專利名稱：一種滅殺釘螺的蘇云金芽孢桿菌及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于滅殺釘螺及血吸蟲防治技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種滅殺釘螺的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)，同時還涉及一種滅殺釘螺的蘇云金芽孢桿 菌的制備方法。該菌種是由本實驗室從死亡湖北釘螺中分離、并以日本血吸蟲的中間宿主 湖北釘螺(Oncomelania hupensis)為供試釘螺，經(jīng)過毒力生物測定所篩選出的對湖北釘螺 有高毒力的菌株。該菌株發(fā)酵72h的發(fā)酵上清液感染湖北釘螺24h后，對釘螺的致死率在 50%以上，因而該菌株可用于生產(chǎn)新型蘇云金芽孢桿菌殺螺劑，擴大蘇云金芽孢桿菌殺蟲 劑的使用范圍。
背景技術(shù)：
血吸蟲病(Schistosomiasis)是世界上最重要的人畜共患寄生蟲病之一。它不僅 嚴(yán)重危害人體健康，同時對家畜也會造成極大的危害，影響疫區(qū)經(jīng)濟發(fā)展，因此，人們稱它 為“瘟神”。血吸蟲生存繁殖離不開生長在潮濕草灘上和溝渠旁的釘螺。釘螺是血吸蟲的中 間宿主，是傳染血吸蟲病的重要媒介。在我國，傳播日本血吸蟲的湖北釘螺(Oncomelania hupensis)是日本血吸蟲的唯一中間宿主。因此，滅螺是防止血吸蟲感染，控制和阻斷血吸 蟲病傳播的最有效途徑之一。1991年，WHO血吸蟲病專家委員會第4次會議中，在強調(diào)疾 病控制策略思想的同時，著重指出“要達到阻斷傳播的目標(biāo)，必須開展螺螄控制”，表明了螺 螄控制在防治血吸蟲病中必不可少的作用。吳儀副總理在全國血吸蟲病防治工作會議的講 話中，將“開展滅螺新藥和新技術(shù)研究”擺在了加強血防科研，不斷改進防治技術(shù)的首要位 置。然而，中國水域廣闊，釘螺分布面積大，如何治理長江流域和洞庭湖等地區(qū)的釘螺危害， 是擺在人們面前的一個亟待解決的問題。畢竟，遼闊的水體面積使得我們不可能像日本那 樣，在水塘邊上用水泥砌好，使釘螺無法吸附于表面，并最終達到消滅釘螺的作用。目前世界各國對于釘螺的防治主要使用物理方法和化學(xué)殺螺劑如氯硝柳胺、五氯 酚鈉和溴乙酰胺等。物理滅螺的方法工程浩大，耗資巨大，受自然環(huán)境條件、人力、物力、財 力等的限制，而化學(xué)殺螺劑存在選擇性較弱、持效期短、易造成環(huán)境污染等缺點。為了彌補 物理和化學(xué)殺螺劑滅螺的不足，近年來有關(guān)植源性滅螺藥的研究報道較多，如樟樹、銀杏、 楓楊、中草藥等的水浸液及茶皂素等對釘螺均有毒效，但這些植物生長緩慢，滅螺的有效成 分含量低，因此植源性滅螺藥的生產(chǎn)和使用成本高，產(chǎn)量和應(yīng)用受到限制。因而篩選有效的 殺螺微生物，進行微生物滅螺制劑的研究及開發(fā)日顯必要，這對于有效地防止血吸蟲病的 傳播，保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義。早在1971年，巴西圣保羅熱帶醫(yī)學(xué)雜志報道，黃鞠菌和寄生鞠菌 (Aspergillusparasilicus)的代謝產(chǎn)物Alfatoxin在實驗室中有良好的殺螺作用；1976 年，Wp CA等報道，放線菌(Act. Lavendulae)的代謝產(chǎn)物植菌霉素(Phytobactriomycin) 對豆螺有毒殺作用。我國在50年代就發(fā)現(xiàn)了微生物對釘螺的毒殺作用，簡浩然等于 1958年從釘螺中分離出了多株細菌，發(fā)現(xiàn)有5株細菌對釘螺有一定的殺滅作用[石孟芝，微生物殺滅釘螺的研究概況。實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2003，10(3) :435-437]；姚超素等自 1966年開展微生物滅螺研究工作以來，分離篩選出了多株有殺螺活性的微生物菌株[姚 超素，胡代炎，石孟芝，蔡文華，胡鋼，微生物及寄生蟲防治釘螺的研究.實用預(yù)防醫(yī)學(xué)， 1995,2(4) 198-200 ；胡代炎，石孟芝，任茂元，姚超素，灰色直絲鏈霉菌殺釘螺的實驗 研究.