專利名稱：一種制備腫瘤特異性抗原致敏dc的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備腫瘤特異性抗原致敏DC的方法，是應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基將單個(gè)核細(xì)胞貼壁富集并進(jìn)而誘導(dǎo)培養(yǎng)為DC的方法。
背景技術(shù)：
樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DC)是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(Antigenpresenting cells, APC),它能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原,未成熟DC具有較強(qiáng)的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。人樹(shù)突狀細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞(hemopoieticstemcell)。DC的來(lái)源有兩條途徑①髓樣干細(xì)胞在GM-CSF的刺激下分化為DC,稱為髓樣DC (myeloid dendritic cells,MDC)，也稱DCl，與單核細(xì)胞和粒細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞；包括朗格漢斯細(xì)胞(Langerhanscells, LCs)，間皮(或真皮)DCs以及單核細(xì)胞衍生的DCs等；②來(lái)源于淋巴樣干細(xì)胞，稱為淋巴樣 DC(Lymophiod dendritic cells, LDC)或衆(zhòng)細(xì)胞樣 DC(plasmacytoid dendriticcells,piX ;)，即DC2，與T細(xì)胞和NK細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)盡管數(shù)量不足外周血單核細(xì)胞的I %，但其表面具有豐富的抗原遞呈分子(MHC-I和MHC-II)、共刺激因子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40、CD40L 等)和粘附因子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-1、LFA-3等)，是功能強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)。DC自身具有免疫刺激能力，是目前發(fā)現(xiàn)的惟一能激活未致敏的初始型T細(xì)胞的APC。人體內(nèi)大部分DC處于非成熟狀態(tài)，表達(dá)低水平的共刺激因子和粘附因子，體外激發(fā)同種混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的能力較低，但未成熟DC具有極強(qiáng)的抗原吞噬能力，在攝取抗原(包括體外加工)或受到某些因素刺激時(shí)即分化為成熟DC，而成熟的DC表達(dá)高水平的共刺激因子和粘附因子。DC在成熟的過(guò)程中，由接觸抗原的外周組織遷移進(jìn)入次級(jí)淋巴器官，與T細(xì)胞接觸并激發(fā)免疫應(yīng)答。DC作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的APC，能夠誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)生成。近年來(lái)研究表明，應(yīng)用腫瘤相關(guān)抗原或抗原多肽體外沖擊致敏DC，回輸或免疫接種于載瘤宿主，可誘發(fā)特異性CTL的抗腫瘤免疫反應(yīng)。DC與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，大部分實(shí)體瘤內(nèi)浸潤(rùn)的DC數(shù)量多則患者預(yù)后好。有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)的核心是產(chǎn)生以⑶8+T細(xì)胞為主體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，這也是DC作為免疫治療手段的基礎(chǔ)。自從Stciman首次發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)以來(lái),人們對(duì)DC的認(rèn)識(shí)隨著它的分離與純化技術(shù)的改進(jìn)而逐步深入，認(rèn)識(shí)的深入又進(jìn)一步促進(jìn)了 DC分離與純化技術(shù)的提高。現(xiàn)已能夠從大多數(shù)組織中得到高純度的、各具特異性的DC，DC的純化方法包括兩大類(I)物理方法①根據(jù)細(xì)胞的黏附性進(jìn)行分離，有黏附分離法、尼龍毛分離法、羰基碳分離法，各種淋巴細(xì)胞的黏附能力依次為巨噬細(xì)胞> DC =抗體產(chǎn)生細(xì)胞> B細(xì)胞> T細(xì)胞；②根據(jù)細(xì)胞的大小比重進(jìn)行分離，包括聚蔗糖2泛影葡胺(Ficoll2 Paque)密度梯度離心、Percoll非連續(xù)性/連續(xù)性密度梯度離心、E花環(huán)沉淀分離；(2)免疫分選包括淘洗法(Pan2ning)、流式細(xì)胞術(shù)(fluid cytometry, FCM)、磁性細(xì)胞分離術(shù)(MACS)等。人外周血中DC含量很少，僅占單個(gè)核細(xì)胞的O. 1% 1.0%。傳統(tǒng)的DC的純化方法僅根據(jù)細(xì)胞的黏附性或細(xì)胞的大小比重進(jìn)行DC的分離純化，雖簡(jiǎn)便易行，但DC的得率較低；而采用免疫分選法，因DC在體外需與各類試劑和儀器管腔直接接觸，存在細(xì)胞被污染的隱患、并有內(nèi)毒素、支原體、衣原體感染的風(fēng)險(xiǎn)，存在一定的·安全隱患，造成其在臨床的推廣應(yīng)用受到很大的局限。要實(shí)現(xiàn)DC在臨床的推廣應(yīng)用，必須提高DC細(xì)胞在體外純化的得率，并解決好在純化和培養(yǎng)過(guò)程中減少外源性污染這一安全性問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種制備腫瘤特異性抗原致敏DC的方法，該方法結(jié)合密度梯度離心和利用DC具高粘附性特點(diǎn)，應(yīng)用貼壁的方法分離純化并富集外周血中DC，用于后續(xù)的DC培養(yǎng)，并用患者自身腫瘤制備的特異性抗原致敏活化DC，在體外高效、安全地制備抗原致敏DC的方法。