專利名稱：一種固定化酒用酸性脲酶的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
—種固定化酒用酸性脲酶的制備方法及應(yīng)用，具體地說(shuō)是將從腸桿菌9043(:12中分離純化的游離酶，經(jīng)海藻酸鈉和氯化鈣包埋，殼聚糖吸附，微量戊二醛交聯(lián)，得固定化酒用酸性脲酶，屬于酶制劑、釀酒添加劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基甲酸乙酯(或稱尿烷，簡(jiǎn)稱EC) ，2005年被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(InternationalAgency for Research on Cancer, IARC)劃入2B (對(duì)人有致癌嫌疑物質(zhì))組。其致癌機(jī)理通過(guò)對(duì)體內(nèi)氨基甲酸乙酯的代謝途徑的研究可知有3種途徑第一超過(guò)90%的氨基甲酸乙酯可被分解為乙醇、氨和碳水化合物等(這種途徑是無(wú)毒性的)；第二約0.5%的氨基甲酸乙酯被細(xì)胞色素P450氧化成DNA加聚物，造成DNA雙鏈破壞，可導(dǎo)致癌變；第三種途徑較為普遍，即約0. 1 %的氨基甲酸乙酯被細(xì)胞色素P450氧化為N-羥基-氨基甲酸乙酯，后者能夠誘導(dǎo)Cu"調(diào)控的DNA損傷，這種損傷多發(fā)生于胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的殘基上。大多數(shù)認(rèn)為第三種途徑是氨基甲酸乙酯的主要致癌途徑。 國(guó)內(nèi)外對(duì)酒中氨基甲酸乙酯的研究表明，酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途徑為尿素途徑，我國(guó)黃酒及日本清酒中90%以上的氨基甲酸乙酯是來(lái)源于酒中所含尿素與乙醇的反應(yīng)H2NC0NH2+C2H50H — C2H50C0NH2+NH3 而酒中尿素的主要來(lái)源為由微生物代謝產(chǎn)生，即由精氨酸代謝產(chǎn)生的尿素和原輔材料和釀造過(guò)程的培養(yǎng)液成分中所含的尿素。 在研究了影響氨基甲酸乙酯形成的因素后發(fā)現(xiàn)，尿素濃度、乙醇濃度等是最主要的因素。各國(guó)學(xué)者們對(duì)降低酒中氨基甲酸乙酯的方法進(jìn)行了深入的研究，通過(guò)去除或降低酒中的尿素含量，可以達(dá)到控制氨基甲酸乙酯含量的目的。 向酒中添加酒用酸性脲酶可以降低尿素含量，但游離酶在溶液中不穩(wěn)定，容易變性和失活，反應(yīng)后酶難以分離回收，無(wú)法重復(fù)使用，利用固定化酶可避免以上的不足，擴(kuò)大了酶的使用范圍和使用次數(shù)。將游離酶制成固定化酶，向酒中添加固定化酒用酸性脲酶不影響黃酒正常的生產(chǎn)工藝，在勾兌，澄清酒的過(guò)程中，添加固定化酒用酸性脲酶，就可以降低尿素含量，且固定化酒用酸性脲酶易于與酒分離，可以重復(fù)利用，減少酸性脲酶的用量。
我國(guó)是世界上年產(chǎn)酒量最大的國(guó)家，有著十分悠久的釀酒歷史，不僅產(chǎn)量大，而且品種多，許多產(chǎn)品在國(guó)際上享有較高的聲譽(yù)。我國(guó)的紹興黃酒在日本及東南亞擁有廣泛的市場(chǎng)，但在1987年，日本有關(guān)部門提出紹興黃酒中氨基甲酸乙酯含量超標(biāo)(大于100 yg/L)，近年來(lái)，又在紹興黃酒出口貿(mào)易上遇到了氨基甲酸乙酯的問(wèn)題，為了降低酒中氨基甲酸乙酯的含量，紹興黃酒集團(tuán)至今仍需從日本進(jìn)口酒用酸性脲酶。因此，為了人民的身體健康，也為了能更多的出口創(chuàng)匯，研究和生產(chǎn)我國(guó)自己的酒用酸性脲酶已成為當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種固定化酒用酸性脲酶的制備方法，將從腸桿菌9043C12 中分離純化的游離酶，經(jīng)海藻酸鈉和氯化鈣包埋，殼聚糖吸附，微量戊二醛交聯(lián)，得固定化 酒用酸性脲酶，該固定化酸性脲酶的最適溫度為40°C ，最適pH為4，貯存半衰期為71天；本 發(fā)明還涉及這種固定化酒用酸性脲酶的應(yīng)用，在黃酒中加入該固定化酒用酸性脲酶后尿素 去除率能達(dá)到80%左右，連續(xù)使用21次后，尿素去除率仍可達(dá)51.6%。本發(fā)明可以不改變 原釀造酒的工藝條件，不改變酒的風(fēng)味，且固定化酒用酸性脲酶可以重復(fù)利用，是目前較為 理想的去除酒中尿素的方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案一種固定化酒用酸性脲酶的制備方法，將從腸桿菌9043C12中 分離純化的游離酶，經(jīng)海藻酸鈉和氯化鈣包埋，殼聚糖吸附，微量戊二醛交聯(lián)，得固定化酒 用酸性脲酶，其工藝為