實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，1994，1(4) :213-214]。楊建明等介紹了有關(guān)微生物滅釘螺方法 和途徑的研究現(xiàn)狀，并說明了幾種滅螺微生物凸形假單孢菌(Psudomonas colllwxa Chester)、淺灰鏈霉菌 230 (Streptomyces griseolus 230)、鏈霉菌 218 (Streptomyces diastatochromogenyes218)(Streptomyces griseolus 132) ^
果和作用機理[楊建明，肖瑞芬，周艷。微生物滅釘螺的研究現(xiàn)狀，湖北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2003，25 (4) :337-341]。陽桂芬等從釘螺和釘螺孳生的土壤中分離具有殺釘螺作用 的微生物，結(jié)果153株中分離出YT28和LT129芽孢桿菌強毒株，室內(nèi)浸泡殺螺，48h釘螺死 亡率90%，72h達95%，表明YT28和LT129菌株有較好的殺螺效果[陽桂芬等，殺釘螺微生 物的篩選，熱帶病與寄生蟲學(xué)，2003，1(4) :214-215]。然而微生物滅螺的研究進展緩慢，到 目前為止，尚未找到一種理想的能推廣應(yīng)用的滅螺有效菌株。 蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種重要的殺蟲細菌，由 于其具有殺蟲效果好、特異性強、不污染環(huán)境、生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)和使用成本低等優(yōu)點而 在害蟲生物防治中發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)已報道，蘇云金芽孢桿菌對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目 等9個目的昆蟲和螨類、植物線蟲、原生動物、扁形動物等有特異性殺蟲活性。近年來，通過 實驗發(fā)現(xiàn)，Bt亦可以殺滅釘螺，是一種有效的、頗有應(yīng)用前景的殺螺微生物。OSMAN G.Y.等 (1991，1992)研究了幾種Bt殺螺劑SAN401，SAN402, SAN415的殺螺活性，結(jié)果表明，Bt殺 螺劑對沙地阿拉伯血吸蟲的中間宿主Bulunus truncatus禾口 Biomphalaria alexandrina 均有顯著的活性，認為蘇云金芽孢桿菌具有潛在的高效殺螺活性，但其殺螺機理有待進一 [Osman G Y, Mohamed A Μ, AL-Layl K J. Studies on MolluscicidalActivity of Different Preparation of Bacillus一thuringiensis as Biocidal Agents onBiomphalaria—alexandria Snails as Vectors of Schistosomiasis Bilharziasis inSaudiarabia. Anzeiger fuer Schaedlingskunde Pflanzenschutz Umweltschutz 1992, 65(4) :67-70]。Liu C和Starnes R L等專利中報道了一株對包括釘螺在內(nèi)的害蟲有 殺蟲功效的 BT 菌株[Liu C, Starnes R L, Macmullan A M, Manker D C, Lufburrow PA, Liu C L. Bacillus thuringiensis strain that produces pesticidal cpd. -esp. 2, 5-bis(2-alanyl-amino-l,3-di :hydroxypropyl)pyrazine or deoxy analogue, used with otherbacillus-related pesticide against coleoptera.Patent Assignee (s) Abbot Lab (ABBO) ；VALENT BIOSCIENCES CORP(VALE-Non-standard)] ；Liu, C-L.