專利名稱：一株大量產(chǎn)生γ-聚谷氨酸的誘變菌株地衣芽孢桿菌TKPG091的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株大量產(chǎn)生Y-聚谷氨酸的誘變菌株 地衣芽孢桿菌TKPG091及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
Y-聚谷氨酸[y-poly (glutamic acid), Y-PGA]，是由 L_ 谷氨酸[L_Glu]、D_ 谷 氨酸[D-Glu]通過(guò)Y-酰胺鍵結(jié)合形成的一種高分子氨基酸聚合物。該種材料降解的產(chǎn)物 無(wú)毒無(wú)害，不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生二次污染，近年來(lái)這種高分子材料的開發(fā)研究得到了飛速發(fā)展。 Y _聚谷氨酸作為一種高分子聚合物，具有一些獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，如生物可 降解性、良好生物相容性、強(qiáng)保水性、對(duì)人體無(wú)毒害等特性。這些特性決定了 Y-聚谷氨酸 在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、環(huán)保、化妝品工業(yè)、煙草、皮革制造工業(yè)和植物種子保護(hù)等領(lǐng)域的廣泛 用途。Y-聚谷氨酸是迄今發(fā)現(xiàn)的少數(shù)幾個(gè)可以利用生物聚合得到得聚谷氨酸之一。PGA 在1937年首次在炭疽芽孢桿菌的芽孢中被發(fā)現(xiàn)(Iva^novics and Brucknerl937 ；Iva人 novics and ErdoE s 1937)。1942年Bovamick等人發(fā)現(xiàn)有些芽孢桿菌屬細(xì)菌能通過(guò)發(fā)酵 培養(yǎng)積累聚谷氨酸，許多研究就此代謝產(chǎn)物而開展。1973年Troy發(fā)現(xiàn)聚谷氨酸(以下 簡(jiǎn)稱Y-PGA)是Bacillus anthracis細(xì)胞夾膜的一種化學(xué)組分，它是一種水溶性的酰胺化 合物，可以通過(guò)芽抱桿菌的變種來(lái)生產(chǎn)。目前日本、韓國(guó)和美國(guó)等一些過(guò)年對(duì)Y-PGA發(fā)酵 的研究處于世界領(lǐng)先水平，很多相關(guān)的生產(chǎn)工藝和技術(shù)已形成專利。其中，日本明治制果公 司已實(shí)現(xiàn)了 Y-PGA商業(yè)化生產(chǎn)，并逐步推廣其應(yīng)用。近年來(lái)，國(guó)外已經(jīng)開始利用分子生物 學(xué)和代謝工程的理論和技術(shù)進(jìn)行Y-PGA合成相關(guān)基因和相關(guān)合成酶的研究。到目前為止， 生物合成Y-PGA的詳細(xì)機(jī)制還不是很清楚。盡管如此國(guó)內(nèi)對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)Y-PGA的研究起步 較晚，雖然最近的幾年內(nèi)取得了很大的進(jìn)展，但較國(guó)外的研究水平還有很大的差距。因此加 強(qiáng)Y-聚谷氨酸的研究，構(gòu)建可降解生物高分子的一個(gè)研究平臺(tái)，具有重要的理論價(jià)值和 應(yīng)用價(jià)值。目前合成γ -PGA的主要方法是化學(xué)合成法、提取法和微生物液態(tài)發(fā)酵法等?；瘜W(xué) 合成法應(yīng)用于PGA的合成，面臨的主要問(wèn)題是工藝路線較長(zhǎng)，副產(chǎn)物多，收率低。由于PGA作 為一種高分子聚合物，其許多物理化學(xué)性質(zhì)與分子量密切相關(guān)，采用化學(xué)合成法得到的PGA 分子量較低，而提高產(chǎn)物分子量必將大大降低產(chǎn)率，因此，該方法不具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。提 取法由于本產(chǎn)品固有的特性，使得提取工藝復(fù)雜，成本較高，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)。