專利名稱：一種通過帶病組培誘導獲得抗棗瘋病突變株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過持續(xù)帶病組培誘導獲得抗棗瘋病突變株的方法。
背景技術(shù)：
Φ瘋病(Jujube witches'broom disease)由植原體(phytoplasma)弓I起，是Φ樹 生產(chǎn)上發(fā)生最普遍、危害最嚴重的致死性傳染性病害。棗樹感染棗瘋病后，葉片變小、花器 和托葉刺退化成小葉、枝葉叢生，輕者3-5年、重者1-2年后死亡。棗瘋病為維管束系統(tǒng)病 害，防治非常困難，選育優(yōu)良抗病品種是解決棗瘋病問題的根本途徑。目前，利用傳統(tǒng)地方 品種中存在的自然變異進行株系選優(yōu)，仍是棗樹最主要的新品種選育方法。河北農(nóng)業(yè)大學 中國棗研究中心，經(jīng)過8年時間，通過株系選優(yōu)選育出了國內(nèi)外第一個高抗棗瘋病棗樹新 品種‘星光’。但株系選優(yōu)存在著被動等待變異、可遇不可求、難于定向培育品種的問題。本專利發(fā)明人在對感染棗瘋病的婆棗進行組織培養(yǎng)的過程中，發(fā)現(xiàn)在大量的病苗 群體中有看似健康的個體(疑似抗病突變株)。其基本特征是葉片明顯變大，莖增粗，節(jié) 間伸長，無托葉刺變成小葉的狀況，托葉刺不可見或變正常，腋芽不萌發(fā)或正長萌發(fā)。據(jù)此 分析，如果能建立一套利用帶病組培苗中強大的病原選擇壓、通過對帶病組培苗的持續(xù)培 養(yǎng)誘發(fā)抗病突變株的方法，將會大大推動抗棗瘋病育種的進程，有利于棗產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康 發(fā)展。通過文獻查閱，通過帶病(棗瘋病)組培苗的持續(xù)培養(yǎng)誘發(fā)抗棗瘋病突變株的方 法，尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明建立了一套通過帶病(棗瘋病)組培苗的持續(xù)培養(yǎng)誘導抗棗瘋病突變株的 方法，為抗棗瘋病品種選育開辟了新途徑。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是以帶棗瘋病組培苗為材料，通過持 續(xù)繼代培養(yǎng)，誘發(fā)抗棗瘋病突變株，通過形態(tài)變異篩選、分子水平遺傳變異鑒定和棗瘋病抗 性鑒定等，篩選出對棗瘋病抗性顯著提高的突變株。本發(fā)明的具體內(nèi)容，即組培條件下誘發(fā)抗棗瘋病突變株的具體方法如下(1)帶棗瘋病組培苗材料的準備。采集感染棗瘋病的嫩芽為外植體，在不加入任何 植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中(蔗糖濃度為30g/L，培養(yǎng)基滅菌前pH值6. 0)進行啟動培 養(yǎng)和繼代培養(yǎng)(培養(yǎng)室溫度為28士2°C )，獲得大群體的帶病組培苗。(2)疑似突變株的初步篩選。在上述獲得的帶病組培苗中，觀察篩選在外觀形態(tài)上 看似健康的個別的疑似突變株，確定疑似突變株的基本標準是與正常的帶病組培苗相比， 葉片明顯變大，莖增粗，節(jié)間伸長，托葉刺不可見或變正常，腋芽不萌發(fā)或正長萌發(fā)。(3)疑似突變株的復選。將按上述標準確定的疑似突變單獨挑選出來，轉(zhuǎn)入新的不 添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中單獨繼代培養(yǎng)，這些疑似突變株在培養(yǎng)過程中還 會出現(xiàn)形態(tài)上的分化，有的繼續(xù)保持健康狀態(tài)，有的變回瘋苗狀態(tài)；將外觀形態(tài)仍表現(xiàn)健康
3的組培苗再次挑選出來，繼續(xù)單獨培養(yǎng)；如此反復，直到疑似突變株在繼代培養(yǎng)后不再出 現(xiàn)形態(tài)分化，全部表現(xiàn)為健康植株為止，作為復選突變株。(4)突變株的決選和確定。對上述篩選出的復選突變株進行AFLP (擴增片段長度 多態(tài)性，Amplified fragment length polymorphism)檢測，以一直表現(xiàn)典型棗瘋病癥狀、 未發(fā)生疑似突變的同一品種的組培苗為對照，鑒定出具有特征性DNA差異條帶的復選突變 株，作為決選突變株；進而以其為接穗，在組培條件下嫁接到表現(xiàn)典型棗瘋病癥狀的組培苗 砧木上，進行棗瘋病抗性鑒定，接穗芽萌發(fā)45天后仍不表現(xiàn)棗瘋病癥狀的，確定為抗棗瘋 病突變株。本發(fā)明專利的有益效果是，建立了一套較完善的利用帶病組培苗中強大的病原選 擇壓、通過對帶病組培苗的持續(xù)培養(yǎng)誘發(fā)抗棗瘋病突變株的方法。利用該技術(shù)，可實現(xiàn)在 組織培養(yǎng)條件下規(guī)模化快速獲得抗棗瘋病新種質(zhì)，其應用將會大大推動抗棗瘋病育種的進 程，有利于棗產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。