禾口 Marrone, P. G.等專利報道了對釘螺等害蟲有殺蟲功效的能產(chǎn)生高產(chǎn)量晶體delta-內(nèi) 毒素的 Bt 突變株[Liu C, Starnes R L, Macmullan A M, Manker D C, Lufburrow P A, Liu C L. Bacillus thuringiensis strain that produces pesticidal cpd. -esp. 2, 5-bis(2-alanyl-amino-l,3-di :hydroxypropyl)pyrazine or deoxy analogue,used with otherbacillus-related pesticide against coleoptera. Patent Assignee (s) :Abbot Lab (ABBO) ；VALENT BIOSCIENCES CORP(VALE-Non-standard)]

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于是提供了一種滅殺釘螺的蘇云金芽孢桿菌。該菌株對釘螺有高效特異性的毒殺作用，但對人、畜和環(huán)境安全。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種滅殺釘螺的蘇云金芽孢桿菌的制備方法。 用該方法能夠快速，有效地對該菌株進行培養(yǎng)與收集，并獲得對湖北釘螺有效的發(fā)酵上清 液，該培養(yǎng)方法簡單、成本低、易于實施。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施蘇云金芽孢桿菌菌株A0H-01是一種由本實驗室從死亡湖北釘螺中分離、并以日 本血吸蟲的中間宿主湖北釘螺(Oncomelania hupensis)為供試釘螺，經(jīng)過毒力生物測定 所篩選出的對湖北釘螺有高毒力的菌株。根據(jù)該菌株的作用對象，取抗(Anti-)、湖北釘螺 (Oncomelania hupensis)的第一個字母組成其代碼AOh，又因該菌株是從同一死螺樣品中 分離的多株芽孢桿菌中篩選出來的、且編號為01的一株，因此將該蘇云金芽孢桿菌命名為 AOh-Ol (Bacillus thuringiensis ssp. A0H-01，CCTCC 保藏號M 2010047)。基本的技術(shù)原 理是利用芽孢可耐80-85°C高溫的特性，在80-85°C高溫下分離蘇云金芽孢桿菌；以湖北 釘螺為供試釘螺，進行毒力生物測定，經(jīng)過比較毒力，篩選到該高毒力菌株AOh-Ol。(1)殺釘螺蘇云金芽孢桿菌菌株A0H-01的制備方法一種滅殺釘螺的蘇云金芽孢桿菌的制備方法，其具體步驟如下A.利用芽孢可耐80-85 °C的高溫的特性，在80-85 °C高溫下，用普通固體細菌培養(yǎng) 基倒平板，在28-30°C下培養(yǎng)2-3天，分離細菌單菌落。該普通固體細菌培養(yǎng)基的組成為 蛋白胨1%，牛肉膏0. 5%，氯化鈉0. 5%，瓊脂1. 0-1. 5%，用水補充體積至100ml。B.隨機挑選單菌落涂片，用石碳酸復(fù)紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，篩選能產(chǎn)生 芽孢和晶體的蘇云金芽孢桿菌。C.以湖北釘螺為試螺，對篩選出的蘇云金芽孢桿菌進行毒力生物測定，經(jīng)過比較 毒力致死中量Lc5tl，篩選到該高毒力菌株。根據(jù)該菌株的作用對象，取抗(Anti-)、湖北釘螺 (Oncomelania hupensis)的第一個字母組成其代碼A0h，又因該菌株是從同一死螺樣品中 分離的多株芽孢桿菌中篩選出來的、且編號為01的一株，因此將該蘇云金芽孢桿菌命名為 AOh-Ol (Bacillus thuringiensis. AOh-Ol，CCTCC保藏號M 2010047)，保藏日期2010 年 3 月4日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國.武漢.武漢大學(xué)。