(xì)胞， b)對(duì)該卵母細(xì)胞去脂， c)活化重建的胚胎以形成胚胎， d)培養(yǎng)所述胚胎， e)將該胚胎玻璃化。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中去脂的卵母細(xì)胞被分成至少2部分，從而得到具有核的卵母細(xì)胞和至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的方法，所述方法包括一個(gè)或多個(gè)在以上任一項(xiàng)權(quán)利要求中限定的特性，其中所述胚胎在玻璃化前被培養(yǎng)至胚泡期。
31.克隆非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的方法，其包括如下步驟: a.構(gòu)建在權(quán)利要求1一 30中任一項(xiàng)中獲得的胚胎，任選地解凍胚胎， b.將所述胚胎轉(zhuǎn)移到寄主哺乳動(dòng)物中，使得該胚胎發(fā)育成遺傳修飾的胎兒。
32.通過(guò)權(quán)利要求1一 31中任一項(xiàng)所限定的方法可得到的遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞。
33.通過(guò)權(quán)利要求1一 31中任一項(xiàng)所限定的方法可得到的遺傳修飾的非人類(lèi)胚胎的組織細(xì)胞。
34.通過(guò)權(quán)利要求1一 31中任一項(xiàng)所限定的方法可得到的遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞，在所述組織細(xì)胞內(nèi)具有來(lái)自至少3個(gè)不同母源的線粒體。
35.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞或遺傳修飾的非人類(lèi)胚胎的組織細(xì)胞，在所述組織細(xì)胞內(nèi)具有來(lái)自至少3個(gè)不同母源的線粒體。
36.根據(jù)權(quán)利要求32、33或34所述的遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞或遺傳修飾的非人類(lèi)胚胎的組織細(xì)胞，在所述組織細(xì)胞內(nèi)具有來(lái)自至少4個(gè)不同母源的線粒體。
37.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞或遺傳修飾的非人類(lèi)胚胎的組織細(xì)胞，在所述組織細(xì)胞內(nèi)具有來(lái)自?xún)HI個(gè)母源的線粒體。
38.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞或遺傳修飾的非人類(lèi)胚胎的組織細(xì)胞，在所述組織細(xì)胞內(nèi)具有來(lái)自至少2個(gè)母源的線粒體。
39.根據(jù)權(quán)利要 求32、33或34的遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物是豬。
40.根據(jù)權(quán)利要求33或34的遺傳修飾的非人類(lèi)胚胎的組織細(xì)胞，其中所述胚胎來(lái)自豬。
41.培養(yǎng)重建的胚胎的方法，其包括如下步驟: a.構(gòu)建具有至少一部分經(jīng)修飾的透明帶的至少一個(gè)卵母細(xì)胞， b.將該卵母細(xì)胞分成至少2部分，從而獲得具有核的卵母細(xì)胞和至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體， c.構(gòu)建具有所需遺傳特性的供體細(xì)胞或細(xì)胞核， d.將至少一個(gè)細(xì)胞質(zhì)體與該供體細(xì)胞或膜包圍的細(xì)胞核融合， e.得到重建的胚胎， f.活化該重建的胚胎以形成胚胎， g.培養(yǎng)所述胚胎。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述胚胎在序貫培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
43.根據(jù)權(quán)利要求1一 28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法不包括在非人類(lèi)動(dòng)物體上進(jìn)行的外科手術(shù)步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了細(xì)胞核移植的方法，其包括，例如對(duì)卵母細(xì)胞的透明帶的修飾，和/或?qū)⒙涯讣?xì)胞分成幾部分。本發(fā)明也公開(kāi)了生產(chǎn)遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的方法。通過(guò)所公開(kāi)的方法而得到的遺傳修飾的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所公開(kāi)的內(nèi)容還有細(xì)胞的深低溫保藏方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK103205463SQ201310068569
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2006年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日
發(fā)明者杜玉濤, G·瓦吉塔, L·A·伯朗德, P·M·克萊 申請(qǐng)人:奧爾胡斯大學(xué)