專利名稱：用于分離非常小的胚胎樣(vsel)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
當(dāng)前披露的主題總體上涉及從骨髓、臍帶血、和/或其它來(lái)源分離的干細(xì)胞(在本文中被稱為非常小的胚胎樣(very small embryonic-like) (VSEL)干細(xì)胞)群的鑒定、分離及應(yīng)用。更具體地，當(dāng)前披露的主題涉及分離所述VSEL干細(xì)胞并且(任選地在體外處理后)將其用于治療需要其的受試者中的組織和/或器官損傷。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞和干細(xì)胞衍生物的應(yīng)用已經(jīng)在醫(yī)藥研究中，尤其在提供用于治療由于遺傳缺陷、創(chuàng)傷、和/或疾病過(guò)程的任何一個(gè)造成的組織損傷的試劑領(lǐng)域中獲得提高的興趣。理想地，能夠分化為受影響的細(xì)胞類型的細(xì)胞可以被移植入需要其的受試者中，其中它們將與器官微環(huán)境相互作用并供應(yīng)必須的細(xì)胞類型以修復(fù)損傷。已經(jīng)付出了相當(dāng)多的努力以從大量不同的組織中分離干細(xì)胞用在再生醫(yī)藥中。例如，授予I^sukamoto et al.的美國(guó)專利No. 5，750，397披露了據(jù)報(bào)道能夠分化為淋巴細(xì)胞、 紅細(xì)胞(erythroid)、和髓細(xì)胞單核細(xì)胞(myelomonocytic)譜系的人類造血干細(xì)胞的分離和生長(zhǎng)。授予Bruder et al.的美國(guó)專利No. 5，736，396披露了用于在合適的生長(zhǎng)和/或分化因子的影響下分離的人類間充質(zhì)干細(xì)胞的譜系定向分化的方法。隨后可以將所述得到的細(xì)胞引入宿主用于間充質(zhì)組織再生或修復(fù)。強(qiáng)烈感興趣的一個(gè)領(lǐng)域涉及胚胎干(EQ細(xì)胞的應(yīng)用，其已經(jīng)在小鼠中顯示具有分化為動(dòng)物的所有不同的細(xì)胞類型的潛能。小鼠ES細(xì)胞源自胚泡期的早期小鼠胚胎的內(nèi)細(xì)胞群的細(xì)胞，并且其它多能和/或全能細(xì)胞已經(jīng)從胚(germinal)組織(如原始生殖細(xì)胞；PGC)分離。這些多能和/或全能干細(xì)胞以未分化狀態(tài)在體外增殖、保持10正常核型、 以及保持分化為全部的三個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層及外胚層)的衍生物的潛能的能力使得這些細(xì)胞作為細(xì)胞的潛在來(lái)源用在出生后受試者的再生治療中是有吸引力的。人類ES(hES)細(xì)胞的開(kāi)發(fā)還不及對(duì)小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行的進(jìn)展成功。Thomson et al.報(bào)道了來(lái)自低等靈長(zhǎng)類(美國(guó)專利 No. 5，843，780 ;Thomson et al. (1995)92 Proc Natl Acad Sci USA 7844-7848)、以及來(lái)自人類(Thomson et al. (1998)282 Science 1145-1147)的多能干細(xì)胞。Gearhart et al.產(chǎn)生了來(lái)自胎兒性腺組織的人類胚胎生殖(hEG)細(xì)胞系(Shamblott et al. (1998)95 Proc Natl Acad Sci USA 13726-13731 ；及美國(guó)專利No. 6，090，622)。hES和hEG細(xì)胞均具有多能干細(xì)胞的理想特征，在于它們能夠在體外增殖而不分化，它們通常維持正常的核型，并且它們?nèi)匀荒軌蚍只癁槎喾N不同的細(xì)胞類型。 無(wú)性(clonally)來(lái)源的人類胚胎干細(xì)胞系在培養(yǎng)中長(zhǎng)期維持多能性和增殖潛能(Amit et al. (2000)227 Dev Biol 271—278)。ES細(xì)胞或其它多能細(xì)胞用于受試者中再生治療的一個(gè)重大挑戰(zhàn)是控制細(xì)胞生長(zhǎng)和分化為受試者治療所需的特定細(xì)胞類型。已有許多生長(zhǎng)因子對(duì)ES細(xì)胞分化的影響的報(bào)道。例如，Schuldiner et al.報(bào)道了八種生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞從hES細(xì)胞分化為不同細(xì)胞類型的影響(參見(jiàn)khuldiner et al. (2000)97 Proc Natl Acad Sci USA 11307-11312)。如其中所披露的，在開(kāi)始通過(guò)胚狀體樣(embryoid body-like)形成的分化后，在bFGF、TGFPI、 活化素-A、BMP-4、HGF、EGF、PNGF、或視黃酸的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。每種生長(zhǎng)因子對(duì)分化途徑具有獨(dú)特的影響，但是沒(méi)有生長(zhǎng)因子排他地指導(dǎo)分化為一種細(xì)胞類型。理想地，能夠從受試者分離和純化干細(xì)胞和/或前體細(xì)胞是有益的，所述細(xì)胞能夠在被再引入受試者用于治療目的之前被純化和/或體外處理。受試者的自身細(xì)胞的應(yīng)用將消除采用輔助免疫抑制治療的需要，由此維持受試者免疫系統(tǒng)的能力。然而，用于分離ES 細(xì)胞系，尤其是hES細(xì)胞系的目前的策略排除了從受試者分離細(xì)胞并將它們?cè)僖胂嗤氖茉囌?。因此，?duì)于來(lái)自成年動(dòng)物的其它干細(xì)胞類型的研究在繼續(xù)。例如，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一種這樣的細(xì)胞類型。已經(jīng)顯示MSC具有分化為包括骨(Haynesworth et al. (1992) 13 Bone 81-88)、軟骨(Mackay et al. (1998)4 Tissue Eng 415-28 ；Yoo et al. (1998)80 J Bone Joint Surg Am 1745-57)、脂肪組織(Pittenger et al. (2000)251 Curr Top Microbiol Immunol-11)、腱(Young et al. (1998)16 J Orthop Res 406-13)、肌肉及基質(zhì)(Caplan et al. (2001)7 Trends Mol Med 259-64)的多個(gè)譜系的潛能。另一細(xì)胞群，多能成年祖細(xì)胞(MAPC)也已經(jīng)從骨髓純化(BM ；Reyes et al. (2001)98 Blood 25 261 5-2625 ；Reyes & Vetfaillie 0001) 938 Ann NY Acad Sci 231-23 。這些細(xì)胞已經(jīng)顯示能夠在體外擴(kuò)展為超過(guò)100次的群體倍增(100 population doubling)而沒(méi)有端?？s短或核型異常的發(fā)生。已經(jīng)顯示MAPC在限定的培養(yǎng)條件下能夠分化為各種間充質(zhì)細(xì)胞30類型(如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及骨骼成肌細(xì)胞)、內(nèi)皮、神經(jīng)外胚層細(xì)胞、以及更最近的，分化為肝細(xì)胞(Sctiwartz et al. (2000) 109 J Clin Invest 1291-130 。此外，已報(bào)道造血干細(xì)胞(HSC)能夠分化為多種細(xì)胞類型。已報(bào)道BM造血干細(xì)胞能夠“轉(zhuǎn)分化(transdifferentiate) ” 為表達(dá)早期心(Orlic et al. (2003)7 Pediatr Transplant 86-88 ；Makino et al. (1999) 103 J Clin Invest 697-705)、骨骼肌(Labarge & BlaiK2002) 111 Cell 589-601 ；Corti et al. (2002)277 Exp Cell Res 74-85)、神經(jīng)(&inchez-Ramos^002)69 Neurosci Res 880-893)、肝(Petersen et al. (1999)284 Science 1168-1170)、或胰腺細(xì)胞(lanus et al. (2003) 111 J Clin Invest 843-850 ；Lee & Stoffel (2003) 111 J Clin Invest 799-801)標(biāo)記物的細(xì)胞。在人類體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中還表明 CD34+外周血(PB)干細(xì)胞的移植導(dǎo)致供體-來(lái)源的肝細(xì)胞(Korbling et al. (2002)346 N Engl J Med 738-746)、上皮細(xì)胞(Korbling et al. (2002)346 N Engl J Med 738-746)、和神經(jīng)元(Hao et al. (2003) 12 J Hematother Stem Cell Res 23-32)的出現(xiàn)。此外，已顯示人類BM-來(lái)源的細(xì)胞有助于梗塞的心肌的再生(Stamm et al. (2003)361 Lancet 45-46)。這些報(bào)道已經(jīng)被解釋為成年干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化或可塑性現(xiàn)象存在的證據(jù)。然而， 成年組織特異性干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化的概念目前在科學(xué)和醫(yī)藥界內(nèi)是廣泛爭(zhēng)議的主題(參見(jiàn)，如，Lemischka (2002) 30 Exp Hematol 848-852 ；Holden & Vogel (2002) 296 Science 2U6-2129)。試圖再生的研究結(jié)果表明借助神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是不成功的(Castro et al. (2002)297 Science 1299)。還顯示肌肉組織中發(fā)現(xiàn)的造血干/祖細(xì)胞(HSPC)起源于 BM(Mckinney-Freeman et al. (2002)99 Proc Natl Acad Sci USA 1341-1346 ；Geiger et al. 100 Blood 721-723 ；Kawada & Ogawa(2001)98 Blood 2008-2013)。此外，借助涉及單獨(dú)的HPC移植入致命照射的小鼠的嵌合動(dòng)物的研究表明循環(huán)HPSC和/或它們的子代的轉(zhuǎn)分化和/或可塑性(如果其確定存在)是極稀有的事件(Wagers et al. (2002)297 Science 2256-2259)。因此，持續(xù)存在產(chǎn)生適于多種應(yīng)用(包括但不限于治療多個(gè)器官和/或組織的損傷和/或疾病)的可移植細(xì)胞群的新方法的需要。發(fā)明概述本概述部分列出了當(dāng)前披露的主題的幾個(gè)實(shí)施方式，并且在許多情況下列出了這些實(shí)施方式的變體和改變。本概述部分僅是許多和改變的實(shí)施方式的示例。提及的給定實(shí)施方式的一個(gè)或更多個(gè)代表性特征同樣是示例性的。這樣的實(shí)施方式通?？梢园殡S或不伴隨提及的特征而存在；同樣地，那些特征可以應(yīng)用到當(dāng)前披露的主題的其它實(shí)施方式，不管在本概述部分中是否列出。