Y-PGA的制 備方法主要集中在微生物發(fā)酵合成，生物合成Y -PGA具有突出的優(yōu)點(diǎn)，分子量高、生產(chǎn)條 件溫和、產(chǎn)物純度較高，但微生物發(fā)酵生產(chǎn)Y -PGA產(chǎn)量不高，而且極高的生產(chǎn)成本未能實(shí) 現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，以致影響了該物質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明利用復(fù)合誘變技術(shù)篩選獲得一株Y-聚谷氨酸高產(chǎn)菌株 TKPG091 (Bacillus licheniformis，該菌株于2009年10月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種編號(hào)CGMCC No. 3336 ；分類命名地衣芽孢桿菌；保藏 單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，提高聚谷氨酸的產(chǎn)量，有 效降低了生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)了 聚谷氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用復(fù)合誘變技術(shù)篩選獲得一株Y -聚谷氨酸高產(chǎn)菌株——地衣芽孢桿菌 TKPG091 (Bacillus licheniformis，該菌株現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心，菌種編號(hào)CGMCC No. 3336)，該菌株是以從原產(chǎn)我國(guó)四川省的豆豉中篩選出 的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株NXTK0007為出發(fā)菌株經(jīng)紫外線誘變后得 到的，本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為1.采用多組復(fù)合誘變技術(shù)選育聚谷氨酸高產(chǎn)菌株(1)選擇生長(zhǎng)良好的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株NXTK0007斜 面菌種，用無(wú)菌生理鹽水洗下孢子，制做106個(gè)/mL的孢子懸浮液，于30W紫外燈下，30cm處， 分別照射10S、20S、30S、40S、50S、60S、70S、80S，將菌懸液梯度稀釋涂平板，避光培養(yǎng)，計(jì)算
致死率；(2)根據(jù)(1)致死率選擇高、中、低三個(gè)不同劑量的照射時(shí)間分別對(duì)菌株NXTK0007 的孢子懸浮液進(jìn)行紫外照射處理；(3)然后把(2)三個(gè)不同照射時(shí)間的菌懸液混合均勻，梯度稀釋涂平板，避光培養(yǎng)；(4)將(3)中的誘變菌株接種到以谷氨酸為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(5)將⑷中的種子液以10%接種量接種到以檸檬酸為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中
培養(yǎng)；(6)將⑶中的種子液以10%接種量接種到以甘油為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(7)取(6)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的固體平板上培養(yǎng)，篩選培養(yǎng)基中菌落 邊緣較為整齊，有粘稠感，用接種環(huán)碰觸有拉絲狀，透明圈明顯的菌株，即得高產(chǎn)聚谷氨酸 誘變菌株；(8)取(7)中得到的多株菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C下，220r/m振蕩培養(yǎng) 3d，從中挑選得到聚谷氨酸高產(chǎn)菌株TKPG091。2.地衣芽孢桿菌TKPG091的培養(yǎng)方法為(1)菌種活化將斜面菌種——地衣芽孢桿菌TKPG091 (Bacilluslicheniformis) 轉(zhuǎn)接保藏培養(yǎng)基，37°C活化培養(yǎng)12-24h ；(2)種子培養(yǎng)選取生長(zhǎng)良好的斜面作為種子，利用接種環(huán)接一環(huán)菌體與種子培 養(yǎng)基中，于37°C，200 260r/m下培養(yǎng)1 2d，制得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將(2)中的種子培養(yǎng)液以8 10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng) 基中，在37°C下，220r/m振蕩培養(yǎng)3 5d ；3.