專利名稱：一種能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中重組病毒的構(gòu)建，具體涉及對(duì)家蠶核型多角體病毒進(jìn)行基因重組構(gòu)建基因工程病毒的方法。
背景技術(shù)：
茶尺蠖(Bctropis oblique)，又稱拱拱蟲、量寸蟲、吊絲蟲，是茶樹的主要害蟲，該蟲屬鱗翅目(I^pidoptera)尺蛾科(Geometridae)。幼蟲食葉，暴發(fā)時(shí)可將成片茶園食成光桿，致茶葉減產(chǎn)60%以上，嚴(yán)重影響成茶品質(zhì)。以往防治茶尺蠖的基本方法為加強(qiáng)預(yù)測預(yù)報(bào)和農(nóng)業(yè)防治，人工捕殺，科學(xué)使用化學(xué)農(nóng)藥。但是長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，致使害蟲抗藥性增強(qiáng)，天敵數(shù)目減少，造成害蟲的再猖獗和爆發(fā)危害，由于農(nóng)藥的使用、導(dǎo)致環(huán)境污染、茶葉中農(nóng)藥殘留增加、品質(zhì)下降。為解決這個(gè)問題，許多專家開始研究用生物農(nóng)藥來防治茶樹害蟲，其中昆蟲病毒是其中比較常用的一種。茶尺獲核型多角體病毒(Bctropis obliqua nucleopolyhedrovirus, EcobNPV) 是茶尺蠖的病原性天敵，可通過食下在蟲體內(nèi)迅速增殖，使其染病死亡。因此，EcobNPV可以作為生物殺蟲劑用于茶尺蠖的防治。利用自然飼料(茶樹鮮葉)或利用菊花作為飼料， 在室內(nèi)飼喂茶尺蠖，通過接種EcobNPV使茶尺蠖染病，從患病的蟲體中收集EcobNPV。用上述方法繁殖EcobNPV具有明顯不足茶尺蠖人工飼養(yǎng)技術(shù)不成熟，難以大規(guī)模飼養(yǎng)，因此通過人工飼養(yǎng)茶尺蠖繁殖的病毒數(shù)量滿足不了茶尺蠖生物防止的要求，且該法生產(chǎn)EcobNPV的成本很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種制備能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒的方法， 以一種低成本、易控制的方法大量提供能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒的制備方法，包括以下步驟
(1)制備包含茶尺蠖核型多角體病毒的包膜蛋白o(hù)dv-e25、odv-US和解螺旋酶基因的片段，帶啟動(dòng)子的家蠶核型多角體病毒基因polh的重組載體，得到重組載體 pFastBacDual—polh—helicase ；
(2)將重組載體pFastBacDual-polh-helicase 轉(zhuǎn)化進(jìn)五 coli DHlO BmBacmid 感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，在培養(yǎng)板上培養(yǎng)，然后通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性菌斑，從陽性菌斑中提取重組BmBacmi d-卯從-AWicawDNA ；所述培養(yǎng)板含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、 5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷和異丙基硫代-D半乳糖苷；所述陽性菌斑為白色菌落；
(3)將上述重組BmBacmid-Z7O^-AWica1SeDNA轉(zhuǎn)染到家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)4 6天， 收集培養(yǎng)細(xì)胞上清，獲得Pl代重組病毒BmEoNPV ；采用Pl代重組病毒BmEoNPV感染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)4 6天，收集培養(yǎng)細(xì)胞上清，獲得P2代重組病毒BmEoNPV ；
(4)每頭5齡家蠶注射1 2微升P2代重組病毒BmEoNPV，發(fā)病后，純化重組病毒多角體，即得所述能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒。上述技術(shù)方案中，所述重組載體pFastBacDual-polh-helicase的制備方法包括以下步驟
(a)以茶尺蠖核型多角體病毒EcobNPV的DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增出EcobNPV 的包膜蛋白o(hù)dv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆進(jìn)pMD19_T載體，獲得質(zhì)粒 pMD19-helicase ；
(b)分離帶啟動(dòng)子的家蠶核型多角體病毒基因polh，克隆進(jìn)pFastBacDual載體，獲得質(zhì)粒 pFastBac Dual-polh ；