該方法克服了傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，使DC治療的安全性得到保障，用該方法制備抗原致敏DC具有操作方便，腫瘤抗原易于獲取和制備，經(jīng)腫瘤患者自身抗原致敏的DC特異性強(qiáng)、可激發(fā)抗腫瘤CTL有效的抗腫瘤免疫的優(yōu)點(diǎn)，有利于DC在臨床推廣應(yīng)用，用于各類腫瘤的治療。本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的I、患者腫瘤抗原的制備I)取手術(shù)切除的無(wú)菌腫瘤組織，用質(zhì)量百分比濃度為O. 05%醋酸洗必泰溶液(溶液能將腫瘤組織完全淹沒(méi)即可)浸泡20-40分鐘；2)無(wú)菌生理鹽水沖洗2-4遍；3)用無(wú)菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，按每克腫瘤組織添加10_15ml的RPMI-1640培養(yǎng)液的比例添加培養(yǎng)液，研磨，經(jīng)200目鋼網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞，收集單細(xì)胞懸液于Falcon離心
管中；4)用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為O. 5-2. 5X IO7個(gè)/ml，細(xì)胞懸液經(jīng)42°C水浴加熱1-1. 5小時(shí)后，60°C水浴繼續(xù)加熱1-1. 5小時(shí)后，液氮速凍5_15分鐘，取出室溫融化，重復(fù)以上步驟4-6次；5)300-500g離心15_25分鐘后收集上清后，上清經(jīng)O. 22 μ孔徑的無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，即得該腫瘤抗原；6)用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，用該方法制備的腫瘤抗原，蛋白濃度可達(dá)500-2000ug/ml。2、人外周血樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)I)人外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集臨床明確診斷為惡性腫瘤，且外周血白細(xì)胞在正常范圍，不經(jīng)藥物動(dòng)員即可經(jīng)臨床血細(xì)胞分離機(jī)上用淋巴細(xì)胞采集程序采集患者單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral bloodmononuclear cell, PBMC)，采集50_100ml的單個(gè)核細(xì)胞自體血漿懸液，細(xì)胞總數(shù)為I. 0-5. O X 109，用于樹(shù)突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)；
2)用淋巴細(xì)胞分離液分離去除殘留紅細(xì)胞和粒細(xì)胞將收集得到的單個(gè)核細(xì)胞血漿懸液(50_100ml)緩慢加入數(shù)個(gè)預(yù)加淋巴細(xì)胞分離液的Falcon離心管(細(xì)胞懸液體積與淋巴細(xì)胞分離液體積相等)，離心管經(jīng)嚴(yán)格配平后 300-500g室溫離心20-40分鐘；3)離心后用平口巴氏滴管吸取界面層的單個(gè)核細(xì)胞，加入到RPMI-1640培養(yǎng)基中，150-250g離心5-15分鐘，洗滌2-5遍，收取細(xì)胞；4)將經(jīng)離心洗滌的單個(gè)核細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2. 0-6. OX IO6個(gè)/ml，將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入若干培養(yǎng)瓶中；5)將盛有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置37°C、5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁2_4小時(shí)；6)將培養(yǎng)瓶取出，水平方向輕輕搖晃培養(yǎng)瓶5-10次后，使非貼壁細(xì)胞懸起，棄去含非貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，再緩慢往瓶中加入10_20ml RPMI-1640培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)洗去殘留非貼壁細(xì)胞，此時(shí)，仍保留在培養(yǎng)瓶中的即為貼壁的DC ；7)往保留貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入含10% (體積百分比，V/V)胎牛血清、30_100ng/ml重組人粒細(xì)胞巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor, GM-CSF)、和 5_25ng/ml 重組人白細(xì)胞介*-4(interleukin-4, IL-4)的 RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置 37°C、5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱
中繼續(xù)培養(yǎng)；8)培養(yǎng)至第3-4天往培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充新鮮的含10% (體積百分比，V/V)胎牛血清、30-100ng/mlrhGM-CSF、5-25ng/ml rhIL-4 的 RPMI-1640 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；9)培養(yǎng)過(guò)程中每天觀察細(xì)胞形態(tài)1-3次，在培養(yǎng)的第5-7天，可見(jiàn)細(xì)胞變?yōu)槊虪?，并聚集成團(tuán)；10)終止培養(yǎng)在培養(yǎng)第7-14天，用10_20ml吸管輕輕吹打貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來(lái)，將培養(yǎng)液吸入50ml離心管，100-300g離心5_15分鐘，收取細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)活化后得到的DC數(shù)占起始細(xì)胞(即PBMC)數(shù)的比例為6. 0-22. 5% (見(jiàn)表I)。表I :經(jīng)培養(yǎng)活化后得到的DC數(shù)占PBMC的百分比