地衣芽孢桿菌TKPG091所用到的培養(yǎng)基為(1)保藏分離培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基胰蛋白陳10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L, 瓊脂 15-20g/L, pH 7. 2，121 °C 高壓蒸汽滅菌 15min ；(2)種子培養(yǎng)基K2HP040. 5g/L，檸檬酸鐵銨 0. 5g/L，MgS04 7H20 0. 5g/L，甘油 20.0g/L，檸檬酸 2.0g/L，L-谷氨酸 4. 0g/L，pH 7. 4，121°C 高壓蒸汽滅菌 15min ；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:L-谷氨酸 20. Og/L,檸檬酸 12. Og/L,甘油 80. Og/L, NH4C17. Og/ L, K2HP040. 5g/L, MgS04 7H20 0. 5g/L, FeCl3 6H20 0. 04g/L, CaCl2. 0. 075g/L, MnS04 H20 0. 104g/L, pH 7. 4，121 °C 高壓蒸汽滅菌 15min ；(4)選擇培養(yǎng)基①L-谷氨酸 30.0，NH4C17.0，K2HP04 0. 5，MgS04 7H20 0. 5,FeCl3 '6H200. 04,CaCl2 0. 075，MnS04 H20 0. 104，蒸餾水 1. 0L，用 lmol/L NaOH 調(diào) pH 7. 4，121°C滅菌 15min。②檸檬酸30. 0，NH4C1 7. 0，K2HP04 0. 5，MgS04 7H20 0. 5，F(xiàn)eCl3 6H200. 04，CaCl2 0. 075，MnS04 H20 0. 104，蒸餾水 1. 0L，用 lmol/L NaOH 調(diào) pH 7. 4，121°C滅菌 15min。③甘油30. 0，NH4C17. 0，K2HP040. 5，MgS04 7H20 0. 5，F(xiàn)eCl3 6H20 0. 04，CaCl2 0. 075，MnS04 H20 0. 104，蒸餾水 1. 0L，用 lmol/L NaOH 調(diào) pH 7. 4，121°C滅菌 15min。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果是本發(fā)明的誘變菌株TKPG091與常規(guī)聚谷 氨酸生產(chǎn)菌相比，其聚谷氨酸生產(chǎn)能力更為高，并由此能夠有效提高聚谷氨酸的產(chǎn) 率，降低生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限 制性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1從土壤中篩選出的生產(chǎn)、-聚谷氨酸的菌株地衣芽孢桿菌NXTK00071.菌體形態(tài)菌體呈短桿狀，菌體周圍形成明顯的莢膜，周生菌毛，并被粘液層包 裹。菌體分裂方式二分裂繁殖，從中間逐漸形成隔膜，進(jìn)而分裂成倆個(gè)形態(tài)，大小和構(gòu)造完 全相同的子細(xì)胞。芽孢生長(zhǎng)在菌的中間或一側(cè)。2.菌落形態(tài)在平板上，當(dāng)培養(yǎng)基潮濕時(shí)，菌落大體上呈圓形，表面光滑，周圍相 對(duì)整齊，菌落不透明；當(dāng)培養(yǎng)基干燥時(shí)，菌落粗糙皺褶，中間較為凹陷，邊緣不規(guī)則。3.培養(yǎng)特征此菌為高耗氧菌，最適生長(zhǎng)溫度為28°C 40°C，最適生長(zhǎng)pH6_8 ；在 搖床轉(zhuǎn)速200 250r/min，培養(yǎng)3_4d，pH 6 7時(shí)，聚谷氨酸產(chǎn)量最高。發(fā)酵過(guò)程中溶氧 對(duì)聚谷氨酸的產(chǎn)生具有顯著作用。4.可以利用的碳源葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、檸檬酸、甘油、谷氨酸，上述碳源 一般混合使用，不常用單一碳源。實(shí)施例2以地衣芽孢桿菌NXTK0007為出發(fā)菌株采用多組復(fù)合誘變技術(shù)篩選菌株 TKPG0911.