(c)雙酶切質(zhì)粒pMD19-helicase，回收EcobNPV的包膜蛋白o(hù)dv_e25、 odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆進(jìn)載體pFastBacDual-polh，獲得重組載體 pFastBacDual-polh_helicase0上述技術(shù)方案中，步驟(a)中，PCR擴(kuò)增法中涉及的引物可根據(jù)GenBank已登錄的 EcobNPV全基因組序列(登錄號(hào)為DQ837165)，在病毒解螺旋酶基因兩端分別設(shè)計(jì)，優(yōu)選地， 所述引物包括
SEQ ID No. 1 =Eo-Helicasel GAACTAGTATGATTGGTGTAATCGT (下劃線示分e I位點(diǎn))； SEQ ID No. 2 :Eo-Helicase2 :CACTGCAGACTTTGCA CGTAGTTTGTGTATATG (下劃線示Ai I位點(diǎn))；步驟(c)中，雙酶切質(zhì)粒pMD19-helicase的步驟中，采用的用和/^I內(nèi)切酶。上述技術(shù)方案中，步驟(b)中，分離帶啟動(dòng)子的家蠶核型多角體病毒基因polh的方法選自以下兩種方法中的任何一種
(一)用限制性內(nèi)切酶5 / I酶切家蠶核型多角體病毒BmNPV的DNA，回收含有完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的片段Po從，該片段大小約為1.4 1Λ ；
或者，(二)通過PCR體外擴(kuò)增的方法從家蠶核型多角體病毒的DNA中克隆含有完整多角體蛋白基因編碼區(qū)以及啟動(dòng)子的片段/70從。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)采用上述制備方法制得的能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)上述能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒作為防治茶尺蠖的生物殺蟲劑的應(yīng)用。因此，本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種防治茶尺蠖的生物殺蟲劑，所述防治茶尺蠖的生物殺蟲劑的主要活性成分為上述能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒。在實(shí)際應(yīng)用中，將上述能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒噴灑在茶葉樹葉面上，可防止茶尺蠖對(duì)茶葉樹的危害。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
1.用本發(fā)明的技術(shù)方案構(gòu)建的重組病毒BmEoNPV既能感染家蠶又能感染茶尺蠖；用家蠶生產(chǎn)能感染茶尺蠖重組核型多角體病毒可以滿足生物防治對(duì)大量病毒的需求。2.用本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的重組病毒BmEoNPV成本低、生產(chǎn)易控。


圖1是實(shí)施例一中PCR擴(kuò)增出的EcobNPV的包膜蛋白o(hù)dv-e25、odv_d8和解螺旋酶基因的片段(約5.01Λ)的電泳圖；其中，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1為PCR產(chǎn)物；
圖2是實(shí)施例一中pMD19-helicase的鑒定；其中，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，1為 pMD19-helicase DNA用分e I禾Π Ai I雙酶切后電泳；
圖3是實(shí)施例一中pFastBacDual-polh-helicase的鑒定；其中M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量， 1 為 pFastBacDual-polh-helicase DNA 用^asH I 酶切后的電泳；
圖4是實(shí)施例一中Pl代重組病毒BmEoNPV的PCR鑒定；其中，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1 為以重組質(zhì)粒pFastBacDual-polh-helicase為模板，2為Pl代重組病毒BmEoNPV DNA為模板；
圖5是實(shí)施例一中P2代重組病毒BmEoNPV感染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞4 一 6天后的細(xì)胞變化； 可見細(xì)胞變圓，細(xì)胞核中形成多角體。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實(shí)施例一能感染茶尺蠖重組核型多角體病毒的構(gòu)建，包括如下步驟，
1.根據(jù)GenBank已登錄的EcobNPV全基因組序列(登錄號(hào)為DQ83716Q，在病毒解螺旋酶基因兩端分別設(shè)計(jì)引物
SEQ ID No. 1 =Eo-Helicasel GAACTAGTATGATTGGTGTAATCGT (下劃線示 Sue I 位點(diǎn))， SEQ ID No. 1 :Eo-Helicase2 :CACTGCAGACTTTGCACGTAGTTTGTGTATATG(下劃線示/ ^ I 位點(diǎn))，
