專利名稱：細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種新式細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞于近幾年來成為組織工程的首要研究之一，其可分化為多種組織細(xì)胞以應(yīng)用于再生醫(yī)療，如骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞及胰島細(xì)胞等，但臨床及組織應(yīng)用最大的瓶頸是無法在體外快速培養(yǎng)至治療所需的數(shù)量，以致難以普遍實際應(yīng)用于醫(yī)療上。目前許多研究胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)普遍被應(yīng)用作為細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑。胎牛血清是一種源自未出生胎牛血液通過離心程序去除紅血球后所得的血清，一般添加5 20%的胎牛血清于培養(yǎng)基中以促進細(xì)胞的增生。使用胎牛血清作為培養(yǎng)基補充齊U，一直是受到爭議的問題，其生產(chǎn)與使用始終伴隨著倫理及科學(xué)的爭議。通常胎牛血清的收集部分是一導(dǎo)管插入臍帶收集血液，另一方法則是利用12到16針規(guī)(gauge)的針頭直接插入胎牛的心臟并抽取血液，兩種方式皆可能造成胎牛的痛苦。目前全球每年胎牛血清的生產(chǎn)量約為50萬升，而每頭胎牛僅能取得約O. 5升的血清，推算可得知每年約有百萬頭胎牛因此而犧牲，而此胎牛血清的制造一直被動物保護人士所詬病。而在科學(xué)上，血清含豐富的蛋白質(zhì)、生長因子、激素、營養(yǎng)素與代謝物、脂質(zhì)、礦物質(zhì)與抑制物，其組成復(fù)雜且具有存在污染物的可能性，常對研究質(zhì)量造成影響。在臺灣，一頭達上市體重的肉豬約可取得2. 5升的血液，則臺灣一年應(yīng)可收集約2200 萬升的豬血液(農(nóng)委會網(wǎng)站 http: //www. coa. gov. tw/show_index. php, 2009 畜牧統(tǒng)計)。目前臺灣境內(nèi)收集豬血液后的利用主要加工成為食品或經(jīng)噴霧干燥后制成飼料用血粉，同時豬的生理組成及構(gòu)造與人類相似，可將其血液作為利用。而血液制劑(bloodproduct,BP)則是一種經(jīng)處理的血小板濃縮血衆(zhòng),其較全血高出約8倍的血小板濃度,其中每個血小板約含有50 80個α顆粒(a-granules),血小板在正常生理凝血反應(yīng)下,會聚集于受傷組織并刺激α顆粒釋放生長因子使傷口愈合，其α顆粒經(jīng)活化后可釋放多種生長因子，如胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)、角質(zhì)化細(xì)胞生長因子(keratinocyte growth factor, KGF)、血小板來源生長因子(platelet-derived growth,F1DGF)及轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor, TGF-β )等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明自豬血液開發(fā)一種合適于細(xì)胞培養(yǎng)用的新式營養(yǎng)添加劑，自豬血液以不同離心方式濃縮制成豬血液制劑(porcine blood product,P_BP),加入不同活化劑組合配方活化血小板以釋放生長因子。經(jīng)定量分析后以Design-Expert軟件設(shè)計最佳的活化劑配方，并檢測重金屬及纖維連接素含量。配制成培養(yǎng)基與胎牛血清及市售無血清培養(yǎng)基，以比較對人類干細(xì)胞粘附率、增生率及存活率的影響。本發(fā)明中設(shè)計Co (+) T (+) Ca (-) ,Co (+)T(-)Ca(-)&Co(-)T(+)Ca(-)等三組為最佳活化配方。含量分析結(jié)果顯示P_BP不含有害的重金屬，而纖維連接素含量較市售血清少，在細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果同時顯示細(xì)胞的粘附較緩慢。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示三種P-BP可促進細(xì)胞增生率及存活率。由此可知，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑可更有效地促進細(xì)胞的增生速度，并達市售培養(yǎng)基2倍以上的效果。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑可使細(xì)胞于較短時間內(nèi)大量增生，可快速培養(yǎng)細(xì)胞將其應(yīng)用于組織工程，或應(yīng)用于再生醫(yī)療上使用。相較于市售培養(yǎng)基，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑可顯著地降低細(xì)胞的破裂及形態(tài)上傷害，并提供細(xì)胞最適生長環(huán)境。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑還可與生物材料(biomaterial)結(jié)合，放置于生物體內(nèi)達傷口快速修復(fù)及愈合的效果，以幫助 再生醫(yī)療領(lǐng)域的發(fā)展。本文中所使用的術(shù)語意義除非另有特別界定，否則均與熟習(xí)此所述技藝者的普遍認(rèn)知相同。本申請案中使用的術(shù)語其意義如下所列“血小板活化劑”意指任何可刺激血小板釋放生長因子的物質(zhì)，該生長因子通常可促進細(xì)胞快速增生。生長因子包括但不限于IGF、KGF、PDGF或TGF- β。因此，本發(fā)明提供一種制造細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑的方法，包含a.將哺乳動物的血液離心后取出上清液；b.添加血小板活化劑至該上清液中以得出上清活化液；及c.滅菌該上清活化液。在較佳實施例中，步驟a的離心方式是IOOg至5000g離心三次；在更佳實施例中，步驟a的離心方式是第一次IOOg至500g離心5至10分鐘、第二次IOOg至500g離心5至10分鐘、第三次IOOOg至5000g離心5至10分鐘。在較佳實施例中，步驟a的上清液中血小板濃度范圍為每毫升500000至1000000個血小板。在較佳實施例中，該血小板活化劑包含選自膠原蛋白、凝血酶及氯化鈣所組成群組的活化劑。在更佳實施例中，該血小板活化劑包含膠原蛋白、凝血酶及氯化鈣，其中膠原蛋白、凝血酶及氯化I丐的濃度范圍較佳為膠原蛋白1000 μ g/ml至5000 μ g/ml、凝血酶5U/ml 至 50U/ml、氯化 丐 O. I %至 4. 0%;膠原蛋白 1000 μ g/ml 至 5000 μ g/ml、凝血酶 0. lU/ml至2. OU/ml、氯化I丐O. 