專利名稱：一種利用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)甘草多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)方法，具體的說涉及一種甘草細胞培養(yǎng)生產(chǎn)甘草多糖的方法。
背景技術(shù)：
甘草作為一種傳統(tǒng)中藥，自古以來就有“十方九草”的美譽，甘草多糖是甘草中三大主要活性成分之一。甘草作為我國常用的大宗藥材，國家二級保護植物；是國家專控藥材，甘草中有效成分，生物活性強，應用廣，價格高，市場需求日益強勁，而野生甘草種子出芽率低，加上掠奪性開采；供求矛盾日益嚴重；沙漠嚴重，利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)甘草活性成分具有廣闊的發(fā)展前景。自本世紀初，利用植物細胞，組織和器官培養(yǎng)的方法生產(chǎn)藥用活性物質(zhì)的研究取得了驚人的進展，已有近1000種植物進行過細胞培養(yǎng)方面的研究，據(jù)估計，已經(jīng)從400多種植物中建立了組織和細胞培養(yǎng)物，并從中分離出600多種代謝產(chǎn)物， 甘草懸浮細胞生產(chǎn)出的甘草多糖含量高于野生甘草，具有明顯的抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、 免疫調(diào)節(jié)活性，具有很強的免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞的作用，具有廣闊的開發(fā)前景。甘草細胞懸浮培養(yǎng)，利用本實驗室自行研發(fā)的一種適合細胞懸浮培養(yǎng)的生物反應器，中國專利申請?zhí)?201110255311. 9發(fā)明名稱一種植物組織培養(yǎng)用鼓泡式生物反應器。同時經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利申請?zhí)?00810040456. 5，發(fā)明名稱為利用組織培養(yǎng)生產(chǎn)大豆異黃酮的方法的專利中公開了一種利用大豆愈傷組織生產(chǎn)大豆異黃酮的方法，該方法的成功為組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)目的產(chǎn)物提供一種可能。目前甘草資源缺乏，通過細胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)甘草多糖具有廣闊前景，并還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了一種甘草細胞培養(yǎng)生產(chǎn)甘草多糖的方法， 解決目前甘草資源缺乏的問題。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種利用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)甘草多糖的方法，包括如下步驟(1)培養(yǎng)誘導甘草無菌苗取成熟的甘草種子，用消毒液消毒滅菌，然后將無菌種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)得到甘草無菌苗；(2)利用無菌苗頸段誘導愈傷組織切取上一步得到的無菌苗頸段，接到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，每觀天繼代培養(yǎng)1次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次得到穩(wěn)定的愈傷組織；(3)甘草懸浮細胞的誘導挑選形狀松散、顏色淺的愈傷組織誘導懸浮細胞，經(jīng)挑選，繼代培養(yǎng)得到穩(wěn)定高產(chǎn)的細胞系；(4)甘草懸浮細胞鼓泡式反應器的培養(yǎng)挑選穩(wěn)定高產(chǎn)的細胞系，利用自行研發(fā)設計的鼓泡式生物反應器培養(yǎng)，得到成熟的甘草細胞；(5)甘草多糖的提取用水提醇沉法提取步驟(4)所得甘草多糖，用sevage去蛋白，得到甘草多糖。
所述步驟(1)甘草無菌苗的誘導方法為挑選顆粒飽滿，呈深綠色的甘草種子， 用5% 15%的次氯酸鈉在磁力攪拌器上對種子進行攪拌滅菌，轉(zhuǎn)速為200r/min 500r/ min，溫度為20°C 30°C，滅菌時間20min 40min，MS培養(yǎng)中含2% 蔗糖，滅菌前pH 5 6，接種在含MS固體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，放在20 光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)30 35 天，得到甘草無菌苗。所述步驟O)甘草愈傷組織是從甘草無菌苗下胚軸誘導得來，經(jīng)多次篩選繼代后，生長狀態(tài)穩(wěn)定；愈傷組織繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，附加2，4-D(0. 5 2mg · Γ1)， NAA (0. 5 2mg · L"1), 6-BA (0. 1 0. 3mg · L—1)，2 5%蔗糖，滅菌前 pH 5 6，繼代周期 25 30天。