蚯蚓生物復(fù)合酵素的制作方法
【專利摘要】蚯蚓生物復(fù)合酵素，取一定量的活蚯蚓，用超聲波清洗機(jī)清洗，盡最大可能使其內(nèi)臟中的污物排出，然后撈出濾去多余水分，稱重。取900公斤蚯蚓加入生物反應(yīng)器，然后加入酵素菌50公斤，生物助劑50公斤，攪拌均勻，好氧發(fā)酵48小時，將濾出液進(jìn)行超濾，濃縮有效成份，進(jìn)入真空冷凍干燥機(jī)，在升華溫度不高于30℃條件下，干燥約4-10小時即成干粉，粉碎后鋁塑膜密封包裝，置于冰箱中保存。
【專利說明】蚯蚓生物復(fù)合酵素
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于食品及生物制藥領(lǐng)域。
技術(shù)背景: [0002]現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明蚯蚓有清熱、鎮(zhèn)定、抗驚厥、平喘、抗組胺、降血壓、溶栓、抗癌的功效。蚯蚓蛋白質(zhì)含量很高，約占鮮蚯蚓的8 %~10 %，干重的56 %~66 %，氨基酸以谷氨酸、賴氨酸、精氨酸的含量居多。蚯蚓凍干粉和體腔內(nèi)液脂肪酸含量分析表明，不飽和脂肪酸含量高，飽和脂肪酸含量低。特別是具有抗癌、降血壓、防止動脈硬化、養(yǎng)顏等作用的亞油酸含量更高，而十三羧酸明顯不同于別的動物，這些符合當(dāng)前人類健康食品結(jié)構(gòu)的要求。
[0003]蚯蚓富含核酸、VA、Vc, VE等功能因子，F(xiàn)e、Mn、Cu、Zn、Se等微量元素豐富，它們與其他中藥材中有機(jī)物絡(luò)合發(fā)揮更大藥理功效，其中Se還能促進(jìn)細(xì)胞免疫作用。此外，蚯蚓尚含蟲丘蝴素(Iumbritn)、蟲丘蝴堿(Iumbrofobrim)、蟲丘蝴毒素(terrestrolumbrolysin)以及嘌呤、膽堿、膽甾醇等主要特殊活性物質(zhì)。然而，目前研究得最多的是蚯蚓的幾種酶(系)。
[0004]一、蚯蚓酶系及生理功能
[0005]1、纖溶酶(fibrinolytic enzyme)
[0006]蚯蚓作為活血化淤的藥材已有幾千年歷史。新鮮蚯蚓體內(nèi)含的纖溶酶即屬于其中一組具強(qiáng)烈溶解纖維蛋白及血栓作用的絲氨酸蛋白酶，可從不同種屬的蚯蚓分離得到。
[0007]2、蝴激酶(Iumbrinonase)
[0008]蚓激酶是從蚯蚓中提取的一種絲氨酸蛋白酶，具有典型的胰凝乳蛋白酶類絲氨酸蛋白酶的多肽鏈折疊形式，與纖維蛋白原有特異的親和力，且具有纖溶活力。蚓激酶能明顯降解纖維蛋白原，降低血小板聚集率及血液粘度。現(xiàn)已有很多研究證明蚓激酶在體外具有強(qiáng)的纖溶活性，從而使其可能成為一種很有應(yīng)用前景的溶栓制劑。
[0009]3、抗腫瘤蛋白
[0010]謝江碧等以赤子愛勝蚓為原料，分離得到一組抗腫瘤活性蛋白成分(簡稱蚯蚓抽提物)。祖殉等選取赤子愛勝蚓為原料，研究了通過各種方法分離出的樣品對于腫瘤細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明分離純化后某一蛋白組分可有效抑制BEL-7402細(xì)胞(人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系)、HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞系)的生長。
[0011]4、溶血素
[0012]從蚯蚓體腔液中可以分離到具有溶血活性的蛋白質(zhì)，其中個別蛋白質(zhì)為雙功能蛋白質(zhì)，具有溶解和凝集紅細(xì)胞的活性。
[0013]5、消化酶
[0014]蚯蚓在有機(jī)殘體轉(zhuǎn)化和土壤養(yǎng)分循環(huán)中起著重要的作用，為明確不同生態(tài)類型蚯蚓的食性及其消化有機(jī)物質(zhì)的能力，張寶貴等測定了表居型蚯蚓赤愛勝蚓(Eiseniafetida)和上食下居型蟲丘蝴威廉環(huán)毛蝴(Pheretima guillemi)腸道內(nèi)纖維素酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性；同時還對威廉環(huán)毛蚓排泄物中蛋白酶、磷酸酶以及C02呼吸強(qiáng)度與原土進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，赤愛勝蚓腸道內(nèi)纖維素酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于威廉環(huán)毛蚓，而蛋白酶和酸性及堿性磷酸酶活性顯著低于威廉環(huán)毛蚓；兩種蚯蚓腸道消化酶活化的差異與赤愛勝蚓直接以植物殘體為食，而威廉環(huán)毛蚓以半分解的有機(jī)殘體上的微生物為食有關(guān)。而且得出不同種類的蚯蚓生活習(xí)性不同，食性不同，體內(nèi)成分也存在差異。