為了避免過(guò)多重復(fù)，本概述部分沒(méi)有列出或建議這樣的特征的所有可能組合。當(dāng)前披露的主題提供了用于從非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞或其衍生物的群體形成胚狀體樣球體的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的CD45_細(xì)胞群；以及(b)在包含誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個(gè)或更多個(gè)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)VSEL干細(xì)胞或其衍生物達(dá)足以使胚狀體樣球體形成的時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，VSEL干細(xì)胞或其衍生物包含⑶34+/lin_/⑶45_或ka-1+/ IirT/⑶45_非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，VSEL干細(xì)胞的直徑約為 3-4 μ m，表達(dá)SSEA-I、0ct-4、Rev-l、和Nanog的至少一種，具有由細(xì)胞質(zhì)的窄緣圍繞的大細(xì)胞核，并且具有開(kāi)放型染色質(zhì)(常染色質(zhì))。在一些實(shí)施方式中，包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的CD45_細(xì)胞群從人或從小鼠分離。在一些實(shí)施方式中，包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的 CD45—細(xì)胞群從人或小鼠中選自骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合的來(lái)源分離。在一些實(shí)施方式中，誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個(gè)或更多個(gè)生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2及其組合。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)將VSEL 干細(xì)胞或其衍生物與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)將所述一個(gè)或更多個(gè)因子提供給VSEL干細(xì)胞或其衍生物。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括通過(guò)下述方法分離包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的CD45_細(xì)胞群，所述方法包括下述步驟(a)提供懷疑包含CD45_干細(xì)胞的初始細(xì)胞群；(b)將所述初始細(xì)胞群與對(duì)于CD45特異的第一抗體和對(duì)于CD34或特異的第二抗體接觸，接觸條件足以允許每個(gè)抗體與其在初始細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合；(c)選擇為⑶34+或ka-Γ、并且⑶45_的細(xì)胞的第一亞群；(d)將所述細(xì)胞的第一亞群與對(duì)于一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的一個(gè)或更多個(gè)抗體接觸，接觸條件足以允許每個(gè)抗體與其在細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合，所述標(biāo)記物選自 CD45R/B220、Gr-l、TCRa β、TCR γ δ、CDllb 及 Ter-119 ； (e)從所述細(xì)胞的第一亞群去除結(jié)合到步驟(d)的抗體的至少一個(gè)的那些細(xì)胞；以及(f)收集為0034+/1^/^045_或 ka-r/lirT/⑶45_的細(xì)胞的第二亞群，由此分離⑶45_干細(xì)胞的亞群。在一些實(shí)施方式中， 每個(gè)抗體包含可檢測(cè)的標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，所述可檢測(cè)的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記或者可以通過(guò)包含熒光標(biāo)記的試劑被檢測(cè)的部分。在一些實(shí)施方式中，所述分離包括FACS分類 (sorting)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離為C-met+、C-kit+、和/或 LIF-R+的那些細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離表達(dá)選自SSEA-1、 Oct-4、Rex-I及Nanog的一個(gè)或更多個(gè)基因的那些細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞群包括骨髓樣品、臍帶血樣品、或外周血樣品。在當(dāng)前披露的主題的一些實(shí)施方式中，在用足以將包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì)胞從骨髓遷移到受試者的外周血的量的遷移劑處理受試者后，將所述細(xì)胞群從受試者的外周血分離。在一些實(shí)施方式中，所述遷移劑包括粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4 拮抗劑的至少一種。在一些實(shí)施方式中，CXCR4拮抗劑是T140肽。在一些實(shí)施方式中，所述受試者是小鼠。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括將干細(xì)胞的亞群與結(jié)合到CXCR4 的抗體接觸以及從干細(xì)胞的亞群分離為CXCR4+的那些細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離為CXCR4+和/或AC133+的那些細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括選擇為HLA_DR_、MHCI類_、⑶90_、 ⑶四―、⑶105—、或其組合的那些細(xì)胞。當(dāng)前披露的主題還提供了包含多個(gè)非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞的胚狀體樣球體。當(dāng)前披露的主題還提供了包含本文披露的胚狀體樣球體的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方式中，本文披露的胚狀體樣球體在包含誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個(gè)或更多個(gè)因子的培養(yǎng)基中提供。當(dāng)前披露的主題還提供了將非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞分化為感興趣的細(xì)胞類型的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體；以及(b)在包含分化誘導(dǎo)量的一個(gè)或更多個(gè)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體樣球體直到培養(yǎng)基中出現(xiàn)感興趣的細(xì)胞類型，所述因子誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物分化為感興趣的細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型是神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物。在一些實(shí)施方式中，神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物選自少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元。在一些實(shí)施方式中，所述神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自GFAP、巢蛋白、β III 微管蛋白、Oligl及01ig2的標(biāo)記物。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)持續(xù)至少約10天。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含約10ng/ml rhEGF、約20ng/ml FGF-2及約20ng/ml NGF0 在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為內(nèi)胚層細(xì)胞或其衍生物。在一些實(shí)施方式中， 所述培養(yǎng)包括在包含活化素A的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體樣球體；以及其后在包含N2補(bǔ)充物-A、B27補(bǔ)充物及約IOmM煙酰胺的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體樣球體。在一些實(shí)施方式中， 在第一培養(yǎng)基中的培養(yǎng)持續(xù)約48小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，在第二培養(yǎng)基中的培養(yǎng)持續(xù)至少約12天。在一些實(shí)施方式中，內(nèi)胚層細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自Nkx6. 1、Pdxl及C-肽的標(biāo)記物。在一些實(shí)施方式中，感興趣的細(xì)胞類型為心肌細(xì)胞或其衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)持續(xù)至少約15天。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Dl的組合，數(shù)量足以造成胚狀體樣球體細(xì)胞的亞組分化為心肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述心肌細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自Nsx2. 5/Csx和 GATA-4的標(biāo)記物。在當(dāng)前披露的方法的一些實(shí)施方式中，所述胚狀體樣球體通過(guò)下述制備(a)提供包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_細(xì)胞群；以及(b)在包含一個(gè)或更多個(gè)誘導(dǎo)VSEL細(xì)胞的胚狀體樣球體形成的因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)VSEL干細(xì)胞足以使胚狀體樣球體出現(xiàn)的時(shí)間。當(dāng)前披露的主題還提供了包含在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑中的本文披露的分化的非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞的制劑。在一些實(shí)施方式中，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑用于人類中是可接受的。當(dāng)前披露的主題還提供了用于治療受試者中組織損傷的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括給予受試者一種組合物，該組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的多個(gè)分離的⑶45_干細(xì)胞，所述⑶45_干細(xì)胞包含VSEL干細(xì)胞，數(shù)量和經(jīng)由的途徑足以允許 ⑶45_干細(xì)胞群的至少一部分移植入(engraft)所述組織并且在其中分化，由此治療損傷。 在一些實(shí)施方式中，所述損傷選自缺血性損傷、心肌梗塞及中風(fēng)。在一些實(shí)施方式中，受試者為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物選自人類和小鼠。在一些實(shí)施方式中， 包含VSEL干細(xì)胞的分離的CD45_干細(xì)胞從選自骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合的來(lái)源分