2.以EcobNPV DNA 為模板，用 Eo-Helicasel、Eo-Helicasel 引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜參見圖1。將擴(kuò)增出的EcobNPV的包膜蛋白0dv-e25、 odv-e28和解螺旋酶基因的片段(約5. Okb)，克隆進(jìn)pMD19_T (TAKARA公司產(chǎn)品)載體，獲 pMD19-helicase ；
pMD19-helicase 的鑒定結(jié)果參見圖 2。pMD19-helicase DNA 用分e I ^WPst I 雙酶切可切出約5. Okb的條帶。3.按常規(guī)方法，提取BmNPV-DNA，用5 / I酶切后，回收5 / I片段(含有完整的多角體蛋白基因及啟動(dòng)子，約1.4kb)，克隆進(jìn)pFastBacDual (Iinvitrogen公司產(chǎn)品)的5 / I 位點(diǎn)，獲得質(zhì)粒 pFastBac Dual-polh ；
4. pMD19-helicase用分el和AiI雙酶切，電泳，膠回收長度約為5. 01Λ的片段，連接至載體pFastBacDual-polh 的1§7￡^1禾口/ >^1位點(diǎn)，獲得質(zhì)粒口？88{88001181-口0111-1161化886 ； pFastBacDual-polh-helicase 的鑒定結(jié)果參見圖 3。pFastBacDual-polh-helicase DNA經(jīng)及I酶切，可切出T^OObp左右和9000bp左右的條帶，與預(yù)想的片段大小相同， 說明所得到的質(zhì)粒為正確的重組質(zhì)粒。5. pFastBac Dual-polh-helicase ^it Ε. coli DHlOBmBacmid C^itTj^^i 參見:Cuiping Cao 等，Development of a rapid and efficient BmNPV baculovirus expression system for application in mulberry silkworm, Bombyx mori. RESEARCH COMMUNICATIONS. 2006, 91 (12) : 1692-1697)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素(kan, 50μδ/πι),慶大霉素(Gen, 7μδ/πι1)，四環(huán)素(Tet, lOPg/ml)，5_ 溴 _4_ 氯 _3_ 吲哚-β -D-半乳糖苷(X-gal，100μδ/πι1)和異丙基硫代-β -D半乳糖苷(IPTG, 40μδ/πι1)篩選平板上，倒置培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)至少48h，并把平板放置4°C冰箱直至看到明顯的白斑。6.用滅菌牙簽挑取白斑單菌落，然后在含Kan (5(^g/ml)，Gen (7μδ/ ml), Tet (1 OPg/ml)的3ml液體細(xì)菌培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，提取 ^acmiA-polh-helicase 基因組 DNA。7.取 4yg 重組 BmBacmid-polh-helicase DNA 與 8μ1 脂質(zhì)體混合后，轉(zhuǎn)染 1 X 106/ml的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，27°C培養(yǎng)4 一 6天，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，并有多角體形成。收集發(fā)病細(xì)胞上清，獲Pl代重組病毒BmEoNPV。Pl代重組病毒BmEoNPV的鑒定參見圖4。以Pl代重組病毒BmEoNPV DNA為模板， Bm Polh-Hel-I(SEQ ID No. 3 5，-GATCTTCGGCAACCATGTAG-3，)和 Bm Polh-Hel-2(SEQ ID No. 4 :5，-CGTGTTATCGAGGAGCG-3，)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可特異性擴(kuò)增出700bp左右的條帶，與理論值相符，表明重組病毒BmEoNPV被正確構(gòu)建。8. Pl代重組病毒BmEoNPV 10微升，感染1 X 106/ml的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，27°C培養(yǎng) 4 一 6天，收集發(fā)病細(xì)胞上清，獲P2代重組病毒BmEoNPV。P2代重組病毒BmEoNPV感染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞4 一 6天后的細(xì)胞變化參見圖5。細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，并可觀察到有多角體形成。9.將P2代重組病毒BmEoNPV以每頭5齡家蠶注射1 一 2微升，25 °C正常飼養(yǎng)，發(fā)
病后，純化重組病毒多角體。實(shí)施例二 實(shí)施例一獲得的重組病毒BmEoNPV的應(yīng)用
將實(shí)施例一獲得的重組病毒多角體，配制IO8多角體/ml的病毒液，噴灑在茶葉樹上， 并將野外捕捉到的3 — 4齡茶尺蠖放養(yǎng)在噴灑過重組病毒多角體茶樹，自然取食，一周后， 茶尺蠖的自然感染死亡率達(dá)63%。