該菌株的具體特征如下(2)殺釘螺蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis. AOh-Ol的基本特征A.形態(tài)學(xué)特征Bacillus thuringiensis. AOh-Ol的細胞形態(tài)為桿狀，產(chǎn)生橢圓 形芽孢和菱形伴孢晶體。B.培養(yǎng)特征Bacillus thuringiensis ssp. AOh-Ol牛肉膏-蛋白胨瓊脂平板培 養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)24小時，形成針尖大小的淺黃色小菌落，邊緣平滑，培養(yǎng)72小時，形成圓盤 狀菌落，乳白色，邊緣不整齊，表面似毛玻璃，有皺紋。C. H血清型以AOh-Ol的鞭毛抗原與Bt的標(biāo)準(zhǔn)抗血清進行凝集反應(yīng)試驗，AOh-Ol 的H血清型為H27。 D.生化特性按Barjac的經(jīng)典方法進行生理生化試驗，其生理生化特征如表一所示。
表一蘇云金芽孢桿菌AOh-Ol菌株的生理生化特征
水解淀粉+++
禾_檸檬鹽+NTNT
還原NCh-NO2十++
1周內(nèi)脫苯丙氨酸_NTNT
溶血試驗+++
甲基紅反應(yīng)++“
明膠水解試驗+++
吲哚試驗_—_
脲酶水解____a.對照分別為血清型27型標(biāo)準(zhǔn)菌株和Bt subsp. kurstaki ；NT,未檢測。E.生物活性經(jīng)毒力生物測定，菌株AOh-I對湖北釘螺有較高毒殺作用，其72h的
發(fā)酵上清液感染24h后對釘螺的致死率在50%以上，使用透析袋濃縮后殺螺效果進一步提
高，超過80%，發(fā)酵液經(jīng)pHl-14處理一個小時后，殺螺活性有所降低，用SDS處理一個
小時也會降低殺螺活性(表二)。菌株AOh-Ol產(chǎn)生的殺螺活性成分對溫度比較穩(wěn)定，經(jīng)100°C處理一個小時后，活
性幾乎保持不變(表三)。菌株AOh-Ol的殺螺活性物質(zhì)在培養(yǎng)8h時就已經(jīng)產(chǎn)生，在40h左
右濃度最高，隨后略有下降，但殺螺活性波動不大(表四)。采用3. 5kd透析袋對發(fā)酵上清液進行透析處理后，透析液和透析保留液對釘螺均具有活性，說明活性成分分子量應(yīng)該在3500以下，發(fā)酵上清液經(jīng)121 °C，20min滅菌處理后， 活性下降明顯(表五)。表二理化因素對AOh-Ol殺螺活性的影響 表三溫度處理對菌株AOh-Ol殺螺活性的影響 a.發(fā)酵72h后，發(fā)酵液于不同溫度下均處理Ih表四不同培養(yǎng)時間對AOh-Ol上清液的殺螺活性 表五透析和滅菌處理后AOh-Ol上清液的殺釘螺活性F.發(fā)酵性能菌株AOh-Ol易于培養(yǎng)，發(fā)酵性能優(yōu)良，在合適的發(fā)酵條件下生長整 齊，發(fā)酵周期短。發(fā)明的優(yōu)點和效果中國是血吸蟲病的多發(fā)地區(qū)。中國慢性血吸蟲病病人一直持續(xù)在80萬人左右，大部分重流行區(qū)的血吸蟲病人畜感染率在3%至5%，局部地區(qū)血吸蟲病人畜感染率可高達 68%。中國血吸蟲病的防治工作所面臨的嚴(yán)峻形勢是病人數(shù)居高不下，釘螺擴散嚴(yán)重，新 疫區(qū)不斷增加，血吸蟲病向城市蔓延。在我國，傳播日本血吸蟲的湖北釘螺是日本血吸蟲的 唯一中間宿主，因此，篩選出對湖北釘螺有高效的蘇云金芽孢桿菌并運用其生產(chǎn)新型殺螺 齊U，是控制和阻斷血吸蟲病傳播的最有效途徑之一，具有現(xiàn)實意義和緊迫性。蘇云金芽孢桿菌AOh-Ol具有日本血吸蟲的中間宿主湖北釘螺的特點，國內(nèi)目前尚無殺湖北釘螺的蘇云金芽孢桿菌菌株及商品制劑，因而可利AOh-Ol生產(chǎn)新型蘇云金芽 孢桿菌殺螺劑，使蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑的產(chǎn)品多樣化和系列化，擴大蘇云金芽孢桿菌殺 蟲劑的使用范圍，減少化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染，有效防治釘螺，阻斷血吸蟲的傳播。其安全 性與其它野生蘇云金芽孢桿菌無異，對人、畜及動植物無害，不污染環(huán)境，有良好的經(jīng)濟和 生態(tài)效益。因而，從優(yōu)越而獨特的殺釘螺特性、生產(chǎn)和使用成本低、工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)成熟、對 人和動植物安全、不污染環(huán)境及市場需求等方面考慮，蘇云金芽孢桿菌AOh-Ol有良好的推 廣應(yīng)用前景。