1 O在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分化分離的⑶45—干細(xì)胞以在給予受試者所述組合物之前產(chǎn)生預(yù)定的細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方式中，所述預(yù)定的細(xì)胞類型選自神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞、心肌細(xì)胞及其衍生物。當(dāng)前披露的主題還提供了用于產(chǎn)生嵌合動(dòng)物的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括將一個(gè)或更多個(gè)包含VSEL干細(xì)胞的CD45_干細(xì)胞群添加到胚胎，從而一個(gè)或更多個(gè) CD45—干細(xì)胞發(fā)育為胚胎的一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方式中，所述添加包括將一個(gè)或更多個(gè)CD45—干細(xì)胞注射入胚泡期胚胎的囊胚腔。在一些實(shí)施方式中，所述添加包括聚集(aggregating)包含VSEL干細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)⑶45_干細(xì)胞與桑葚胚期胚胎。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括在加入一個(gè)或更多個(gè)包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì)胞后孕育胚胎至少直到出生，以提供嵌合動(dòng)物。當(dāng)前披露的主題還提供了從0045_干細(xì)胞群純化非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞中感興趣的細(xì)胞類型的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì)胞群；(b)鑒定表達(dá)VSEL干細(xì)胞的標(biāo)記物的⑶45_干細(xì)胞的亞群；以及(c)純化所述亞群。在一些實(shí)施方式中，所述群和所述亞群除了為⑶45_外，均為⑶34+/CXCR4+/ 1土11_或^^-171111_。在一些實(shí)施方式中，包含VSEL干細(xì)胞的CD45_干細(xì)胞群從選自骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合的來(lái)源分離。在一些實(shí)施方式中，感興趣的細(xì)胞類型選自骨骼肌細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素細(xì)胞及內(nèi)胚層細(xì)胞。 在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物選自GFAP、巢蛋白、β III微管蛋白、Oligl、01ig2、Myf5, MyoD,成肌蛋白(Myogenin)、Nsx2. 5/Csx、GATA-4、甲胎蛋白(α -Fetoprotein)、CK19、 Nkx2-3、Tcf4、Nkx 6. l、Pdxl、VE-鈣粘蛋白、Krt 2-5,Krt 2_6a、BNC、DCT、TYR 及 TRP。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為心肌細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自Nkx2. 5/Csx、GATA-4、 MEF2C。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為內(nèi)皮細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自VEGFR2、 VE-鈣粘蛋白、血管性血友病因子(von Willebrand factor)及TIE2。在一些實(shí)施方式中， 所述感興趣的細(xì)胞類型為骨骼肌細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自Myf5、MyoD及成肌蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為肝細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自甲胎蛋白和CK19。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為神經(jīng)細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自β III微管蛋白、Oligl、 01ig2、GFAP及巢蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為胰腺細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自Nkx6. 1和Pdxl。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為黑色素細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自DCT、TYR及TRP。當(dāng)前披露的主題還提供了用于鑒定胚狀體樣球體形成的誘導(dǎo)劑的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)從已知包含誘導(dǎo)劑的細(xì)胞制備包含多個(gè)cDNA克隆的cDNA文庫(kù)；(b)用所述cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化不包含所述誘導(dǎo)劑的多個(gè)細(xì)胞；(c)在足以造成VSEL干細(xì)胞或其衍生物形成胚狀體樣球體的條件下，在轉(zhuǎn)化的多個(gè)細(xì)胞存在下，培養(yǎng)多個(gè)VSEL干細(xì)胞或其衍生物；(d)分離包含所述誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；(e)從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞回收cDNA克隆；以及(f)鑒定由回收的cDNA克隆編碼的多肽，由此鑒定胚狀體樣球體形成的誘導(dǎo)劑。在一些實(shí)施方式中，已知包括誘導(dǎo)劑的細(xì)胞為C2C12細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)cDNA克隆包含位于克隆載體(cDNA克隆被插入其中)中cDNA克隆位點(diǎn)的至少一側(cè)的側(cè)翼的至少一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括利用雜交到位于cDNA克隆位點(diǎn)的兩側(cè)的側(cè)翼的引物位點(diǎn)的引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中存在的cDNA克隆。在一些實(shí)施方式中，所述鑒定是通過(guò)對(duì)cDNA克隆的測(cè)序。當(dāng)前披露的主題還提供了從臍帶血或其部分(fraction)分離包含VSEL干細(xì)胞的CD45—干細(xì)胞的亞群的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)將臍帶血或其部分與對(duì)于CD45特異的第一抗體和對(duì)于CD34或特異的第二抗體接觸，接觸條件足以允許每個(gè)抗體與其在細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合；(b)選擇為CD34+或 ka-Γ、并且為⑶45—的細(xì)胞的第一亞群；(c)將細(xì)胞的第一亞群與對(duì)于選自⑶45R/B220、 Gr-U TCRa β , TCR γ δ、⑶lib及Ter_119的一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的一個(gè)或更多個(gè)抗體接觸，接觸條件足以允許每個(gè)抗體與其在細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合；(d)從細(xì)胞的第一亞群去除結(jié)合到步驟(d)的抗體的至少一個(gè)的那些細(xì)胞；以及(e)收集為⑶34+/lin7⑶45_或ka-l+/lin7⑶45_的細(xì)胞的第二亞群，由此分離包含 VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì)胞的亞群。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括在低滲溶液中孵育臍帶血或其部分或所述任何亞群達(dá)到足以基本上裂解可能存在的所有紅細(xì)胞(erythocyte)的時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離對(duì)于CXCR4、 c-met、c-kit、或LIF-R的至少一種為陽(yáng)性的那些細(xì)胞。因此，當(dāng)前披露的主題的一個(gè)目的是提供新的干細(xì)胞群，以及制備和應(yīng)用其的方法。這個(gè)目的和其它目的全部或部分通過(guò)當(dāng)前披露的主題實(shí)現(xiàn)。
當(dāng)前披露的主題的一個(gè)目的已經(jīng)在上面陳述，其他目的將隨著描述的繼續(xù)以及結(jié)合下述實(shí)施例和附圖而變得顯而易見(jiàn)。根據(jù)一些實(shí)施方式，提供了源自人類的成人(adult)器官或組織細(xì)胞的非常小的胚胎樣干細(xì)胞(VSEL)的富集群體，其中所述群體這樣富集通過(guò)就 ⑶133+CXCR4+⑶34+LirTCD45-細(xì)胞來(lái)選擇細(xì)胞以獲得靶(target) VSEL的富集群體。在一些實(shí)施方式中，所述VSEL源自血液(例如，臍帶血、外周血)。所述靶VSEL是Oct-4+、Nanog+ 和/或SSEA+。在一些實(shí)施方式中，所述靶VSEL在細(xì)胞核中表達(dá)Oct-4蛋白，并且在表面上表達(dá)SSEA抗原。在一些實(shí)施方式中，所述靶VSEL表達(dá)選自下列的原始生殖細(xì)胞(PGC)標(biāo)志物胎兒型堿性磷酸酶、OctA, SSEA-U CXCR4、Mvh、Stella、Fragilis, Nobox 和 Hdac6。 在一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)就大小為2至6μπι或大小為2至4μπι的細(xì)胞進(jìn)行選擇而富集VSEL的富集群體?？梢酝ㄟ^(guò)就含有原始的非結(jié)構(gòu)化的(primitive unorganized)常染色質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)行選擇而富集VSEL的群體。優(yōu)選地，在VSEL的富集群體中，至少25% (例如 30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% )的細(xì)胞是革巴VSEL。根據(jù)一些實(shí)施方式，提供了產(chǎn)生細(xì)胞群體的方法，所述細(xì)胞群體就來(lái)自人類血液(例如，臍帶血、外周血)的靶非常小的胚胎樣干細(xì)胞(VSEL)進(jìn)行了富集，包括裂解 (Iysing)血液以除掉紅細(xì)胞和制備LinTD45_CD133+細(xì)胞的富集群體。根據(jù)一些實(shí)施方式，提供了產(chǎn)生細(xì)胞群體的方法，所述細(xì)胞群體就來(lái)自人類血液 (例如，臍帶血、外周血)的靶非常小的胚胎樣干細(xì)胞(VSEL)進(jìn)行了富集，包括i)裂解血液以除掉紅細(xì)胞；ii)制備⑶133+細(xì)胞的富集群體；和iii)制備LinTD45_CD133+的富集群體?？梢酝ㄟ^(guò)使用免疫磁珠就CD133+細(xì)胞富集VSEL的群體?？梢酝ㄟ^(guò)熒光激活的細(xì)胞分選就LinTD45_CD133+細(xì)胞富集VSEL的群體。在一些實(shí)施方式中，可以在低滲的氯化銨溶液中裂解血液以除掉紅細(xì)胞。