[0015]6、抗菌肽
[0016]張希春等采用硫酸銨沉淀，超濾，陽離子交換分離和反相快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)分析，得到了兩種新的蚯蚓抗菌肽F-1與F-2，經(jīng)電噴霧離子源質(zhì)譜(ES1-MS)測定，其相對分子質(zhì)量為535.27和519.27，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)數(shù)據(jù)表明F-1的肽序列為 190Ac-Ala-Met-Val-Ser-Se;r, F-2 的妝序為 Ac-Ala-Met-Val-Gly-Thr,最小抑菌濃度(MIC)實驗表明，F(xiàn)-1與F-2對鵓雞腸球菌Ginterococcus gallinarum)、綠膿桿菌(Pseudomonas pyocyanea)、鮑氏不動桿(Acinetobacterbaumanii)、土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)的最小抑菌濃度分別為11.4mg/L和12.85mg/L,對幾腸球菌(Enterococcus faecalis)的最小抑菌濃度分別為22.8mg/L和25.68mg/L,對真菌白色鏈株菌(Candidaalbicans)沒有表現(xiàn)為完全的抑制作用。
[0017]7、鈣結(jié)合蛋白
[0018]張燕紅等以赤子愛勝蚓為材料，通過DEAE-FastFlow離子交換層析、CaM-Sepharose親和層析,分離純化得到Φ丘蝴鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(CaMBPs)。王采療等以赤子愛勝蚓為材料分離純化了鈣調(diào)素，并得到一種新的鈣結(jié)合蛋白。王立波等應(yīng)用紅外光譜技術(shù)定量測定了水化膜中蚯蚓新鈣結(jié)合蛋白(NCBP)的二級結(jié)構(gòu)及在不同比例Ca2+、Tb3+離子的作用下其二級結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，NCBP中a-helix含量較低而β-sheet的含量較高，且隨不同比例全局離子的加入，1629cm_l處β-sheet峰的變化較明顯。同時發(fā)現(xiàn)，NCBP具有鈣結(jié)合蛋白家族特征的SDS-PAGE現(xiàn)象，但不具有激活PDE靶酶的活性，初步認(rèn)為，NCBP含有與Ca2+濃度相關(guān)的特殊的結(jié)構(gòu)和功能。另外，高濃度下Tb3+的結(jié)合引發(fā)NCBP的分子間聚合。提示對稀土元素的使用要慎重。
`[0019]8、過氧化氫酶
[0020]徐煒虹等以赤子愛勝蚓(Eisenia foetida)組織勻漿經(jīng)硫酸胺鹽析、透析濃縮后，用大柱制備和電泳純化得到兩個過氧化氫酶，均為糖蛋白，分子量分別為39kD和40kD，KCN及Cu2+、Cd2+、Zn2+、Ni2+等金屬離子均抑制酶的活性，Pb2+、Fe2+則有激活作用。在直隸環(huán)毛蟲引(Pheretima tschiliensis)體內(nèi)實驗中，Zn2+顯著提高過氧化氫酶的總活力，Cd2+、Ν?2+先是降低，隨后提高酶總活力。
[0021]9、膽堿酯酶
[0022]丁詩華等對赤子愛勝蚓的TritonX-1OO抽提液經(jīng)PEG2000-磷酸鉀緩沖液處理、離子交換層析及凝膠過濾后，獲得電泳純的膽堿酯酶，該酶經(jīng)鑒定為糖蛋白，凝膠過濾法和SDS-PAGE法測得其Mt分別為59000和58000，酸性氨基酸含量約占24%，堿性氨基酸含量約占12%，最大紫外吸收λ = 272nm;酶作用最適溫度T = 39°C，熱穩(wěn)定性較差；最適pH為7.8，在pH7.0-8.0酶較穩(wěn)定，對碘化硫乙酰膽堿的Ka值為88 μ mol/L,有過量底物抑制現(xiàn)象.Mg2+、Ca2+和Mn2+對酶活性的影響較小。DEP則對該酶有強(qiáng)烈抑制作用。