具體實施例方式實施例1 一種滅殺釘螺的蘇云金芽孢桿菌的制備方法，其具體步驟如下A.利用芽孢可耐80或82或85°C的高溫的特性，在80或82或85°C高溫下，用普 通固體細菌培養(yǎng)基倒平板，在30°C下培養(yǎng)3天，分離細菌單菌落。該普通固體細菌培養(yǎng)基的 組成為蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，瓊脂1或1.3或1.5%，用水補充體積至 100ml。B.隨機挑選單菌落涂片，用石碳酸復(fù)紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，篩選能產(chǎn)生 芽孢和晶體的蘇云金芽孢桿菌。C.以湖北釘螺為試螺，對篩選出的蘇云金芽孢桿菌進行毒力生物測定，經(jīng)過比較 毒力致死中量Lc5tl，篩選到該高毒力菌株。根據(jù)該菌株的作用對象，取抗(Anti-)、湖北釘螺 (Oncomelania hupensis)的第一個字母組成其代碼AOh，又因該菌株是從同一死螺樣品中 分離的多株芽孢桿菌中篩選出來的、且編號為01的一株，因此將該蘇云金芽孢桿菌命名為 AOh-Ol (Bacillus thuringiensis. AOh-Ol, CCTCC 保藏號M 2010047)。
權(quán)利要求
一種滅殺釘螺的蘇云金芽孢桿菌，其特征在于蘇云金芽孢桿菌為(Bacillus thuringiensis)AOh-01，CCTCC NOM 2010047。
2.一種滅殺釘螺的蘇云金芽孢桿菌的制備方法，其步驟是A.、利用芽孢可耐80-85°C的高溫的特性，在80-85°C高溫下，用固體細菌培養(yǎng)基倒平 板，在28-30°C下培養(yǎng)2-3天，分離細菌單菌落，所述的固體細菌培養(yǎng)基組成為蛋白胨1%， 牛肉膏0. 5 %，氯化鈉0.5%，瓊脂1.0-1.5%，用水補充體積至IOOml ；B.、隨機挑選單菌落涂片，用石碳酸復(fù)紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，篩選芽孢和晶體 的蘇云金芽孢桿菌；C.以湖北釘螺為試螺，對篩選出的蘇云金芽孢桿菌進行毒力生物測定，經(jīng)過比較毒力 致死中量Lc5tl，篩選到高毒力菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種滅殺釘螺的蘇云金芽孢桿菌及制備方法，蘇云金芽孢桿菌為(Bacillus thuringiensis)AOh-01，CCTCC NOM2010047。其步驟是A、利用芽孢可耐80-85℃的高溫的特性，在80-85℃高溫下，用固體細菌培養(yǎng)基倒平板，在28-30℃下培養(yǎng)2-3天，分離細菌單菌落，所述的固體細菌培養(yǎng)基組成為蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化鈉0.5％，瓊脂1.0-1.5％，用水補充體積至100ml；B、隨機挑選單菌落涂片，用石碳酸復(fù)紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，篩選芽孢和晶體的蘇云金芽孢桿菌。C.以湖北釘螺為試螺，對篩選出的蘇云金芽孢桿菌進行毒力生物測定，經(jīng)過比較毒力致死中量Lc50，篩選出高毒力菌株。該方法簡單、成本低、易于實施，該菌株對釘螺有高效特異性的毒殺作用，但對人、畜和環(huán)境安全。
文檔編號C12N1/20GK101838624SQ20101012830
公開日2010年9月22日 申請日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日
發(fā)明者劉朋明, 吳燕, 樊鴻宇, 高梅影 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所