圖IA 和 IB 描繪了 Sca-l+/lin7CD45-和 Sca-l+/lin7CD45+ 細(xì)胞的透射電子顯微鏡(TEM)圖像。圖IA顯示ka-r/lirT/⑶45_細(xì)胞較小并且測(cè)量的直徑為3_4 μ m。它們具有由細(xì)胞質(zhì)的窄緣圍繞的較大細(xì)胞核。在超微水平上，細(xì)胞質(zhì)的窄緣具有一些線粒體、分散的核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的小輪廓、以及一些囊泡。細(xì)胞核被包含在具有核孔的核膜內(nèi)。染色質(zhì)松散地壓縮并由常染色質(zhì)構(gòu)成。圖IB顯示與之相反，Sca-Γ/lirT/⑶45+細(xì)胞表現(xiàn)為異源形態(tài)并且較大。它們的平均測(cè)量直徑為8-10 μ m，并具有分散的染色質(zhì)和突出的核仁。圖2描繪了熒光顯微圖像，描繪了對(duì)^^-171化7⑶45_細(xì)胞的表達(dá)研究的結(jié)果并表明Sca-l+/lin7CD45_細(xì)胞是SSEA-Γ并表達(dá)0ct_4和Nanog。如左側(cè)所示，通過(guò)FACS分離的ka-l7lin_/CD45_細(xì)胞被評(píng)估SSEA-1、Oct-4及Nanog的表達(dá)。所有的圖像在Plan Apo 60XA/1. 40 油性物鏡(Nikon，Japan)下采集。右側(cè)示出了在 ADOBE PHOTOSHOP CS 軟件(Adobe System Incorporated, San Jose, California, United States of America) 中進(jìn)行的代表性細(xì)胞(箭頭)的IOx放大的圖像。陰性染色對(duì)照未示出。對(duì)從四個(gè)獨(dú)立類別分離的細(xì)胞進(jìn)行染色。示出了代表性數(shù)據(jù)。
圖3A-3C 描繪了對(duì) ka-l+/lin7CD45-的 CXCR4、c-met 和 LIF-R 的表達(dá)研究的結(jié)果圖3A描繪了 RT-PCR產(chǎn)物在其上分離并用溴化乙錠染色的凝膠的圖像，并描繪了 Sca-l7lin7CD45"中對(duì)于 CXCR4 (泳道(lane) 1)、c_Met (泳道 3)和 LIF-R (泳道 5)的 mRNA 的表達(dá)結(jié)果。RT-PCR進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。陰性RT-PCR反應(yīng)(DNA代替cDNA 泳道2、4和6)。 示出了來(lái)自三個(gè)獨(dú)立的類別的代表性結(jié)果。圖:3B描繪了通過(guò)FACS分離并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色評(píng)估CXCR4、c-Met和LIF-R的表達(dá)的ka-r/lirT/⑶45_細(xì)胞的熒光顯微圖像(在 Plan Apo 60XA/1. 40油性物鏡(Nikon, Japan)下采集圖像)。未示出陰性染色對(duì)照。示出了來(lái)自四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖3C是描繪了通過(guò)包含SDF-I或不包含SDF-I (陰性對(duì)照)的MATRIGEL 滴狀物的ka-l+/lin7⑶45—細(xì)胞的化學(xué)引誘研究結(jié)果。示出了每 100 μ m的MATRIGEL 滴狀物周長(zhǎng)的化學(xué)引誘的ka-l+/lin7⑶45—細(xì)胞的數(shù)量。從三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)收集數(shù)據(jù)。*與對(duì)照MATRIGEL 相比ρ < 0. 00001。圖4Α和4Β描繪了 FACS分類從不同年齡的動(dòng)物分離的ka-l+/lin7CD45_細(xì)胞的結(jié)果。圖4A是從源自3周大(上側(cè))和1歲大的小鼠(下側(cè))的BMMNC分類的細(xì)胞的 FACS點(diǎn)圖。左側(cè)描繪了鼠BMMNC的點(diǎn)圖。作為ka-Γ/Ιin_ (中側(cè))的來(lái)自淋巴門(lymphoid gate)的細(xì)胞通過(guò)對(duì)于CD45表達(dá)的FACS進(jìn)行分類(右側(cè))。進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立的分類實(shí)驗(yàn)(對(duì)于每類8只小鼠的BM被收集)。示出了代表性類別。圖4B是條形圖，描繪了在通過(guò)FACS 分離來(lái)自3周大和1歲大的小鼠的ka-r/lin7⑶45_細(xì)胞中PSC和VSEL干細(xì)胞標(biāo)記物的 mRNA的表達(dá)，并通過(guò)相同數(shù)量的分類細(xì)胞之間的RQ-PCR進(jìn)行比較。進(jìn)行四個(gè)獨(dú)立的分類實(shí)驗(yàn)(對(duì)于每類收集8只小鼠的BM)。數(shù)據(jù)是平均數(shù)士SD。*p<0.01 vs.來(lái)自年老動(dòng)物的細(xì)胞。圖5是條形圖，描繪了來(lái)自具有相對(duì)長(zhǎng)的生命期的小鼠品系(C57BL/6)的細(xì)胞數(shù)量與具有相對(duì)短的生命期的小鼠品系(DBA/2J)的細(xì)胞數(shù)量的比較結(jié)果。所述圖示出了與 C57BL/6小鼠相比，DBAAJ小鼠中ka-l+/lin7CD45_細(xì)胞的數(shù)量減少。通過(guò)相同數(shù)量的分類細(xì)胞之間的RQ-PCR比較通過(guò)FACS從三周大DBA/2J和C57BL/6小鼠分離的ka-l+/lin7 ⑶45—細(xì)胞中PSC和VSEL干細(xì)胞標(biāo)記物的mRNA的表達(dá)。進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立的分類實(shí)驗(yàn)(對(duì)于每類6只小鼠的BM被收集)。數(shù)據(jù)是平均數(shù)士 SD。*p<0.01vs.來(lái)自年老DBA/2J小鼠的細(xì)胞。圖6A和6B描繪了骨髓單核細(xì)胞(BMMNC)的側(cè)群(SP)的分類。圖6A是描繪BMMNC的SP的FACS分類的點(diǎn)圖。圖6B是條形圖，描繪了通過(guò)FACS 從 3 周大的小鼠分離的 BMMNC、SP、SP Sca-l+/lin7CD45\ SP Sca-Γ/1 irT/CD45+、Sca-1+/ lin_/CD45_和Sca-Γ/1 in7CD45+細(xì)胞中的PSC和VSEL干細(xì)胞標(biāo)記物的mRNA的表達(dá)，并通過(guò)相同數(shù)量的分類細(xì)胞之間的RQ-PCR進(jìn)行比較。進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立的分類實(shí)驗(yàn)(對(duì)于每類，8 只小鼠的BM被收集)。數(shù)據(jù)以平均數(shù)士 SD表示。、<0.01 vs.來(lái)自年老動(dòng)物的細(xì)胞。圖7是四個(gè)點(diǎn)圖，描繪了細(xì)胞的多個(gè)亞群的移植結(jié)果和這些細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)期血細(xì)胞生成的貢獻(xiàn)。Sca-r/lin7⑶45—細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)期血細(xì)胞生成沒(méi)有貢獻(xiàn)。Ly5. 2小鼠被移植以來(lái)自 Ly5. 1 小鼠的 IO4 個(gè) Sca-l+/lin7CD45+或 2X104 個(gè) Sca-l+/lin7CD45-細(xì)胞，并且與 IO6 個(gè) BMMNC Ly5. 2細(xì)胞一起移植入Ly5. 2受體小鼠，在移植后8個(gè)月通過(guò)FACS評(píng)估Ly5. 1細(xì)胞的存在。上側(cè)描繪了來(lái)自外周血的MNC的分析。下側(cè)描繪了來(lái)自骨髓的MNC的分析。示出了代表性結(jié)果。圖8A和8B描繪了熒光顯微圖像，描繪了具有對(duì)于SSEA-I (圖8A ;4個(gè)圖板)或 0ct-4(圖8B)特異的抗體的ka-l7lin_/CD45_BM細(xì)胞的ES樣球體的染色。圖9A和9B描繪了在C2C12細(xì)胞上的GFP、ca-l+/lin7CD45-BM細(xì)胞的胚狀體樣球體的形成。圖9A描繪了在實(shí)施例20所述的條件下，共培養(yǎng)^^-171^1_/⑶45_BM細(xì)胞與 C2C12細(xì)胞后胚狀體(EB)-樣球體的顯微圖像。圖9B是描繪ka-l+/lin7⑶45_細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的熒光顯微圖像，表明這些胚狀體源自從綠色免疫熒光陽(yáng)性(GFP+) 小鼠(購(gòu)自 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, United States of Americ 的 C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP) lOsb/J 小鼠)分離的純化 ka-l+/lin7CD45TM 細(xì)胞，并且不是 C2C12細(xì)胞。圖10是從鼠淋巴結(jié)分離的碘化丙啶(propidium iodide)染色的細(xì)胞、HSC(造血干細(xì)胞；Sca-l+/lin7CD45+)或 VSEL 干細(xì)胞(Sca-l7lin_/CD45_)的一系列點(diǎn)圖。圖11A-11G是鼠骨髓細(xì)胞的FACS分析的系列點(diǎn)圖。圖IlA是低滲裂解后鼠骨髓MNC的點(diǎn)圖。圖IlB是示出了來(lái)自Rl門(R1 gate) 用于譜系標(biāo)記物表達(dá)和⑶45抗原的細(xì)胞的染色的點(diǎn)圖。在這個(gè)圖中，R2示出了譜系-和 CD45陰性BM MNC0分析來(lái)自Rl和R2的細(xì)胞的Sca-I的表達(dá)和HLA_DR(參見(jiàn)圖11C)、MHC I類(參見(jiàn)圖11D)、^四(參見(jiàn)圖11E)、⑶90(參見(jiàn)圖11F)及⑶105(參見(jiàn)圖11G)抗原的