A、游離酶提取 (1)菌種采用腸桿菌(Enterobacter sp. )9043C12 ;中國(guó)專利ZL200610096635. 1
已公開(kāi)。 (2)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基組成種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖20，蛋白胨IO，牛肉膏IO，酵母膏 5， KH2P04 2， NaC15， NaAc 2，尿素5， pH7. 0 (用NaOH調(diào)pH);
培養(yǎng)條件接種量5%，35°。恒溫靜置培養(yǎng)16 18h ;
(3)發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)葡萄糖20，蛋白胨IO，牛肉膏5，酵母膏5， KH2P04 2，
NaCl 5， NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0. 05，六水硫酸鎳0. 05， pH5. 5 (HC1調(diào)pH); 發(fā)酵液培養(yǎng)條件接種量6%，35°。恒溫靜置培養(yǎng)28 32h ; (4)收集菌體將發(fā)酵液8000r/min、4t:離心10min后，棄上清，將菌體用去離子水
洗滌兩次，pH5. 5的檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，每升發(fā)酵液離心后所得菌體復(fù)溶于
pH5. 5的35mL檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液中； (5)超聲波破碎超聲波功率300w，破碎時(shí)間10min，處理量35mL ;將破碎液于4°C 下13000r/min離心20min，收集上清液，即為游離酶酶液；
B、固定化過(guò)程 (1)將海藻酸鈉溶入游離酶酶液中，控制海藻酸鈉的質(zhì)量/體積濃度達(dá)2%，充分
攪勻，4t:冷藏靜置至無(wú)氣泡； (2)用注射器將步驟(1)的含海藻酸鈉的游離酶酶液逐滴滴入其5倍體積的溶有 質(zhì)量/體積濃度0. 25%殼聚糖和5%氯化鈣的溶液中，磁力攪拌3h，去離子水洗滌，去除游 離殼聚糖和氯化鈣，瀝干，得固定化小球； (3)將步驟(2)所得固定化小球置于體積濃度0. 1%戊二醛中，固定化小球質(zhì)量/ 戊二醛體積控制為2g/mL，微波3min后，置于磁力攪拌器上磁力攪拌2. 5h，去離子水洗滌， 去除游離戊二醛，瀝干，冷藏備用，得固定化酒用酸性脲酶。 制備的固定化酒用酸性脲酶的應(yīng)用該固定化酸性脲酶的最適溫度為4(TC，最適 pH為4，貯存半衰期為71天； 在黃酒中加入該固定化酒用酸性脲酶后，加酶量固定化酶重量/黃酒體積為100g/L，在動(dòng)態(tài)的條件下，溫度35°C ，作用時(shí)間18h，去除酒樣中80%的尿素，連續(xù)使用21次 后，尿素去除率達(dá)51.6%。 該固定化酒用酸性脲酶的性質(zhì)最適溫度、最適pH及貯存半衰期的確定 在25-85t:范圍內(nèi)，每隔5。C，分別測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)
酶活力，最適溫度為40°C。 在不同pH條件下分別測(cè)定酶活，以最高酶活力為100X，計(jì)算相對(duì)酶活力，最適pH 為4。 將固定化酸性脲酶放于4t:冰箱內(nèi)，每隔三天測(cè)定固定化酸性脲酶的酶活，貯存半 衰期為71天。 該固定化酒用酸性脲酶的應(yīng)用 (1)在動(dòng)態(tài)的條件下，溫度35t:左右，加酶量100g/L(固定化酶重量/黃酒體積)， 作用時(shí)間18小時(shí)，去除酒樣中80%左右的尿素。 (2)將50g固定化酸性脲酶置于柱子中，在恒流泵的帶動(dòng)下，80mL黃酒以0. 5mL/ min的速度流過(guò)柱子，黃酒在柱子中循環(huán)一次后測(cè)定其尿素濃度，計(jì)算尿素去除率，首次使 用尿素去除率為83. 4%，然后再加入80mL的黃酒重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)21次后尿素去除率為 51. 6%。 酶活測(cè)定方法 游離酶活測(cè)定方法采用靛酚藍(lán)反應(yīng)(Berthelot reaction)比色法。 酶活力定義在常壓，37t:， pH5. 5條件下，每分鐘分解底物產(chǎn)生1 P mol氨為一個(gè)