1%至4. O % ;或膠原蛋白10 μ g/ml至800 μ g/ml、凝血酶5U/ml至50U/ml、氯化鈣 O. I % 至 4. O %。在較佳實施例中，該細(xì)胞培養(yǎng)基是干細(xì)胞培養(yǎng)基。在較佳實施例中，該哺乳動物是豬。本發(fā)明還提供一種以上述方法制造的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑。在較佳實施例中，該細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑具有促進細(xì)胞增生及存活的效用。在另一較佳實施例中，該營養(yǎng)添加劑所含的內(nèi)毒素少于O. 03EU/mL。在另一較佳實施例中，該營養(yǎng)添加劑具有胰蛋白酶抑制活性。本發(fā)明還提供一種包含以上述方法制造的營養(yǎng)添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)基，以及將該細(xì)胞培養(yǎng)基用于在組織工程或再生醫(yī)療上培養(yǎng)或處理細(xì)胞的用途。


圖I 是 TGF- β 的 RSM 圖；圖2 是 PDGF 的 RSM 圖；圖3 是 IGF 的 RSM 圖；圖4 是 KGF 的 RSM 圖；圖5 是 TGF- β 的 Cube 圖；圖6 是 PDGF 的 Cube 圖 7 是 IGF 的 Cube 圖；圖 8 是 KGF 的 Cube 圖；圖9是毛細(xì)管電泳結(jié)果圖；圖10顯示細(xì)胞粘附率試驗結(jié)果；圖 11顯示細(xì)胞增生率試驗結(jié)果；圖12顯示細(xì)胞存活率試驗結(jié)果；圖13顯示內(nèi)毒素試驗結(jié)果；圖14顯示三種不同成份的P-BP與FBS比較酶抑制的能力結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明可能以不同的形式來實施，并不僅限于下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發(fā)明不同面向及特點中的代表。實施例I豬血液血液制劑的制備I.豬只經(jīng)屠宰人員以頸動脈放血后，將血液裝入含抗凝劑的離心管中，以冰浴方式保存至實驗室內(nèi)處理。2.將采集的血液于室溫經(jīng)5-10分鐘三次100 5000g離心后取出上清液(第一次100-500g離心5-10分鐘、第二次100-500g離心5_10分鐘、第三次1000-5000g離心5_10分鐘方式濃縮)。3.加入不同濃度的膠原蛋白、凝血酶及氯化鈣配方組合，Co (+)添加膠原蛋白的濃度為1000 5000 μ g/ml，Co㈠為膠原蛋白10 800 μ g/ml，T(+)為添加凝血酶5 50U/ml，T(_)為凝血酶O. I 2. 0U/ml，Ca(+)則為氯化鈣5 30%，Ca㈠為氯化鈣O. I 4.0% (表I)，再于15至45°C水浴下50-100rpm震蕩活化10 60分鐘，活化完畢后再以500-15，OOOg離心萃取上清活化液。4.以O(shè). 10 O. 50 μ m濾膜過濾，便取得豬血液血液制劑。表I活化劑配方的添加方法
權(quán)利要求
1.一種制造細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑的方法，其包含 a.將哺乳動物的血液離心后取出上清液； b.添加血小板活化劑至該上清液中以得出上清活化液'及 c.滅菌該上清活化液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述步驟a的離心方式為IOOg至5000g離心三次。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述步驟a的離心方式為第一次IOOg至500g離心5至10分鐘、第二次IOOg至500g離心5至10分鐘、第三次IOOOg至5000g離心5至10分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述步驟a的上清液中血小板濃度范圍為每毫升50000至100000個血小板。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述血小板活化劑包含膠原蛋白、凝血酶及氯化鈣。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述膠原蛋白、凝血酶及氯化鈣的濃度范圍為 膠原蛋白1000 Ii g/ml至5000 V- g/ml、凝血酶5U/ml至50U/ml、氯化隹丐0. I %至4. 0%; 膠原蛋白 1000 V- g/ml 至 5000 u g/ml、凝血酶 0. lU/ml 至 2. OU/ml、氯化I丐 0. I % 至4. 0% ;或膠原蛋白 10 V- g/ml 至 800 V- g/ml、凝血酶 5U/ml 至 50U/ml、氯化隹丐 0. I %M 4. 0%
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基是干細(xì)胞培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述哺乳動物是豬。
9.一種以權(quán)利要求I所述的方法制造的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的營養(yǎng)添加劑，其具有促進細(xì)胞增生及存活的效用。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的營養(yǎng)添加劑，其中，所含的內(nèi)毒素少于0.03EU/mL。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的營養(yǎng)添加劑，其具有胰蛋白酶抑制活性。
13.一種包含權(quán)利要求9所述的營養(yǎng)添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種制造細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑的方法，包含將哺乳動物的血液離心后取出上清液；添加血小板活化劑至該上清液中以得出上清活化液；及滅菌該上清活化液。本發(fā)明還關(guān)于一種使用上述方法制造的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑；一種包含該營養(yǎng)添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)基；以及一種將該細(xì)胞培養(yǎng)基用于在組織工程或再生醫(yī)療上培養(yǎng)或處理細(xì)胞的用途。
文檔編號C12N5/074GK102618494SQ20111039601
公開日2012年8月1日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者尤偉勛, 林詠凱 申請人:尤偉勛, 林詠凱