共表達(dá)。圖12是來(lái)自VSEL干細(xì)胞衍生的球體(VSEL-DS)的碘化丙啶染色的細(xì)胞的系列點(diǎn)圖。示出了三個(gè)獨(dú)立的代表性實(shí)施例。圖13描繪了對(duì)從D3胚胎干細(xì)胞(ED-D3 ；頂側(cè))形成的胚狀體和從VSEL干細(xì)胞 (底側(cè))形成的胚狀體樣球體進(jìn)行堿性磷酸酶(AP)染色的圖。圖14描繪了熒光顯微圖像，表明VSEL干細(xì)胞衍生的胚狀體樣球體表達(dá)早期胚胎發(fā)育標(biāo)記物如 SSEA-I、GATA-6、GATA-4、F0XD1 及 Nanog。圖15描繪了在VSEL干細(xì)胞衍生的胚狀體樣球體中存在的細(xì)胞的透射電子顯微鏡圖，表明這些細(xì)胞在尺寸上大于它們來(lái)源的初始VSEL干細(xì)胞(圖15，上側(cè))，但仍具有非常原始的包含常染色質(zhì)的細(xì)胞核。圖15的中側(cè)描繪了在用SDF-I、HGF/SF及LIF刺激從VSEL 干細(xì)胞-衍生的胚狀體樣球體分離的細(xì)胞后MAPKp42/44的磷酸化研究結(jié)果，表明相應(yīng)的受體(分別為SDF-1、HGF/SF及LIF)在這些細(xì)胞的表面表達(dá)。并且最后，圖15的下側(cè)描繪了從來(lái)自VSEL干細(xì)胞衍生的胚狀體樣球體的細(xì)胞的連續(xù)傳代分離的細(xì)胞的RT-PCR分析結(jié)果，其揭示了調(diào)節(jié)胚狀體的原腸胚形成的基因GnGATA-6、CdX2、SOX2、HNF3&AFP) WmRNA 的表達(dá)增加。圖16A-16C和圖17A-17D描繪了熒光顯微鏡圖像，描繪了 ES樣球體分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖16A-16C)或神經(jīng)元(圖17A-17D)。細(xì)胞用針對(duì)巢蛋白的抗體染色，其利用 Alexa Fluor 594-標(biāo)記的山羊抗-小鼠IgG第二抗體檢測(cè)，其給予紅色熒光。用抗-綠色熒光蛋白Alexa Fluor 488結(jié)合物檢測(cè)細(xì)胞中存在的GFP (綠色熒光)，并且細(xì)胞核用DAPI 染色(藍(lán)色熒光)。
圖18A-18C描繪了熒光顯微鏡圖像，描繪了 ES樣球體分化為表達(dá)胰腺細(xì)胞的標(biāo)記物(C-肽)的內(nèi)胚層細(xì)胞。圖19A-19C和20A-20D描繪了熒光顯微圖像，描繪了 ES樣球體分化為心肌細(xì)胞。 這些細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)，表明心肌細(xì)胞源于由GFP+Sca-Γ/lirT/⑶45—BM細(xì)胞形成的胚狀體。細(xì)胞用針對(duì)肌鈣蛋白I或α橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白的抗體染色(分別為圖19和 20)，其利用Alexa Fluor 594-結(jié)合的第二抗體檢測(cè)，其給予紅色熒光。用抗-綠色熒光蛋白Alexa Fluor 488結(jié)合物檢測(cè)細(xì)胞中存在的GFP (綠色熒光)，細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色熒光)。圖21A-21C描繪了對(duì)來(lái)自單VSEL干細(xì)胞衍生的球體的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR的結(jié)果， 其表明這些細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞(中胚層；參見(jiàn)圖21Α)、神經(jīng)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞 (外胚層；參見(jiàn)圖21Β)及胰腺或肝細(xì)胞(內(nèi)胚層；參見(jiàn)圖21C)。圖22Α-22Ι描繪了表明培養(yǎng)的細(xì)胞中心臟-特異性抗原的表達(dá)的免疫熒光和透射共聚焦顯微鏡照片。圖22A-22C和22D-22F描繪了其中Sca-l+/lin7CD45TMMNC被培養(yǎng)的培養(yǎng)板的圖像。具有ka-r/lin7⑶45—細(xì)胞的板中的許多細(xì)胞對(duì)于心臟-特異的肌球蛋白重鏈?zhǔn)顷?yáng)性的(圖22B、22C、22E及22F;綠色熒光)。這些心臟-特異性肌球蛋白重鏈-陽(yáng)性的細(xì)胞中的許多對(duì)于心臟肌鈣蛋白I也是陽(yáng)性的(圖22D和22F[箭頭]；紅色熒光)。圖22G-22I 是其中Sca-r/lirT/⑶45+細(xì)胞被培養(yǎng)的培養(yǎng)板的圖像。這些細(xì)胞對(duì)于前述心臟-特異性抗原的表達(dá)基本上是陰性的(參見(jiàn)圖22H)。通過(guò)DAPI染色鑒定圖22A-22I中的每個(gè)的細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)。比例尺=20 μ m。圖23描繪了 ka-r/lin7⑶45_細(xì)胞的FACS分類結(jié)果，表明能夠被分類的這些細(xì)胞的產(chǎn)量隨著供體動(dòng)物的年齡而降低。圖M是描繪作為年齡的函數(shù)的小鼠骨髓中存在的VSEL干細(xì)胞(左側(cè))和HSC (右側(cè))的百分?jǐn)?shù)的兩幅圖。圖25是兩幅圖，描繪了從較老的小鼠分離的VSEL干細(xì)胞形成胚狀體樣球體的能力下降(左側(cè))以及根據(jù)小鼠(細(xì)胞從其分離)的年齡的VSEL干細(xì)胞的培養(yǎng)物中CD45+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)增加(右側(cè))。圖沈?yàn)閺?周大的小鼠(左側(cè))與2.5歲大的小鼠(右側(cè))分離的VSEL干細(xì)胞的不同表達(dá)模式。在左側(cè)中，示出了免疫熒光和透射共聚焦顯微鏡圖像，表明來(lái)自5周大的小鼠的培養(yǎng)的細(xì)胞中不同造血抗原的表達(dá)。在右側(cè)中，示出了在從2. 5歲大的小鼠分離的 VSEL干細(xì)胞中，CD45被表達(dá)并且所述細(xì)胞能夠在甲基纖維素培養(yǎng)基中的第二培養(yǎng)基中生長(zhǎng)造血集落。圖27A-27B描繪了人類臍帶血的FACS分類結(jié)果。圖 27A 示出了 人類 CB 包含表達(dá) CXCR4 (0. 037 士 0. 02 %，η = 9)、 CD34(0. 118士0. 028%,η = 5)及 CD133(0. 018士0. 008%,η = 5)的 lin7CD4511NC 群。圖 27B 表明這些 CXCR47CD133+/CD;M7lin7CD45-細(xì)胞非常小(約 3-5 μ m ；圖 27B，上側(cè))，而 CB-來(lái)源的lin7CD45+造血細(xì)胞較大(> 6 μ m ；圖27B,下側(cè))。圖^A_28C描繪了對(duì)來(lái)自人類臍帶血的分類的細(xì)胞的基因表達(dá)研究結(jié)果。圖28A和286是條形圖，顯示通過(guò)FACS分類的CB-來(lái)源的CXCR4+/CD133+/0^4+/lin7CD45"細(xì)胞、以及 C)(CR47lin7CD45\CD347lin7CD45\ 以及 CD133+/lin7CD457 細(xì)胞高度富集由多能胚胎細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子如Oct-4和Nanog的mRNA。圖28C示出了確認(rèn) FACS分析的RT-PCR結(jié)果。圖四描繪了 CB-VSEL干細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果，表明高度純化的CB-來(lái)源的 CXCR4+/lin_/CD45_細(xì)胞在它們的表面上表達(dá)SSEA-4并且在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)0ct_4和Nanog 轉(zhuǎn)錄因子。圖30描繪了三種不同的CB-VSEL干細(xì)胞的光學(xué)顯微圖片，表明這些細(xì)胞非常小 3-5 μ m,并包含相對(duì)大的細(xì)胞核和具有許多線粒體的細(xì)胞質(zhì)的窄緣。這些細(xì)胞的細(xì)胞核中的DNA包含作為多能胚胎干細(xì)胞的特征的開(kāi)放型常染色質(zhì)。圖31A-31C描繪了光學(xué)顯微圖片，表明來(lái)源于GFP+小鼠的VSEL干細(xì)胞-DS如果被平鋪在補(bǔ)充有IL-3+GM-CSF的甲基纖維素培養(yǎng)基中可以形成小的第二球體(圖31A和 31B)。通過(guò)從初始甲基纖維素培養(yǎng)基的甲基纖維素溶解回收的這些第二球體制備的單細(xì)胞懸浮液，如果再次平鋪在甲基纖維素培養(yǎng)基(圖31B)或血漿凝塊(圖31C)中并由IL-3和 GM-CSF刺激，形成造血集落。這些為造血集落的證據(jù)通過(guò)FACS分析來(lái)自甲基纖維素中生長(zhǎng)的溶解集落的細(xì)胞的CD45表達(dá)或通過(guò)免疫熒光染色來(lái)自血漿凝塊培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的集落的細(xì)胞的⑶45而獲得。圖32是用于從人類臍帶血分離VSEL干細(xì)胞的基于FACS的策略的略圖。圖33.流式細(xì)胞術(shù)分離源自骨髓的ka-l+/Lin-/CD45+造血干細(xì)胞和
Lin-/⑶45-VSEL。代表性的點(diǎn)圖顯示了來(lái)自淋巴門(A)(基于Sca-I (FITC)和譜系標(biāo)記物 (PE) (C)以及⑶45 (APC)的表達(dá))的小細(xì)胞的分類。圖板D顯示了區(qū)域3(R3)含有 Lin-/CD45-VSEL而區(qū)域4(R4)含有ka_l+/lin-/CD45+細(xì)胞。通過(guò)將BMC的分類與具有已知直徑的珠子的分類作比較，圖板B中的FSC軸確認(rèn)了圖板A中的感興趣區(qū)域中的細(xì)胞的非常小的尺寸(2-10μ)。如(R3)所示，總BMC中只有0.02%是VSEL。FSC，前向分散特征；SSC，側(cè)向分散特征。圖34.心肌梗塞尺寸。從小組I-III中的Masson三色染色心臟檢測(cè)的心機(jī)梗塞面積分?jǐn)?shù)([梗塞面積/LV面積]xlOO)，三個(gè)小組分別經(jīng)載體、⑶45+造血干細(xì)胞和VSEL處理。〇，個(gè)體小鼠； ，平均數(shù)士 SEM。圖35.超聲心動(dòng)描記術(shù)檢測(cè)LV的功能。冠狀動(dòng)脈閉塞/重灌注后35天以載體處理(Α、B)、CD45+細(xì)胞處理(C、D)和VSEL處理(Ε、F)的小鼠的代表性的二維(Α、C、Ε)和 M-模式(B、D、F)圖像。箭頭代表梗塞壁(A、C、E)。與載體處理和⑶45+細(xì)胞處理的心臟相比，VSEL處理的心臟顯示出較小的LV腔，較厚的梗塞壁和改善的梗塞壁運(yùn)動(dòng)。圖板G-J證明VSEL的移植改善了 MI之后35天LV心臟收縮功能的超聲心動(dòng)描記術(shù)檢測(cè)。數(shù)據(jù)為平均數(shù) 士SEM。η = 11-14 只小鼠 / 組。*Ρ < 0. 05 vs.第；35 天時(shí)的小組 II ;#P < 0. 05 vs.第 35天時(shí)的小組I ； §P < 0. 05 vs.各個(gè)小組在96小時(shí)之時(shí)的數(shù)值。圖36. LV重塑的形態(tài)測(cè)量學(xué)檢測(cè)。來(lái)自于載體處理(A)、⑶45+造血干細(xì)胞處理 ⑶和VSEL處理(C)的心臟的代表性Masson三色染色心肌部分。分別以藍(lán)色和紅色鑒別出結(jié)痂組織和有活力的(viable)心肌層。注意在VSEL處理的心臟中LV腔較小，梗塞壁較厚。圖板D-H顯示了 LV結(jié)構(gòu)參數(shù)的形態(tài)測(cè)量學(xué)檢測(cè)。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士SEM。η = 11-14 只小鼠/組。< 0. 05 vs.小組II。