所述步驟(3)甘草懸浮細胞培養(yǎng)基成分為3/4MS培養(yǎng)基，附加2，4_D(0.5 2mg · Γ1)，NAA (0. 5 2mg · Γ1)，6-BA (0. 1 0. 3mg · Γ1)，2 5 % 蔗糖，初次培養(yǎng) 3 5 天后，將懸浮的大塊愈傷組織過濾除去，懸浮細胞每隔15 20天繼代一次；搖床轉(zhuǎn)速110 120r · mirT1，培養(yǎng)溫度(20 28) V ；經(jīng)過數(shù)次傳代篩選，最終獲得性能優(yōu)異的細胞系。所述步驟(4)甘草懸浮細胞鼓泡式反應器培養(yǎng)是指利用自行設計的5L鼓泡式反應器，接種量為5 % 10 %的鮮重甘草細胞，發(fā)酵罐通氣量為200L/min 500L/min，培養(yǎng)基成分為 3/4MS 培養(yǎng)基，附加 2，4-D(0. 5 2mg · L—1)，NAA(0. 5 2mg · L—1)，6_ΒΑ(0· 1 0. 3mg · L—1)，2 5%蔗糖，PH值為5 9，培養(yǎng)周期為15 20天。所述步驟( 甘草多糖的提取是指取甘草細胞粉末，加入15 25倍重量的蒸餾水，靜置5 12h，水浴1 5次，每次1 池，重復水浴2 5次，合并濾液，濃縮到一定體積，以無水乙醇調(diào)制終濃度為50 90%，0 6°C靜置過夜，去上清液，用sevage法去蛋白， 干燥，粉碎，得到甘草多糖粉末。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的生產(chǎn)方法利用甘草愈傷組織，誘導產(chǎn)生甘草懸浮細胞，在鼓泡式發(fā)酵罐中生產(chǎn)甘草多糖，懸浮細胞生產(chǎn)出的甘草多糖含量高于野生甘草，具有明顯的抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性，具有很強的免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞的作用，這種方法不受季節(jié)及地域的限制，方便，易操作，具有廣闊的開發(fā)前景。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。第一步，甘草無菌苗的獲得挑選顆粒飽滿，呈深綠色的甘草種子，用10%的次氯酸鈉在磁力攪拌器上對種子進行攪拌滅菌，轉(zhuǎn)速為300r/min，溫度為25°C，滅菌時間 30min，MS培養(yǎng)中含3%蔗糖，滅菌前pH 5. 9，接種在含MS固體培養(yǎng)基50ml的三角瓶內(nèi)，放在25°C光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)30天，得到甘草無菌苗。第二步，甘草愈傷組織的獲得甘草愈傷組織是從甘草無菌苗下胚軸誘導得來，經(jīng)多次篩選繼代后，生長狀態(tài)穩(wěn)定。愈傷組織繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，附加2，4-D (lmg O， NAAdmg · L—1)，6-BA(0. 2mg · L—1)，3%蔗糖，滅菌前 pH 5. 9，繼代周期 28 天。第三步，甘草懸浮細胞的獲得選擇生長速度快、質(zhì)地松散、淡黃色的甘草愈傷組織，用鑷子夾碎后轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)及成分為3/4MS培養(yǎng)基，附加2， 4-D(lmg · L-1)，NAAdmg · L—1)，6_BA(0. 2mg · L—1)，3%蔗糖，初次培養(yǎng) 3 天后，將懸浮的大塊愈傷組織過濾除去，懸浮細胞每隔18天繼代一次。搖床轉(zhuǎn)速110 120r ^mirT1,培養(yǎng)溫度(20 28) °C。經(jīng)過數(shù)次傳代篩選，最終獲得性能優(yōu)異的細胞系。第四步，甘草懸浮細胞鼓泡式反應器培養(yǎng)利用自行設計的5L鼓泡式反應器，接種量為8 %的鮮重甘草細胞，發(fā)酵罐通氣量為300L//min，培養(yǎng)及成分為3/4MS培養(yǎng)基，附加 2，4-D(lmg · L-1)，NAA (Img · 1^),61(0. 2mg · 1^)，3%蔗糖，PH 值為 5. 9，培養(yǎng)周期為 18天。第五步，甘草多糖的提取取甘草細胞粉末，加入20倍重量的蒸餾水，靜置12h，沸水浴提取，提取時間lh。重復水浴提取3次，合并濾液，濃縮到一定體積，以無水乙醇調(diào)制終濃度為75 %，4°C靜置過夜，去上清液，用sevage法去蛋白，干燥，粉碎得到甘草多糖粉末。經(jīng)過本發(fā)明方法誘導出的高產(chǎn)細胞系結(jié)合生物反應器的培養(yǎng)，使得甘草細胞干重增值倍數(shù)達到11倍，甘草多糖含量達到10%。本發(fā)明的方法工藝簡單，為生產(chǎn)甘草多糖提供一種新的途徑，此方法是中藥生物工程的一種，不受季節(jié)和地域的限制。
權(quán)利要求