[0023]10、蚯蚓素
[0024]陳可夫等通過實驗表明，蚯蚓素9203對小鼠無鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用；對大鼠原位腸無抑制作用，對大鼠心電、血壓、呼吸頻率和呼吸深度均無明顯影響。個別大鼠出現(xiàn)異常情況，可能與蚯蚓素9203不純有關(guān)；對豚鼠離體回腸有一定抑制作用，以后在臨床應(yīng)用中有可能產(chǎn)生便秘的副作用，提醒臨床醫(yī)生給予密切關(guān)注。總的看來，蚯蚓素9203作為溶栓新藥很有研究如景。
[0025]二、蚯蚓酶目前常用的提取工藝
[0026]1、過去常用的提取工藝
[0027]通常蚯蚓酶的提取方法是鹽析，繼而用多種層析及HPLC、FPLC乃至親和層析、或離子交換、分子篩、凝膠電泳等手段從不同品系的蚯蚓中獲得多種蚯蚓酶的單純組分，但操作麻煩，流程長，且酶活力損失很大，又不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0028]2、近期新的提取工藝
[0029]新提取方法一:
[0030]提取工藝描述:取一定量的活蚯蚓，水洗數(shù)次，盡最大可能使其內(nèi)臟中的污物排出，然后撈出用濾紙盡量吸其多余水分，稱重，加2倍體積的緩沖液于勻漿器中勻漿5分鐘，在4°C冰箱中靜置4小時后，高速離心，棄去沉淀，取上清液加固體硫酸銨達(dá)一定飽和度，以4000r/min,離心IOmin,收集上清液再加入固體硫酸銨達(dá)較高的飽和度,靜置過夜,高速離心，收集沉淀，然后用緩沖液溶解此沉淀物，用透析袋透析去鹽或用超濾方法濃縮后，用冷凍干燥機(jī)凍干。此時為淡棕色粉末狀物質(zhì)，是酶的粗制品。
[0031]新提取萬法二:
[0032]提取工藝描述:選用純正赤子愛勝(大平二號)成蚓，篩除漂洗各種雜質(zhì)，并浙干污水。洗凈的蚯蚓加入一定濃度鹽水，在組織勻漿器中高速勻漿5分鐘后，低溫靜置鹽析沉淀，經(jīng)鹽析后高速離心，收集上清液。沉淀用鹽溶液洗滌兩次，再離心，收集上清液，合并上清液，進(jìn)行第一次超濾，以濾除不溶于水的大分子。將濾出液再次超濾，濃縮有效成份。當(dāng)濃縮液達(dá)5% -10%濃度后，進(jìn)入真空冷凍干燥機(jī)，在升華溫度不高于30°C條件下，干燥約5-20小時即成干粉，粉碎后鋁塑膜密封包裝，置于冰箱中保存。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0033]蚯蚓生物復(fù)合酵素是利用生物技術(shù)提取的蚯蚓全部酵素。
[0034]一.主要設(shè)備:
[0035]超聲波清洗機(jī)，蚯蚓生物反應(yīng)器，超濾設(shè)備，真空冷凍干燥機(jī)
[0036]二，工藝流程
[0037]酵素菌+助劑
[0038]活蚯蚓超聲波清洗機(jī)清洗蚯蚓生物反應(yīng)器濾出液超濾設(shè)備真空冷凍干燥機(jī)粉碎包裝
[0039]三，生產(chǎn)描述:
[0040]取一定量的活蚯蚓，用超聲波清洗機(jī)清洗，盡最大可能使其內(nèi)臟中的污物排出，然后撈出濾去多余水分，稱重。取900公斤蚯蚓加入生物反應(yīng)器，然后加入酵素菌50公斤，生物助劑50公斤，攪拌均勻，好氧發(fā)酵48小時，將濾出液進(jìn)行超濾，濃縮有效成份。進(jìn)入真空冷凍干燥機(jī)，在升華溫度不高于30°C條件下，干燥約4-10小時即成干粉，粉碎后鋁塑膜密封包裝，置于冰箱中保存。
[0041]四，產(chǎn)品及工藝特點[0042]1，使用酵素菌生物技術(shù)，加速蚯蚓溶解，酵素產(chǎn)量大幅提升。
[0043]2，工藝設(shè)備簡單。
[0044]3，不使用硫酸銨，鹽等化學(xué)助劑
[0045]4，除清洗外， 不用水，使?jié)饪s干燥更容易。
【權(quán)利要求】
1.蚯蚓生物復(fù)合酵素是利用生物技術(shù)提取的蚯蚓全部酵素。 取900公斤蚯蚓加入生物反應(yīng)器，然后加入酵素菌50公斤，生物助劑50公斤，攪拌均勻，好氧發(fā)酵48小時。
【文檔編號】C12N9/00GK103740657SQ201210393076
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月17日
【發(fā)明者】李大治 申請人:沈陽尊龍生物技術(shù)有限公司