圖37.心肌細(xì)胞和左心室肥大的檢測(cè)。圖板A-C顯示了來(lái)自Masson三色染色的經(jīng)載體處理(A)、⑶45+造血干細(xì)胞處理(B)和VSEL處理(C)的心臟的有活力的心肌層中的心肌細(xì)胞的代表性圖像。比例尺=50pm。與⑶45+造血干細(xì)胞處理的心臟不同，VSEL處理的心臟未顯示出增加的肌細(xì)胞剖面面積(與非梗塞對(duì)照心臟(D)相比)。超聲心動(dòng)描記術(shù)估計(jì)的LV質(zhì)量在VSEL處理的心臟(E)中顯著較低。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士SEM。η = 11-14 只小鼠 / 組。D 乍 < 0. 05 vs.小組 II ;#P < 0. 05 vs.對(duì)照；E :*P < 0. 05 vs.小組 II 和 IIK最終的);#P < 0. 05 vs各個(gè)基線值。圖38. VSEL移植和心肌細(xì)胞再生。通過(guò)EGFP (B、D，綠色)和α -橫紋肌 (sarcomeric)輔肌動(dòng)蛋白(C、D，紅色)分別鑒別VSEL和肌細(xì)胞；圖板D顯示了合并區(qū)域。 顯示了對(duì)EGFP(箭頭，B，綠色)和α-橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白(箭頭，C，紅色)均為陽(yáng)性的兩個(gè)肌細(xì)胞。細(xì)胞核以DAPI染色(A、D，藍(lán)色)。比例尺=40μπι。圖39.梗塞區(qū)域中的肌細(xì)胞面積分?jǐn)?shù)的測(cè)定。圖板A-C顯示了 Masson三色染色的經(jīng)載體處理(A)、⑶45+造血干細(xì)胞處理(B)和VSEL處理(C)的心臟的結(jié)痂的代表性例子。放大倍率x600。圖板D中顯示了定量數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士 SEM。η= 11-14只小鼠 / 組。D:*P<0. 05 vs.小組 II。圖40.外周血(PB)中循環(huán)的VSEL的流式細(xì)胞術(shù)分析。在急性MI之后M小時(shí)、 48小時(shí)和7天；在假性手術(shù)(假性對(duì)照)之后M小時(shí)；以及從未經(jīng)處理的小鼠(對(duì)照)，收集PB樣品。使用ka-Ι、譜系標(biāo)記物和⑶45將PB白細(xì)胞(PBL)的全部群體染色。在點(diǎn)圖中顯示PBL，代表它們的前向(FSC)vs.側(cè)向分散特征(SSC)，分別與細(xì)胞內(nèi)容物的大小和粒度/復(fù)雜度相關(guān)。區(qū)域Rl(圖板A)中包括了無(wú)粒的、小的(大小為2-10μπι)事件，其包括 VSEL群體。進(jìn)一步分析來(lái)自區(qū)域Rl的細(xì)胞的Sca-I和譜系標(biāo)記物(Lin)的表達(dá)，在區(qū)域 R2(圖板B)中只包括^^-1+/1^11事件。然后基于⑶45的表達(dá)分析來(lái)自區(qū)域R2的細(xì)胞，將 ⑶45-和⑶45+亞群體顯示于柱狀圖(圖板C，分別為區(qū)域R3和R4)。百分率顯示了每個(gè)亞群體在總PBL中所占的平均含量。根據(jù)FSC，圖板D分別顯示了區(qū)域R5和R6中Sca-I+/ Lin-/CD45-細(xì)胞(VSEL)和ka_l+/Lin-/CD45+細(xì)胞(HSC)的大小。紅色圓圈代表每個(gè)亞群體中細(xì)胞的主要定位。圖41.急性MI之后VSEL運(yùn)動(dòng)的時(shí)間過(guò)程。顯示了 MI之后M小時(shí)、48小時(shí)和7 天，未處理的(對(duì)照)、假性操作(假性對(duì)照)和梗塞小鼠的每微升血液中循環(huán)的Sca-I+/ Lin-/⑶45-VSEL的絕對(duì)數(shù)目。圖板A和B分別代表從6周齡和15周齡小鼠獲得的數(shù)據(jù)。 絕對(duì)數(shù)目是基于VSEL占外周血中PBL和總白細(xì)胞計(jì)數(shù)的百分含量計(jì)算的。數(shù)據(jù)為平均數(shù) + SEM0 ，平均數(shù)；〇，個(gè)體小鼠；*P < 0. 0025 vs.對(duì)照以及假性對(duì)照。圖42.急性MI之后HSC運(yùn)動(dòng)的時(shí)間過(guò)程。圖形顯示了 MI之后M小時(shí)、48小時(shí)和 7天，未處理的(對(duì)照)、假性操作(假性對(duì)照)和梗塞小鼠的每微升血液中循環(huán)的Sca-I+/ Lin-/⑶45+HSC的絕對(duì)數(shù)目。圖板A和B分別代表從6周齡和15周齡小鼠獲得的數(shù)據(jù)。絕對(duì)數(shù)目是基于HSC占PBL和總白細(xì)胞計(jì)數(shù)的百分含量計(jì)算的。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士 SEM。眷，平均數(shù)；〇，個(gè)體小鼠；乍< 0.0025 vs.各個(gè)年齡小組中的對(duì)照以及假性對(duì)照。圖43.來(lái)自急性MI之后的6周齡和15周齡小鼠(分別為圖板A和B)的源自外周血的細(xì)胞中多能標(biāo)記物(Oct-4、Nanog、Rexl、Rifl、Dppal)和造血干細(xì)胞標(biāo)記物Gcl) 的mRNA水平。將從每個(gè)實(shí)驗(yàn)小組的動(dòng)物血液中收集的細(xì)胞匯集在一起以獲得每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均mRNA含量。對(duì)于所有的樣品進(jìn)行一式三份qRT-PCR。將mRNA含量的倍數(shù)增加與對(duì)照進(jìn)行比較?；谌畏磻?yīng)計(jì)算平均值。數(shù)據(jù)顯示為平均數(shù)士SEM。PSC，多能干細(xì)胞。圖44.源自外周血(PB)的VSEL中的0ct_4的表達(dá)。MI之后M小時(shí)從PB分離的運(yùn)動(dòng)的VSEL(下端圖板)和HSC(上端圖板)的代表性的共焦顯微鏡圖像。通過(guò)FACS分離ka-l+/Lin-/CD45-VSEL和ka_l+/Lin-/CD45+HSC然后進(jìn)行免疫染色。上端圖板顯示了 ka-l+/Lin-/CD45+細(xì)胞(HSC)，其對(duì)于CD45 (FITC，綠色熒光，造血細(xì)胞標(biāo)記物)是陽(yáng)性的，對(duì)于0ct-4(TRITC，紅色熒光)是陰性的。下端圖板顯示了 ka-l+/Lin-/CD45-細(xì)胞 (VSEL)，其對(duì)于CD45是陰性的，對(duì)于0ct-4(多能細(xì)胞標(biāo)記物)是陽(yáng)性的。細(xì)胞核以DAPI 染色(藍(lán)色熒光)。Tr，透射圖像。圖45.實(shí)驗(yàn)方案。使用了三組WT小鼠(小組I-III，n = 11-14/組)。在基線超聲波心動(dòng)描記術(shù)四天之后，小鼠進(jìn)行30分鐘的冠狀動(dòng)脈閉塞，然后進(jìn)行重灌注。MI之后48 小時(shí)，小鼠接受心肌內(nèi)注射載體(小組I)、ka-l+/Lin-/⑶45+造血干細(xì)胞(小組II)或 ka-l+/Lin-/CD45-VSEL(小組III)。在細(xì)胞移植后48小時(shí)和MI之后35天重復(fù)超聲波心動(dòng)描記術(shù)。在MI之后35天，處死小鼠以進(jìn)行形態(tài)測(cè)量學(xué)和組織學(xué)研究。圖46. LV重塑的超聲心動(dòng)描記術(shù)檢測(cè)。圖板A和B顯示了 LV尺寸的超聲心動(dòng)描記術(shù)測(cè)量。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士SEM。η = 11-14只小鼠/組。圖47.心肌毛細(xì)血管密度的定量測(cè)定。梗塞邊界區(qū)域(A)和非缺血區(qū)域(B)中的心肌毛細(xì)血管密度。在載體處理的、⑶45+造血干細(xì)胞處理的和VSEL處理的心臟之間沒(méi)有顯著性差異。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士 SEM。η= 11-14只小鼠/組。圖48Α-Β.圖板A-除掉RBC以獲得TNC或麗C成分(fraction)的實(shí)驗(yàn)程序。通過(guò)FACS (熒光激活的細(xì)胞分選)對(duì)CB-VSEL進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖板B-代表性的設(shè)門策略，以對(duì) CB-VSEL和造血干細(xì)胞(HSC)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析和FACS分選。百分率顯示了兩種細(xì)胞成分中的CB-VSEL和HSC的平均含量(平均值士SEM)。圖49.通過(guò)ImageMream系統(tǒng)獲得的源自CB的VSEL和HSC的圖像。每幅照片顯示了細(xì)胞的亮視野圖像，以7-氨基放線菌素D(7-AAD)染色后的細(xì)胞核圖像，以及與下列表面標(biāo)志物的表達(dá)相關(guān)的圖像:Lin (綠色)、⑶45(橙色)和CD133(AC133 ；黃色)。比例尺表示 10 μ m。圖50A-B.圖板A-相對(duì)于新鮮的CB樣品，以兩種RBC消除程序進(jìn)行分離之后，從1 毫升CB獲得的總細(xì)胞數(shù)目。圖板B-可以從分離自1毫升CB的TNC (RBC裂解后)和MNC (以 Ficoll-Paque分離后)獲得的CB-VSEL和HSC的絕對(duì)數(shù)目。數(shù)值顯示為平均值士SEM(P < 0. 05 ；N = 5)。圖51.通過(guò)ImageMream系統(tǒng)獲得的CB-VSEL和HCS的形態(tài)學(xué)特征，包括大小和 N/C比率。細(xì)胞的大小計(jì)算為基于細(xì)胞的亮視野圖像的較短細(xì)胞軸的長(zhǎng)度，N/C比率顯示為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核面積之比，它們分別是基于亮視野和細(xì)胞核圖像計(jì)算的。數(shù)字表示每個(gè)參數(shù)的平均值(平均值士SEM)。圖52A-B.圖板A和B顯示了從CB單元(通過(guò)用于儲(chǔ)存的常規(guī)程序制備并在其解凍之后)回收的CB-VSEL和HSC。數(shù)值表示從處理1毫升CB獲得的兩個(gè)群體的平均絕對(duì)數(shù)目(xl03)(平均值士SEM;N= 5 ；當(dāng)與新鮮CB比較時(shí)，P <0.05)。置于柱形圖內(nèi)的百分率是存在于最初的新鮮CB樣品中的CB-VSEL和HSC的最初數(shù)目的回收百分率。