酶活力單位。 固定化酶活測(cè)定方法 固定化酒用酸性脲酶活性的測(cè)定是測(cè)定固定化前酶的活性和固定化后上清液酶 的活性，然后計(jì)算固定化酶活性。 固定化酶活性=(固定化前酶的活性_固定化后上清液酶的活性)
尿素含量的測(cè)定方法二乙酰一肟法。
蛋白含量測(cè)定方法考馬斯亮藍(lán)G-250法。
戊二醛含量的測(cè)定紫外分光光度法。 本發(fā)明的有益效果游離酶的提取方法可以用工業(yè)生產(chǎn)方法代替，固定化酶的制 作過(guò)程可以用機(jī)器制作代替，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。該固定化酸性脲酶能在酒中穩(wěn)定發(fā)揮作用， 尿素去除率高，在黃酒中加入固定化酒用酸性脲酶后尿素去除率能達(dá)到80%左右，且固定 化酒用酸性脲酶便于回收，可重復(fù)利用21次。本發(fā)明可以不改變?cè)勗炀频墓に嚄l件，不 改變酒的風(fēng)味，在勾兌，澄清酒的過(guò)程中，添加固定化酒用酸性脲酶，就可以降低尿素含量， 是目前較為理想的去除酒中尿素的方法。


圖1固定化酒用酸性脲酶制備工藝示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :將2g海藻酸鈉溶于100mL游離酸性脲酶酶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，攪勻后置?t:冰箱中冷藏至溶液中無(wú)氣泡為止，用注射器逐滴滴入500mL溶有0. 25%殼 聚糖和5X氯化鈣的溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌3h，用去離子水充分洗滌，去除游 離殼聚糖和氯化鈣，瀝干，將固定化小球置于0. 1%戊二醛中，固定化小球質(zhì)量/戊二醛體 積控制為2g/mL，微波3min后，置于磁力攪拌器上磁力攪拌2. 5h(用不透明容器蓋住，以防 戊二醛見(jiàn)光變色)，去離子水洗滌，去除游離戊二醛(紫外分光光度法檢測(cè))，瀝干，冷藏備 用，得固定化酒用酸性脲酶50. 31g，裝入流動(dòng)裝置，在內(nèi)徑2. 5cm，長(zhǎng)20cm的柱子中，裝入 50. 31g固定化酒用酸性脲酶，調(diào)節(jié)流速為0. 5mL/min，使200mL的黃酒流過(guò)柱子，在每次循 環(huán)后測(cè)定黃酒中的尿素含量，計(jì)算出尿素去除率，在循環(huán)3次后尿素含量從23. 9mg/L降至 4. 82mg/L，尿素去除率為79.8%。 實(shí)施例2 :將3. 6g海藻酸鈉溶于180mL游離酸性脲酶酶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁?攪勻后置于4t:冰箱中冷藏至溶液中無(wú)氣泡為止，用注射器逐滴滴入900mL溶有0. 25%殼 聚糖和5X氯化鈣的溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌3h，用去離子水充分洗滌，去除游 離殼聚糖和氯化鈣，瀝干，將固定化小球置于0. 1%戊二醛中，固定化小球質(zhì)量/戊二醛體 積控制為2g/mL，微波3min后，置于磁力攪拌器上磁力攪拌2. 5h(用不透明容器蓋住，以防 戊二醛見(jiàn)光變色)，去離子水洗滌，去除游離戊二醛(紫外分光光度法檢測(cè))，瀝干，冷藏備 用，得固定化酒用酸性脲酶89. 58g，裝入流動(dòng)裝置，在內(nèi)徑3. 5cm，長(zhǎng)30cm的柱子中，裝入 89. 58g固定化酒用酸性脲酶，調(diào)節(jié)流速為0. 5mL/min，使500mL的黃酒流過(guò)柱子，在每次循 環(huán)后測(cè)定黃酒中的尿素含量，計(jì)算出尿素去除率，在循環(huán)3次后尿素含量從24. 6mg/L降至 3. 96mg/L，尿素去除率為83. 9% 。 實(shí)施例3 :將2g海藻酸鈉溶于100mL游離酸性脲酶酶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁?攪勻后置于4t:冰箱中冷藏至溶液中無(wú)氣泡為止，用注射器逐滴滴入500mL溶有0. 25%殼 聚糖和5X氯化鈣的溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌3h，用去離子水充分洗滌，去除游 離殼聚糖和氯化鈣，瀝干，將固定化小球置于O. 