權(quán)利要求
1.一種能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)制備包含茶尺蠖核型多角體病毒的包膜蛋白o(hù)dv-e25、Odv-US和解螺旋酶基因的片段，帶啟動(dòng)子的家蠶核型多角體病毒基因polh的重組載體，得到重組載體 pFastBacDual—polh—helicase ；(2)WMMMW pFastBacDual-polh-helicase ^iti&B. coli DHlO BmBacmid 胃受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，在培養(yǎng)板上培養(yǎng)，然后通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性菌斑，從陽性菌斑中提取重組 BmBacmi d-/7o7A-Aeyica^eDNA ；(3)將上述重組BmBacmid-Z7O^-AWica1SeDNA轉(zhuǎn)染到家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)4 6天， 收集培養(yǎng)細(xì)胞上清，獲得Pl代重組病毒BmEoNPV ；采用Pl代重組病毒BmEoNPV感染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)4 6天，收集培養(yǎng)細(xì)胞上清，獲得P2代重組病毒BmEoNPV ；(4)每頭5齡家蠶注射1 2微升P2代重組病毒BmEoNPV，發(fā)病后，純化重組病毒多角體，即得所述能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)板含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷和異丙 基硫代-β-D半乳糖苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒的制備方法，其特征在于，重組載體PFastBacDual-polh-helicase的制備方法包括以下步驟(a)以茶尺蠖核型多角體病毒EcobNPV的DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增出EcobNPV 的包膜蛋白o(hù)dv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆進(jìn)pMD19_T載體，獲得質(zhì)粒 pMD19-helicase ；(b)分離帶啟動(dòng)子的家蠶核型多角體病毒基因polh，克隆進(jìn)pFastBacDual載體，獲得質(zhì)粒 pFastBac Dual-polh ；(c)雙酶切質(zhì)粒pMD19-helicase，回收EcobNPV的包膜蛋白o(hù)dv_e25、 odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆進(jìn)載體pFastBacDual-polh，獲得重組載體 pFastBacDual-polh_helicase0
4.采用權(quán)利要求1所述制備方法制得的能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒。
5.權(quán)利要求1所述能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒作為防治茶尺蠖的生物殺蟲劑的應(yīng)用。
6.一種防治茶尺蠖的生物殺蟲劑，其特征在于，所述防治茶尺蠖的生物殺蟲劑的主要活性成分為權(quán)利要求4所述能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能感染茶尺蠖的重組核型多角體病毒的制備方法，包括以下步驟(1)制備重組載體pFastBacDual-polh-helicase；(2)將重組載體pFastBacDual-polh-helicase轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliDH10BmBacmid感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，在培養(yǎng)板上培養(yǎng)，然后通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性菌斑，從陽性菌斑中提取重組BmBacmid-polh-helicaseDNA；(3)將上述重組BmBacmid-polh-helicaseDNA轉(zhuǎn)染到家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，收集培養(yǎng)細(xì)胞上清，獲得重組病毒BmEoNPV；(4)每將重組病毒注射，純化得到重組病毒多角體。將上述重組核型多角體病毒噴灑在茶葉樹葉面上，可防止茶尺蠖對(duì)茶葉樹的危害，而且該方法成本低、生產(chǎn)易控。
文檔編號(hào)C12N15/34GK102260690SQ20111015086
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 曹廣力, 楊益民, 潘中華, 薛仁宇, 貢成良, 郭睿 申請(qǐng)人:溧陽市民生農(nóng)業(yè)科技園有限公司, 蘇州大學(xué)