圖53A-D.圖板A-D顯示了 CD133+/Lin7CD45TB_VSEL的原始亞群的百分含量和形態(tài)學(xué)特征，所述亞群的特征在于共表達(dá)⑶34、Oct-4和SSEA-4抗原。數(shù)值表示通過(guò) ImageStream系統(tǒng)從10次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計(jì)算的平均數(shù)(平均值士SEM)。圖由Imag必tream系統(tǒng)獲得的CB-VSEL亞群的代表性圖像。每幅照片顯示了細(xì)胞的亮視野圖像，以7-AAD染色后的細(xì)胞核圖像，以及表面和核內(nèi)標(biāo)志物的表達(dá)。比例尺表示10 μ m。圖55A-C. Annexin V (AnV)在CB-VSEL和HSC上的結(jié)合，這是由于RBC裂解過(guò)程中釋放的微囊泡轉(zhuǎn)移磷脂酰絲氨酸。圖板A-在RBC裂解之前和之后，CB-VSEL和HSC中的 AnV+細(xì)胞的含量。圖板B-在RBC裂解之前和之后，AnV+細(xì)胞成分中血型糖蛋白A+ (GlyA+) 細(xì)胞的含量。圖板C-RBC裂解之后分選的⑶34+/AnV+/GlyA+的純化的成分的集落生成潛力與通過(guò)FicolI-Paque分離的⑶34+細(xì)胞的對(duì)比。數(shù)字代表平均值(平均值士 SEM)。圖56A-G.通過(guò)FACS分選源自人類UCB衍生的VSEL的設(shè)門策略。通過(guò)FACS從人類UCB有核細(xì)胞(UCB-nucleated cells)的總成分(TNC)中分離UCB-VSEL。圖板A 標(biāo)準(zhǔn)直徑為1、2、4、6、10和15 μ m的預(yù)先確定大小的珠子顆粒。區(qū)域R2包括直徑介于2 μ m的所有物體。圖板B:通過(guò)顯示FSC vs. SSC信號(hào)的點(diǎn)圖顯示源自UCB的TNC。圖板C和D 來(lái)自區(qū)域Rl的細(xì)胞，分別就造血Lin標(biāo)志物表達(dá)以及它們的存活性(通過(guò)7-AAD)對(duì)其進(jìn)行分析。圖板E 基于⑶34和⑶45抗原表達(dá)顯示源自包括區(qū)域R2和R3的門的LirT存活事件。 包括并從區(qū)域R4分選CD133+/Lin7CD45XB-VSEL的群體。圖板F 新鮮分選的UCB-VSEL的純度和存活性分析。圖板G 固定并以7-AAD重新染色細(xì)胞之后，分選的UCB-VSEL成分中的有核細(xì)胞的含量分析。在區(qū)域R6中顯示了 7-AAD+有核的UCB-VSEL。百分率顯示了總 UCB-有核細(xì)胞中指明的細(xì)胞亞群的平均含量。圖57A-D.通過(guò)ISS獲得的UCB-VSEL和HSPC的代表性圖像。圖中顯示了 UCB-VSEL 及其造血對(duì)應(yīng)物的形態(tài)學(xué)特征的比較，包括它們的大小和標(biāo)志物表達(dá)。圖板A 用作大小標(biāo)志物的預(yù)先確定大小的珠子的亮視野圖像。圖板B、C和D分別是表達(dá)⑶34、⑶133+和 CXCR4抗原的UCB-VSEL和HSPC的多通道圖像。每幅照片顯示了細(xì)胞的亮視野圖像，與指明的表面標(biāo)志物的表達(dá)相關(guān)的熒光圖像，以及以7-AAD染色后的細(xì)胞核圖像。在每個(gè)圖板中， 造血Lin標(biāo)志物和CD45的表達(dá)分別顯示為綠色(Lin ；FITC)和橙色(PE)，而⑶34、CD133 或CXCR4的表達(dá)顯示為黃色(PE-C0)。所有的圖像均以相同的放大倍數(shù)顯示。比例尺表示ΙΟμπι。數(shù)值反映了每個(gè)群體的平均大小(平均值士 SEM)，其由IDEAS軟件根據(jù)較短的細(xì)胞軸的長(zhǎng)度計(jì)算。圖58A-F. UCB-VSEL的原始亞群的含量和形態(tài)學(xué)的ISS分析。圖板A-D顯示了 ISS 中UCB-VSEL的含量的分析。在分析之前將細(xì)胞固定并以7-AAD染色。圖板A 根據(jù)形態(tài)學(xué)參數(shù)(包括細(xì)胞核的面積和亮視野的長(zhǎng)寬比)顯示所分析的物體?；诹烈曇坝?jì)算長(zhǎng)寬比， 其為較短的細(xì)胞軸(寬度)與較長(zhǎng)的軸(高度)之比。圓的、非長(zhǎng)形的細(xì)胞具有接近1.0 的長(zhǎng)寬比，而長(zhǎng)形的細(xì)胞或細(xì)胞塊(clumps)具有較低的長(zhǎng)寬比。包括了圓的、含有DNA的單個(gè)細(xì)胞以進(jìn)行進(jìn)一步分析(區(qū)域Rl)。圖板B 基于CD45和造血Lin標(biāo)志物的表達(dá)在直方圖中顯示來(lái)自區(qū)域Rl的物體。在區(qū)域R2中包括LirT/⑶45_的物體。圖板C:根據(jù)0ct_4 的核內(nèi)表達(dá)和⑶133抗原的表面表達(dá)分析來(lái)自區(qū)域R2的非造血成分。在區(qū)域R3中包括了具有兩種標(biāo)志物的共表達(dá)的物體，其代表UCB-VSEL含量。圖板D 根據(jù)由IDEAS軟件計(jì)算的大小(計(jì)算為較短的細(xì)胞軸的長(zhǎng)度)顯示來(lái)自區(qū)域R3的UCB-VSEL。在點(diǎn)圖中標(biāo)出了 UCB-VSEL中的小于6和8 μ m的細(xì)胞的平均含量。所有圖板上的百分率表示每個(gè)區(qū)域中指明的成分占總UCB細(xì)胞的含量(平均值士 SEM)。圖板E-F 表格和圖形顯示了 UCB-VSEL亞群(根據(jù)表面存在CD34和SSEA-4抗原以及0ct_4的細(xì)胞核表達(dá)來(lái)區(qū)分)的含量和形態(tài)學(xué)特征，例如大小、N/C比率和小于6μπι的細(xì)胞的含量。平均值表示為平均值士SEM。代表性圖像顯示了共表達(dá)⑶133和Oct-4抗原的細(xì)胞。圖59A-E. RBC裂解和在Ficoll-Paque上離心后獲得的細(xì)胞成分中的UCB-VSEL和 HSPC回收和基因表達(dá)的分析。圖板A-B分別是以IxBD WmrmLyse緩沖液裂解RBC后獲得的TNC成分和Ficoll-Paque分離后獲得的MNC的成分中UCB-VSEL的含量分析。兩個(gè)細(xì)胞成分均就Lin標(biāo)志物(FITC)、⑶45 (PE)以及原始SC的標(biāo)志物之一，例如⑶34、⑶133 或CXCR4(APC)進(jìn)行染色。圖板A和B顯示了根據(jù)CD45和指明的原始細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)而源自兩種細(xì)胞成分的Lin-細(xì)胞。區(qū)域R5中顯示了 UCB-VSEL，區(qū)域R4中顯示了其造血對(duì)應(yīng)物。百分率表示每個(gè)成分的細(xì)胞中的亞群的平均含量(平均值士SEM)。圖板C-D:通過(guò)在低滲溶液中裂解RBC或通過(guò)在Ficoll-Paque梯度上離心而從1毫升UCB中分離的 UCB-VSEL和HSPC的絕對(duì)數(shù)目。數(shù)值表示來(lái)自5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)(平均值士 SEM)。相對(duì)于在裂解RBC后獲得的TNC，P < 0. 05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(#)。圖板E 裂解RBC 和在Ficoll-Paque上離心后分別獲得的TNC和MNC成分中與多能性相關(guān)的基因(0ct_4和 Nanog)和與組織定向相關(guān)的基因(Nkx2. 5/Csx、GATA-4和VE-鈣粘蛋白)的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示為所分析的成分與總CB細(xì)胞之間的平均(平均值士SEM)倍數(shù)差異。與總的未純化的 UCB細(xì)胞相比，P < 0. 05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的O。圖60A-B.以用于臨床應(yīng)用的AXP AutoXpress平臺(tái)處理UCB單元之后的 UCB-VSEL和HSPC的回收。圖板A 可以從1毫升UCB中回收的總的⑶34+細(xì)胞以及具有 ⑶34表達(dá)的UCB-VSEL和HSPC的絕對(duì)數(shù)目。在下列新鮮的和經(jīng)處理的UCB樣品中分析回收情況i)完全未經(jīng)處理的UCB (灰色條柱)；ii)體積耗竭(volume depletion)之后獲得的 UCB的新鮮濃縮物(黑色條柱)；和iii)經(jīng)歷冷凍/解凍程序之后的UCB的濃縮物(陰影條柱)。平均值表示為平均值士 SEM。與完全未經(jīng)處理的UCB相比，P<0. 05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的O。圖板B:在每個(gè)UCB處理步驟中從1毫升UCB中回收的表達(dá)⑶133抗原的 HSPC的絕對(duì)數(shù)目的類似分析。平均值表示為平均值士SEM。與完全未經(jīng)處理的UCB相比， P < 0. 05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的O。圖61A-B.以多種策略處理UCB之后的UCB-VSEL和HSPC的回收。圖板A 從1毫升完全/未經(jīng)處理的UCB (白色條柱)以及從1毫升經(jīng)過(guò)以下處理的UCB回收的UCB-VSEL的絕對(duì)數(shù)目:i)裂解RBC(灰色條柱)；ii)在Ficoll-Paque梯度上離心(陰影條柱)；和iii) 雙步驟處理，包括⑶133+的免疫磁性分離，然后進(jìn)行FACS。圖板B 從1毫升UCB (按照對(duì)于UCB-VSEL回收的描述進(jìn)行處理)回收的HSC的絕對(duì)數(shù)目。平均值表示為平均值士SEM。 與完全未經(jīng)處理的UCB相比，P < 0. 05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的O。圖62.通過(guò)ISS獲得的代表多能性UCB-VSEL亞群的細(xì)胞的圖像。圖中顯示了表達(dá)CD34抗原和多能性標(biāo)志物Oct-4和SSEA-4的UCB-VSEL的代表性圖像。每幅照片由亮視野圖像和與細(xì)胞核圖像(7-AAD ；紅色)和Lin標(biāo)志物和⑶45 (FITC ；綠色)、Oct-4或 SSEA-4(PE ；黃色)和CD34或CD133(PE，黃色或PE-Cy5，紅紫色)的表達(dá)(如每幅照片上所示)相關(guān)的單獨(dú)的熒光圖像組成。組合照片顯示了細(xì)胞核(7-AAD)和指明的標(biāo)志物的復(fù)合。數(shù)值顯示了所示細(xì)胞的直徑。比例尺表示10 μ m。圖63A-B.含有UCB-VSEL的UCB亞群的絕對(duì)數(shù)目。圖板A 表達(dá)CD34、CD133和 CXCR4抗原的UCB的非造血成分的含量，其富含UCB-VSEL。圖板B 表達(dá)⑶34抗原以及PSC 的標(biāo)志物(Oct-4和SSEA-4)的UCB-VSEL的亞群的含量。數(shù)值表示可以從1毫升UCB中分離的細(xì)胞的平均絕對(duì)數(shù)目(平均值士SEM)。圖64A-D.通過(guò)FACS分選VSEL的設(shè)門策略。通過(guò)FACS從免疫熒光染色的鼠BM有核細(xì)胞分離源自BM的VSEL。圖板A 與具有1、2、4、6、10和15 μ m的標(biāo)準(zhǔn)直徑的6種大小不同的珠子顆粒(Flow Cytometry Size beads, Invitrogen ；Molecular Probes, Carlsbad, Calif.，USA)比較之后，在門Rl中包括了介于2-10μπι的無(wú)顆粒的(agranular)小的事件。 圖板B 通過(guò)顯示正向分散(FSC)相對(duì)于側(cè)向分散(SSC)信號(hào)(它們分別與細(xì)胞的大小和粒度/復(fù)雜性相關(guān))的點(diǎn)圖顯示BM有核細(xì)胞。圖板Dj^ka-l和Lin的表達(dá)進(jìn)一步分析來(lái)自區(qū)域Rl的細(xì)胞，僅將ka-r/LirT的事件包括在區(qū)域R2中?；冖?5標(biāo)志物的表達(dá)， 進(jìn)一步將來(lái)自區(qū)域R2的群體分選進(jìn)入CD45_和CD45+亞群，顯示于直方圖中(圖板C，分別為區(qū)域R3和R4)。Sca-l+/Lin7CD45-細(xì)胞(VSEL)分選為包括在包含區(qū)域RU R2和R3的邏輯門中的事件，而ka-l7Lin/⑶45+細(xì)胞(HSC)來(lái)自包括區(qū)域R1、R2和R4的門。百分率顯示了總的BM有核細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞亞群的平均含量(士 SEM)。圖65A-D.源自胸腺的VSEL的ImageMream系統(tǒng)分析。圖中顯示了就ka_l、CD45 和造血譜系標(biāo)志物(Lin)染色之后，從胸腺分離的細(xì)胞的完整群體的分析。圖板A顯示了根據(jù)形態(tài)學(xué)參數(shù)(包括細(xì)胞核的面積和亮視野的長(zhǎng)寬比)所獲取的所有物體?；诿總€(gè)細(xì)胞的亮視野圖像計(jì)算長(zhǎng)寬比，其為較短的細(xì)胞軸(寬度)與較長(zhǎng)的軸(高度)的比。圓的、 非長(zhǎng)形的(non-elongated)細(xì)胞具有接近1. 0的長(zhǎng)寬比，而長(zhǎng)形的細(xì)胞或細(xì)胞塊具有小于 1.0的長(zhǎng)寬比。