誘變菌株的獲得(1)選擇生長(zhǎng)良好的、-聚谷氨酸生產(chǎn)菌株NXTK0007斜面菌種，用無(wú)菌生理鹽水 洗下孢子，制做106個(gè)/mL的孢子懸浮液，于30W紫外燈下，30cm處，分別照射10s、20s、30s、 40S、50S、60S、70S、80S，菌懸液梯度稀釋涂平板，于37°C避光培養(yǎng)，計(jì)算致死率；(2)選擇40s、60s、80s三個(gè)不同劑量的照射時(shí)間分別對(duì)菌株NXTK0007的孢子懸浮 液進(jìn)行紫外照射處理；(3)然后把三個(gè)不同照射時(shí)間的菌懸液混合均勻，進(jìn)行10倍系列稀釋10—1 10_6， 取10-4、10_5、10-6三個(gè)稀釋度的孢子懸浮液涂布平板，37°C避光培養(yǎng)1 2d ；(4)將上述(3)中的誘變菌株接種到以谷氨酸為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；將種子液置于37°C恒溫?fù)u床，220r/m，振蕩培養(yǎng)1 2d ；(5)將⑷中的種子液以10%接種量(v/v)接種到以檸檬酸為唯一碳源的發(fā)酵培
養(yǎng)基中培養(yǎng)；(6)將(5)中的種子液以10%(v/v)接種量接種到以甘油為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)
基中培養(yǎng)；(7)取(6)中的種子液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-4、10_5、10-6三個(gè)稀釋度的菌懸浮 液，并接種到發(fā)酵培養(yǎng)基固體平板上培養(yǎng)，篩選培養(yǎng)基中菌落邊緣較為整齊，有粘稠感，用 接種環(huán)碰觸有拉絲狀，透明圈明顯的菌株；(8)取(7)中得到的多株菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C下，220r/m振蕩培養(yǎng) 3d，從中挑選得到聚谷氨酸高產(chǎn)菌株TKPG091。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:L-谷氨酸20. 0，檸檬酸12. 0，甘油80. 0，NH4C1 7. 0，K2HP04 0. 5，MgS04 7H20 0. 5，F(xiàn)eCl3 6H20 0. 04，CaCl2 0. 075，MnS04 H200. 104，蒸餾水 1. 0L, pH 7. 4，121°C 滅菌 15min.培養(yǎng)條件500mL搖瓶，裝液量50mL，37°C，220r/m,振蕩培養(yǎng)3 4d.2.誘變菌株TKPG091的特性(1)菌體形態(tài)菌體呈短桿狀，菌體周圍形成明顯的莢膜，菌體分裂方式二分裂繁 殖，從中間逐漸形成隔膜，進(jìn)而分裂成倆個(gè)形態(tài)，大小和構(gòu)造完全相同的子細(xì)胞。芽孢生長(zhǎng) 在菌的中間或一側(cè)。(2)菌落形態(tài)在平板上，當(dāng)培養(yǎng)基潮濕時(shí)，菌落大體上呈圓形，面積較大，菌苔邊 緣整齊，菌落不透明且粘度大，用接種環(huán)碰觸有拉絲狀；當(dāng)培養(yǎng)基干燥時(shí)，菌落粗糙皺褶，中 間較為凹陷，邊緣不規(guī)則。(3)培養(yǎng)特征37°C，180 220r/m下振蕩培養(yǎng)60 72h，發(fā)酵液顏色較淺，穩(wěn)定 為秸稈黃色。(4)可以利用的碳源葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、檸檬酸、甘油、谷氨酸，上述碳 源一般混合使用，不常用單一碳源。(5)可以分別以谷氨酸、檸檬酸、甘油為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，并生長(zhǎng)良好；實(shí)施例3地衣芽孢桿菌TKPG091的培養(yǎng)1.培養(yǎng)基的配制保藏分離培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基胰蛋白陳10g/L，酵母提取物5g/L，NaCllOg/L，瓊脂 15-20g/L，蒸餾水配制，使用lmol/L NaOH調(diào)pH到7. 2，121°C蒸汽滅菌20min。種子培養(yǎng)基成分:K2HP04 0. 5，檸檬酸鐵銨0. 5，MgS04 7H20 0. 5，甘油20. 0，檸檬 酸2. 0，L-谷氨酸4. 0,蒸餾水1. 0L，初始pH 7. 4，121度滅菌15分鐘，培養(yǎng)溫度37°C。發(fā)酵培養(yǎng)基L-谷氨酸20. 0，檸檬酸 12. 0，甘油 80. 0，NH4C1 7. 0，K2HP040. 5， MgS04 7H20 0. 5，F(xiàn)eCl3 6H20 0. 04，CaCl2 0. 075，MnS04 H20 0. 104，蒸餾水 1. 0L,用 lmol/ L NaOH 調(diào) pH 7. 4，121°C滅菌 15min，培養(yǎng)溫度 37°C。2.菌種活化將地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)接TKGA091種子斜面培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)12 24h ；3.種子培養(yǎng)