權(quán)利要求
1.一種制備腫瘤特異性抗原致敏DC的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行(1)患者腫瘤抗原的制備取無(wú)菌腫瘤組織，完全浸沒(méi)于質(zhì)量百分比濃度為O.05%的醋酸洗必泰溶液中，浸泡20-40分鐘后，無(wú)菌生理鹽水沖洗2-4次后，剪碎，按每克腫瘤組織添加10-15ml的RPMI-1640培養(yǎng)液的比例在腫瘤組織中添加培養(yǎng)液，研磨，過(guò)濾單細(xì)胞，收集單細(xì)胞懸液；(2)用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度為O.5-2. 5X IO7個(gè)/ml，細(xì)胞懸液經(jīng)42°C水浴加熱1-1. 5小時(shí)后，60°C水浴繼續(xù)加熱1-1. 5小時(shí)后，液氮速凍5-15分鐘，取出后于室溫融化，重復(fù)以上步驟4-6次后，300-500g離心15-25分鐘，收集上清，上清經(jīng)無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌后，即得腫瘤抗原，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；(3)在血細(xì)胞分離機(jī)上采集腫瘤患者單個(gè)核細(xì)胞血漿懸液50-100ml，懸液中細(xì)胞總數(shù)為I. 0-5. OX IO9個(gè)，將收集到的單個(gè)核細(xì)胞血漿懸液加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液中300-500g離心20-40分鐘，然后吸取界面層的單個(gè)核細(xì)胞，加入到RPMI-1640培養(yǎng)基中，150-250g離心5-15分鐘，重復(fù)離心洗滌2_5遍，收集單個(gè)核細(xì)胞；(4)將經(jīng)離心洗滌的單個(gè)核細(xì)胞懸浮于含體積百分比10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2. 0-6. OX IO6個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，于37°C、5%CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2-4小時(shí)后，取出培養(yǎng)瓶，水平方向輕輕搖晃培養(yǎng)瓶5-10次后，棄去含非貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，再次緩緩加入RPMI-1640培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)洗去殘留非貼壁細(xì)胞；(5)往保留有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入含體積百分比10%胎牛血清、30-100ng/ml的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和5-25ng/ml重組人白細(xì)胞介素_4的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3-4天，補(bǔ)充新鮮的含體積百分比10%胎牛血清、30-100ng/ml的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和5-25ng/ml重組人白細(xì)胞介素_4的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)到第7_14天終止培養(yǎng)，用吸管輕輕吹打貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來(lái)，收集培養(yǎng)液于離心管中，100-300g離心5-15min，收集細(xì)胞，即得到未致敏的DC ；(6)將未致敏的DC重懸于含體積百分比10%胎牛血清、終濃度為30-100ng/ml的rhGM-CSF、終濃度為5-25ng/ml的rhIL_4的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.0-3. OX IO6個(gè)/ml，加入步驟(I)中制備所得的腫瘤抗原至終濃度20_100ug/ml，置于37°C、5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-24小時(shí)，用吸管吹打培養(yǎng)瓶使特異性抗體致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞懸起，收集細(xì)胞懸液于離心管中，100-300g離心5-15min，收集細(xì)胞，然后用無(wú)菌生理鹽水重懸細(xì)胞，100-300g離心5-15min，重復(fù)該步驟2_5次，收集細(xì)胞，即得到特異性腫瘤抗原致敏的DC。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備腫瘤特異性抗原致敏DC的方法，其特征在于制備抗原時(shí)采用200目網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞，采用O. 22 μ孔徑的無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備腫瘤特異性抗原致敏DC的方法，該方法利用DC具有的高粘附性，并結(jié)合密度梯度離心的方法分離純化外周血中DC的方法，用于后續(xù)的DC培養(yǎng)，并用患者腫瘤制備的特異性抗原致敏活化DC，本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點(diǎn)操作方便，腫瘤抗原易于獲取和制備，并且經(jīng)腫瘤患者自身抗原致敏的DC特異性強(qiáng)、可激發(fā)抗腫瘤CTL有效的抗腫瘤免疫，并減小了感染其它外源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，有利于在臨床推廣應(yīng)用，用于各類腫瘤的治療。
文檔編號(hào)C12N5/0784GK102925412SQ20121046441
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者嚴(yán)新民, 董虹, 唐慧 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院