在區(qū)域Rl中包括了圓的、含有DNA的單個(gè)細(xì)胞以進(jìn)行進(jìn)一步分析。隨后，基于Lin(圖板B)和CD45(圖板D)的表達(dá)在直方圖中顯示來(lái)自區(qū)域Rl的物體。來(lái)自包括區(qū)域R2和R3的邏輯門的LirT/⑶45_物體顯示于點(diǎn)圖中，其中顯示了它們的側(cè)向分散特征和 Sca-I 表達(dá)(圖板 C)。區(qū)域 R4 中包括了 Sca-l+/Lin7CD45_ 細(xì)胞。Sca-l+/Lin7CD45_ 細(xì)胞在源自胸腺的總細(xì)胞中的百分含量顯示為平均值士SEM。圖66A-B.通過(guò)ISS獲得的鼠VSEL、HSC、紅細(xì)胞和血小板之間的形態(tài)學(xué)比較。圖板 A顯示了就Sca-1(FITC，綠色)、Lin(PE，橙色)和CD45 (PE_Cy5，紅紫色)染色的鼠VSEL以及就Ter 119 (PE，橙色)和⑶41 (FITC，綠色)染色的源自血液的紅細(xì)胞和血小板。在固定之后，所有的樣品以7-AAD(紅色)進(jìn)行染色以顯示細(xì)胞核。紅細(xì)胞和血小板沒(méi)有細(xì)胞核， 而VSEL顯示出含有細(xì)胞核的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。顯示了每個(gè)群體的平均大小(平均值士SEM)。比例尺表示10 μ m。圖板B顯示了當(dāng)與相同級(jí)別的大小預(yù)先確定的珠子相比較時(shí)，來(lái)自所有3 個(gè)群體的細(xì)胞(VSEL、RBC和血小板)。圖67A-D.以Imag必tream系統(tǒng)檢測(cè)到的人工假象。圖板A顯示了就ka-Ι染色為陽(yáng)性的正常的有核的Lin7CD45_細(xì)胞。在下面的圖板上顯示了假“陽(yáng)性”的人工假象的選擇的圖像(圖板B)，被破壞的、降解的細(xì)胞(圖板C)和細(xì)胞碎片(圖板D)。每幅照片顯示了亮視野圖像以及與細(xì)胞核圖像(7-AAD;紅色)和^^-1爾11^;綠色)、1^11腫；橙色) 和⑶45 (PE-Cy5 ；黃色)的表達(dá)相關(guān)的單獨(dú)的熒光圖像。比例尺表示10 μ m。
圖68.通過(guò)ISS在鼠組織中分析的0ct-4+/Sca-l7Lin7⑶45_細(xì)胞的圖像。圖中顯示了在骨髓、肺、腦、腎、胰腺和骨骼肌檢測(cè)的此類細(xì)胞的代表性圖像。就多能性標(biāo)志物 0ct-4(FITC ；綠色)、CD45和Lin(PE ；橙色)以及Sca-I (PECy5 ；紅紫色)染色分離自器官的細(xì)胞。以7-AAD(紅色)染色細(xì)胞以顯示細(xì)胞核，并通過(guò)ISS分析以檢測(cè)Oct-4的核內(nèi)表達(dá)，如在放大的組合的圖像中所示。比例尺表示10 μ m。圖69A-B.存在于鼠器官中的0ct-47Sca-r/Lin7⑶45_細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目。圖板 A顯示了通過(guò)使用由ISS獲得的百分含量和分離自每種器官的總細(xì)胞數(shù)而計(jì)算的每個(gè)器官中Oct-4+VSEL的含量[xl03]。數(shù)值表示為平均值士SEM。圖板B顯示了所分析的所有器官中Oct-4+VSEL的總數(shù)目的百分率分布的估計(jì)。數(shù)值顯示為平均值士SEM。圖70.在成體器官中檢測(cè)到的Oct-4+VSEL的共聚焦顯微鏡圖像。圖中顯示了在骨髓、腦和腎中檢測(cè)到的Oct-4+VSEL的代表性圖像。就Oct-4 (TRITC ；紅色)、CD45 (Cy5 ；紅紫色)和Sca-I (FITC ；綠色)染色分選的Sca-I+LirT/⑶45_細(xì)胞。細(xì)胞核以DAPI (藍(lán)色) 進(jìn)行染色。圖像顯示了對(duì)⑶45為陰性而對(duì)0ct_4(其為多能性細(xì)胞的標(biāo)志物)和Sea-I為陽(yáng)性的0ct-47Sca-rLin7CD45_細(xì)胞(VSEL)。合并的圖像顯示了 0ct_4的核內(nèi)染色以及 Sca-I抗原的表面存在。比例尺表示5 μ m。序列表的簡(jiǎn)單描述SEQ ID Nos :1_64是可以用于擴(kuò)增多個(gè)鼠核酸序列的32個(gè)引物對(duì)的核苷酸序列， 總結(jié)于表1中。^t 1 用于實(shí)時(shí)RT-PCR的鼠引物的序列
基因 (GENBANK 登記號(hào) )序列(以5，-3'順序表示)召2微球蛋白 (NM_009735)CATACGCCTGCAGAGTTAAGCA (SEQ ID NO: 1) GATCACATGTCTCGATCCCAGTAG (SEQ ID NO: 2)Oct4 (X52437)ACCTTCAGGAGATATGCAAATCG (SEQ ID NO: 3) TTCTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCT (SEQ ID NO: 4)Nanog (AY278951)CGTTCCCAGAATTCGATGCTT (SEQ ID NO: 5) TTTTCAGAAATCCCnCCCTCG (SEQ ID NO: 6)
權(quán)利要求
1.源自人類的成人器官或組織細(xì)胞的非常小的胚胎樣干細(xì)胞(VSEL)的富集群體，其中所述群體這樣富集通過(guò)就⑶133+CXCR4+CD34+LinTD45-細(xì)胞來(lái)選擇細(xì)胞以獲得靶VSEL 的富集群體。
2.權(quán)利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是0ct_4+。
3.權(quán)利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是SSEA+。
4.權(quán)利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL在細(xì)胞核中表達(dá)Oct-4蛋白，并且在表面上表達(dá)SSEA抗原。
5.權(quán)利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是Nanog+。
6.權(quán)利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL表達(dá)選自下列的原始生殖細(xì)胞 (PGC)標(biāo)志物胎兒型堿性磷酸酶、OctA, SSEA-U CXCR4、Mvh、Stella, Fragilis, Nobox 和 Hdac6。
7.權(quán)利要求1的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過(guò)就大小為2至6μπι的細(xì)胞進(jìn)行選擇而富集的。
8.權(quán)利要求1的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過(guò)就大小為2至4μπι的細(xì)胞進(jìn)行選擇而富集的。
9.權(quán)利要求1的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過(guò)就含有原始的非結(jié)構(gòu)化的常染色質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)行選擇而富集的。
10.權(quán)利要求1的VSEL的富集群體，其中所述群體中至少30%的細(xì)胞是靶VSEL。
11.源自人類血液的非常小的胚胎樣干細(xì)胞(VSEL)的富集群體，其中所述群體這樣富集通過(guò)就⑶133+CXCR4+⑶34+LinTD45_細(xì)胞來(lái)選擇細(xì)胞以獲得靶VSEL的富集群體。
12.權(quán)利要求11的VSEL的富集群體，其中所述血液是臍帶血。
13.權(quán)利要求11的VSEL的富集群體，其中所述血液是外周血。
14.權(quán)利要求11的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是0ct_4+。
15.權(quán)利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是SSEA+。
16.權(quán)利要求11的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL在細(xì)胞核中表達(dá)0ct_4蛋白，并且在表面上表達(dá)SSEA抗原。
17.權(quán)利要求11的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是Nanog+。
18.權(quán)利要求11的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL表達(dá)選自下列的原始生殖細(xì)胞 (PGC)標(biāo)志物胎兒型堿性磷酸酶、OctA, SSEA-1、CXCR4、Mvh、Stella、Fragilis, Nobox 和 Hdac6。
19.權(quán)利要求11的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過(guò)就大小為2至6μ m的細(xì)胞進(jìn)行選擇而富集的。
20.權(quán)利要求11的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過(guò)就大小為2至4μm的細(xì)胞進(jìn)行選擇而富集的。
21.權(quán)利要求11的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過(guò)就含有原始的非結(jié)構(gòu)化的常染色質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)行選擇而富集的。
22.權(quán)利要求11的VSEL的富集群體，其中所述群體中至少30%的細(xì)胞是靶VSEL。
23.產(chǎn)生細(xì)胞群體的方法，所述細(xì)胞群體就來(lái)自人類血液的靶非常小的胚胎樣干細(xì)胞 (VSEL)進(jìn)行了富集，所述方法包括裂解血液以除掉紅細(xì)胞和制備LirT/⑶457⑶133+細(xì)胞的富集群體。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述血液是臍帶血。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述血液是外周血。
26.產(chǎn)生細(xì)胞群體的方法，所述細(xì)胞群體就來(lái)自人類血液的靶非常小的胚胎樣干細(xì)胞 (VSEL)進(jìn)行了富集，所述方法包括i)裂解血液以除掉紅細(xì)胞；ii)制備CD133+細(xì)胞的富集群體；和iii)制備LirT/⑶457⑶133+的富集群體。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述血液是臍帶血。
28.權(quán)利要求沈的方法，其中所述血液是外周血。
29.權(quán)利要求沈的方法，其中所述LirT/⑶457⑶133+的富集群體是通過(guò)熒光激活的細(xì)胞分選來(lái)富集的。
30.權(quán)利要求沈的方法，其中在低滲的氯化銨溶液中裂解血液以除掉紅細(xì)胞。
31.權(quán)利要求沈的方法，其中通過(guò)使用免疫磁珠來(lái)富集CD133+細(xì)胞。
全文摘要
當(dāng)前披露的主題提供了分離干細(xì)胞群的方法，所述干細(xì)胞群來(lái)自骨髓、外周血和/或其它來(lái)源。還提供了使用干細(xì)胞治療受試者中的組織和/或器官損傷的方法。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102333861SQ200980148102
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月30日
發(fā)明者E·K·祖巴-敘爾馬, J·拉塔查克, M·庫(kù)恰, M·拉塔查克 申請(qǐng)人:尼奧斯泰姆公司, 路易斯維爾大學(xué)研究基金會(huì)有限公司