選擇生長(zhǎng)良好的活化斜面菌種接種于裝有上述1中制得的種子培養(yǎng)基的三角瓶 (500mL三角瓶?jī)?nèi)裝50mL的培養(yǎng)基)中，于37°C，220r/m下培養(yǎng)1 2d ；4.發(fā)酵培養(yǎng)將3中制得的種子培養(yǎng)液以10% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL內(nèi)裝 50mL的培養(yǎng)基)，于37°C，220r/m下培養(yǎng)3d ；檢測(cè)結(jié)果地衣芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TKGA09在發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn) 聚谷氨酸產(chǎn)量為17. 5士2. lg/L。
權(quán)利要求
一株γ-聚谷氨酸高產(chǎn)菌株地衣芽孢桿菌TKPG091(Bacillus licheniformis，該菌株現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種編號(hào)CGMCC No.3336)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株產(chǎn)生其特征在于所述誘變菌株地衣芽孢桿菌 TKPG09KBacillus licheniformis)是以從原產(chǎn)我國(guó)四川省的豆豉中篩選出的地衣芽孢桿 菌(Bacillus licheniformis)菌株NXTK0007為出發(fā)菌株經(jīng)紫外線誘變后得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一株Y-聚谷氨酸高產(chǎn)菌株地衣芽孢桿菌 TKPG091 (Bacilluslicheniformis)，其特征在于菌株的特征為(1)菌體形態(tài)菌體呈短桿狀，菌體周圍形成明顯的莢膜，菌體分裂方式二分裂繁殖， 從中間逐漸形成隔膜，進(jìn)而分裂成倆個(gè)形態(tài)，大小和構(gòu)造完全相同的子細(xì)胞。芽孢生長(zhǎng)在菌 的中間或一側(cè)。(2)菌落形態(tài)在平板上，當(dāng)培養(yǎng)基潮濕時(shí)，菌落大體上呈圓形，面積較大，菌苔邊緣整 齊，菌落不透明且粘度大，用接種環(huán)碰觸有拉絲狀；當(dāng)培養(yǎng)基干燥時(shí)，菌落粗糙皺褶，中間較 為凹陷，邊緣不規(guī)則。(3)培養(yǎng)特征37°C，180 220r/m下振蕩培養(yǎng)60 72h，發(fā)酵液顏色較淺，穩(wěn)定為秸 稈黃色。(4)可以利用的碳源葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、檸檬酸、甘油、谷氨酸，上述碳源一 般混合使用，不常用單一碳源。(5)可以分別以谷氨酸、檸檬酸、甘油為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，并生長(zhǎng)良好。
全文摘要
本發(fā)明利用復(fù)合誘變技術(shù)篩選獲得一株γ-聚谷氨酸高產(chǎn)菌株TKPG091(Bacillus licheniformis，該菌株現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種編號(hào)CGMCC No.3336)，該菌株是以從原產(chǎn)我國(guó)四川省的豆豉中篩選出的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株NXTK0007為出發(fā)菌株經(jīng)紫外線誘變后得到的，在優(yōu)化條件下γ-聚谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到17.5±2.1g/L。
文檔編號(hào)C12P13/02GK101838619SQ20091022837
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者喬長(zhǎng)晟, 徐勇虎, 李雪, 蔣磊, 陳笑 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)