1%戊二醛中，固定化小球質(zhì)量/戊二醛體 積控制為2g/mL，微波3min后，置于磁力攪拌器上磁力攪拌2. 5h(用不透明容器蓋住，以防 戊二醛見(jiàn)光變色)，去離子水洗滌，去除游離戊二醛(紫外分光光度法檢測(cè))，瀝干，冷藏備 用，得固定化酒用酸性脲酶50. 56g，裝入流動(dòng)裝置，在內(nèi)徑2. 5cm，長(zhǎng)20cm的柱子中，裝入 50. 56g固定化酒用酸性脲酶，使80mL黃酒以0. 5mL/min的速度流過(guò)柱子，黃酒在柱子中循 環(huán)一次后測(cè)定其尿素濃度，計(jì)算其尿素去除率，首次使用尿素去除率為83.4%，然后再加入 80mL的黃酒重復(fù)試驗(yàn)。重復(fù)21次后尿素去除率為51. 6% 。
權(quán)利要求
一種固定化酒用酸性脲酶的制備方法，其特征為將從腸桿菌9043C12中分離純化的游離酶，經(jīng)海藻酸鈉和氯化鈣包埋，殼聚糖吸附，微量戊二醛交聯(lián)，得固定化酒用酸性脲酶，其工藝為A、游離酶提取(1)菌種采用腸桿菌(Enterobacter sp.)9043C12；(2)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，pH7.0；培養(yǎng)條件接種量5％，35℃恒溫靜置培養(yǎng)16～18h；(3)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO42，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0.05，六水硫酸鎳0.05，pH5.5；發(fā)酵液培養(yǎng)條件接種量6％，35℃恒溫靜置培養(yǎng)28～32h；(4)收集菌體將發(fā)酵液8000r/min、4℃離心10min后，棄上清，將菌體用去離子水洗滌兩次，pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，每升發(fā)酵液離心后所得菌體復(fù)溶于pH5.5的35mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中；(5)超聲波破碎超聲波功率300w，破碎時(shí)間10min，處理量35mL；將破碎液于4℃下13000r/min離心20min，收集上清液，即為游離酶酶液；B、固定化過(guò)程(1)將海藻酸鈉溶入游離酶酶液中，控制海藻酸鈉的質(zhì)量/體積濃度達(dá)2％，充分?jǐn)噭颍?℃冷藏靜置至無(wú)氣泡；(2)用注射器將步驟(1)的含海藻酸鈉的游離酶酶液逐滴滴入其5倍體積的溶有質(zhì)量/體積濃度0.25％殼聚糖和5％氯化鈣的溶液中，磁力攪拌3h，去離子水洗滌，去除游離殼聚糖和氯化鈣，瀝干，得固定化小球；(3)將步驟(2)所得固定化小球置于體積濃度0.1％戊二醛中，固定化小球質(zhì)量/戊二醛體積控制為2g/mL，微波3min后，置于磁力攪拌器上磁力攪拌2.5h，去離子水洗滌，去除游離戊二醛，瀝干，冷藏備用，得固定化酒用酸性脲酶。
2. 用權(quán)利要求l方法制備的固定化酒用酸性脲酶的應(yīng)用其特征是該固定化酸性脲酶 的最適溫度為4(TC，最適pH為4，貯存半衰期為71天；在黃酒中加入該固定化酒用酸性脲酶后，加酶量固定化酶重量/黃酒體積為100g/L， 在動(dòng)態(tài)的條件下，溫度35°C ，作用時(shí)間18h，去除酒樣中80%的尿素，連續(xù)使用21次后，尿素 去除率達(dá)51.6%。
全文摘要
一種固定化酒用酸性脲酶的制備方法及應(yīng)用，屬于酶制劑、釀酒添加劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及將從腸桿菌9043C12中分離純化的游離酶，經(jīng)海藻酸鈉和氯化鈣包埋，殼聚糖吸附，微量戊二醛交聯(lián)，得固定化酒用酸性脲酶，該固定化酸性脲酶的最適溫度為40℃，最適pH為4，貯存半衰期為71天；本發(fā)明還涉及這種固定化酒用酸性脲酶的應(yīng)用，在黃酒中加入該固定化酒用酸性脲酶后尿素去除率能達(dá)到80％左右，連續(xù)使用21次后，尿素去除率可達(dá)51.6％。本發(fā)明可以不改變?cè)勗炀频墓に嚄l件，不改變酒的風(fēng)味，且固定化酒用酸性脲酶可以重復(fù)利用，是目前較為理想的去除酒中尿素的方法。
文檔編號(hào)C12N11/10GK101705221SQ200910233289
公開(kāi)日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者呂園園, 吳召慧, 田亞平 申請(qǐng)人:江南大學(xué)