圖1是篩選疑似突變株的形態(tài)標準。圖2是大群體、次群體和變異株，突變株、次群體和瘋苗群體(從左至右)。圖3是嫁接接種鑒定突變株的抗病性。
具體實施例方式以感病品種婆棗感染棗瘋病的嫩芽為外植體，在不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS 培養(yǎng)基(基滅菌前PH值6.0，蔗糖濃度為30g/L)中進行啟動培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)(培養(yǎng)室溫 度為28士2°C )，獲得組培苗；以葉片明顯變大、莖增粗、節(jié)間伸長、托葉刺不可見或變正常、 腋芽不萌發(fā)或正長萌發(fā)為標準，從中挑選出在形態(tài)上看似健康的疑似突變株系個；將疑似 突變株系單獨在不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，從中剔除恢復病癥 的組培苗而將外觀形態(tài)仍表現(xiàn)健康的組培苗再次挑選出來，進一步單獨繼代培養(yǎng)；如此反 復7次，篩選出繼代培養(yǎng)后不再出現(xiàn)形態(tài)分化、全部表現(xiàn)健康的疑似突變株系7個；對這些 疑似突變株進行AFLP檢測，以未發(fā)生疑似突變一直表現(xiàn)典型的棗瘋病癥狀的婆棗組培苗 為對照，鑒定出具有特征性差異條帶的突變株系3個，進而以其為接穗，在組培條件下嫁接 到表現(xiàn)典型棗瘋病癥狀的婆棗組培苗砧木上進行棗瘋病抗性的嫁接接種鑒定，最后鑒定篩 選出在接穗芽萌發(fā)45天后仍沒有表現(xiàn)出棗瘋病癥狀的抗棗瘋病突變株系3個。
權(quán)利要求
1. 一種通過持續(xù)帶病組培誘導獲得抗棗瘋病突變株的方法，其特征在于包括以下步驟(1)帶棗瘋病組培苗材料的準備。以感染棗瘋病的嫩芽為外植體，在不加入任何植物生 長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中進行啟動培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，獲得大量的帶病組培苗。(2)疑似突變株的初步篩選。在步驟(1)獲得的帶病組培苗中，以葉片明顯變大、莖增 粗、節(jié)間伸長、托葉刺不可見或變正常、腋芽不萌發(fā)或正長萌發(fā)為標準，挑選出在外觀形態(tài) 上看似健康的疑似突變株。(3)疑似突變株的復選。將步驟(2)初選出的疑似突變株，在不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑 的MS培養(yǎng)基中單獨繼代培養(yǎng)，觀察其外觀形態(tài)的分化情況；將外觀形態(tài)仍表現(xiàn)健康的疑似 突變株的繼代組培苗再次挑選出來，繼續(xù)在不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中單獨 培養(yǎng)；如此反復進行繼代培養(yǎng)和挑選，直到疑似突變株在繼代培養(yǎng)后不再出現(xiàn)形態(tài)分化、全 部表現(xiàn)為外觀形態(tài)健康的植株為止，作為復選突變株。(4)突變株的決選和確定。對步驟(3)篩選出的復選突變株進行基因組DNA的AFLP(擴 增片段長度多態(tài)性，Amplified fragment length polymorphism)分子標記檢測，以一直 表現(xiàn)典型棗瘋病癥狀、未發(fā)生疑似突變的同一品種的組培苗為對照，鑒定出具有特征性DNA 差異條帶的突變株，作為決選突變株；進而以其為接穗，在組培條件下嫁接到表現(xiàn)典型棗 瘋病癥狀的組培苗砧木上，進行棗瘋病抗性鑒定，接穗芽萌發(fā)45天后仍不表現(xiàn)棗瘋病癥狀 的，確定為抗棗瘋病突變株。
全文摘要
以帶棗瘋病組培苗為材料，通過持續(xù)帶病繼代培養(yǎng)，利用帶病組培苗中高濃度的病原形成強大選擇壓，誘發(fā)抗棗瘋病突變，進而通過形態(tài)變異篩選及形態(tài)變異穩(wěn)定性觀察、分子水平遺傳變異鑒定和對棗瘋病抗性的組培微嫁接鑒定等，篩選出對棗瘋病抗性顯著提高的突變株。利用該技術(shù)，可實現(xiàn)在組織培養(yǎng)條件下規(guī)?；焖僬T導獲得抗棗瘋病新種質(zhì)，其應用有助于推動抗棗瘋病育種的進程，有利于棗產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。
文檔編號C12Q1/68GK102100179SQ20111005157
公開日2011年6月22日 申請日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者代麗, 劉孟軍, 劉曉光, 趙錦 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學