1.一種利用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)甘草多糖的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)培養(yǎng)誘導甘草無菌苗取成熟的甘草種子，用消毒液消毒滅菌，然后將無菌種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)得到甘草無菌苗；(2)利用無菌苗頸段誘導愈傷組織切取上一步得到的無菌苗頸段，接到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，每觀天繼代培養(yǎng)1次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次得到穩(wěn)定的愈傷組織；(3)甘草懸浮細胞的誘導挑選形狀松散、顏色淺的愈傷組織誘導懸浮細胞，經(jīng)挑選， 繼代培養(yǎng)得到穩(wěn)定高產(chǎn)的細胞系；(4)甘草懸浮細胞鼓泡式反應器的培養(yǎng)挑選穩(wěn)定高產(chǎn)的細胞系，利用自行研發(fā)設計的鼓泡式生物反應器培養(yǎng)，得到成熟的甘草細胞；(5)甘草多糖的提取用水提醇沉法提取步驟(4)所得甘草多糖，用sevage去蛋白，得到甘草多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)甘草多糖的方法，其特征在于，所述步驟(1)甘草無菌苗的誘導方法為挑選顆粒飽滿，呈深綠色的甘草種子，用5% 15%的次氯酸鈉在磁力攪拌器上對種子進行攪拌滅菌，轉(zhuǎn)速為200r/min 500r/min，溫度為20°C 30°C，滅菌時間 20min 40min，MS培養(yǎng)中含2% 蔗糖，滅菌前pH 5 6，接種在含MS固體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，放在20 光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)30 35天，得到甘草無菌苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)甘草多糖的方法，其特征在于，所述步驟( 甘草愈傷組織是從甘草無菌苗下胚軸誘導得來，經(jīng)多次篩選繼代后，生長狀態(tài)穩(wěn)定；愈傷組織繼代培養(yǎng)基為 MS 培養(yǎng)基，附加 2，4-D(0. 5 2mg .廠1)，ΝΑΑ(0· 5 2mg .171)，6_BA(0. 1 0. 3mg .171)， 2 5%蔗糖，滅菌前pH 5 6，繼代周期25 30天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)甘草多糖的方法，其特征在于，所述步驟C3)甘草懸浮細胞培養(yǎng)基成分為 3/4MS 培養(yǎng)基，附加 2，4-D (0. 5 2mg .L—1)，NAA (0. 5 2mg .L—1)，6-BA (0. 1 0. 3mg · L—1)，2 5%蔗糖，初次培養(yǎng)3 5天后，將懸浮的大塊愈傷組織過濾除去，懸浮細胞每隔15 20天繼代一次；搖床轉(zhuǎn)速110 120r · mirT1，培養(yǎng)溫度QO 28) V ；經(jīng)過數(shù)次傳代篩選，最終獲得性能優(yōu)異的細胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)甘草多糖的方法，其特征在于，所述步驟(4)甘草懸浮細胞鼓泡式反應器培養(yǎng)是指利用自行設計的5L鼓泡式反應器，接種量為5% 10%的鮮重甘草細胞，發(fā)酵罐通氣量為200L/min 500L/min，培養(yǎng)基成分為3/4MS培養(yǎng)基，附加2， 4-D (0. 5 2mg · L-1)，NAA(0. 5 2mg · L-1)，6_BA(0. 1 0. 3mg · L-1)，2 5%蔗糖，PH 值為5 9，培養(yǎng)周期為15 20天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述生產(chǎn)甘草多糖的方法，其特征在于，所述步驟(5)甘草多糖的提取是指取甘草細胞粉末，加入15 25倍重量的蒸餾水，靜置5 12h，水浴1 5次，每次1 池，重復水浴2 5次，合并濾液，濃縮到一定體積，以無水乙醇調(diào)制終濃度為50 90%，0 6°C靜置過夜，去上清液，用sevage法去蛋白，干燥，粉碎，得到甘草多糖粉末。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)甘草多糖的方法，包括如下步驟(1)培養(yǎng)誘導甘草無菌苗；(2)從甘草無菌苗下胚軸誘導甘草愈傷組織；(3)選擇生長速度快、質(zhì)地松散、淡黃色的甘草愈傷組織，用鑷子夾碎后轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，獲得甘草懸浮細胞；(4)鼓泡式反應器培養(yǎng)甘草懸浮細胞；(5)從步驟(4)所得甘草懸浮細胞中提取甘草多糖得甘草多糖粉末。本發(fā)明的懸浮細胞生產(chǎn)出的甘草多糖含量高于野生甘草，具有明顯的抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性，具有很強的免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞的作用，這種方法不受季節(jié)及地域的限制，方便，易操作，具有廣闊的開發(fā)前景。
文檔編號C12N5/04GK102532337SQ20111045122
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者劉輝, 呂連媛, 滿淑麗, 王娟, 董艷艷, 郭松波, 高文遠 申請人:天津大學