專利名稱：抗人Her2單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、試劑盒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可以特異性識別人Her2分子，用于腫瘤的診斷、預(yù)后 判斷，或指導(dǎo)治療腫瘤的抗人Her2單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、 試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，僅次于宮頸癌，在女性惡性 腫瘤發(fā)病率中居第2位。全世界每年約有120萬婦女發(fā)現(xiàn)乳腺癌，有50萬
婦女死于乳腺癌。北美、北歐是乳腺癌的高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率約為亞、非、 拉美地區(qū)的4倍。我國是乳腺癌的低發(fā)地區(qū)，但其發(fā)病率正逐年上升，尤 其滬、京、津等大城市及沿海地區(qū)。城市和農(nóng)村女性乳腺癌有差別，城市 愈大，乳腺癌發(fā)病率愈高，城市各年齡組乳腺癌死亡率均高于農(nóng)村。乳腺 癌在女性的發(fā)病率隨著年齡的增長而上升，在月經(jīng)初潮前罕見，20歲前亦 少見，但20歲以后發(fā)病率迅速上升。45 50歲較高，但呈相對的平坦，絕 經(jīng)后發(fā)病率繼續(xù)上升，到70歲左右達最高峰；死亡率也隨年齡而上升，在 25歲以后死亡率逐步上升，直到老年時始終保持上升趨勢。
人表皮生長因子受體-2 (human epidermal growth factor receptor-2， Her2)是表皮生長因子受體家族(EGFR)的第二類成員，目前尚未發(fā)現(xiàn)其自身 的特異性配體。Her2/neu基因，又名c-erbB2，其編碼的產(chǎn)物為185,000 的糖蛋白pl85，具有酪氨酸激酶活性，在結(jié)構(gòu)上與表皮生長因子受體EGFR 具有同源性。Pl85與許多生長因子受體都參與絲裂原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Her2/neu 基因的過表達在腫瘤形成中起重要作用。人類多種腫瘤包括乳腺癌、卵巢 癌、肺癌、胰腺癌等均有Her2/neu的過表達，其在乳腺癌中的過表達達 30%。多項研究表明抗p185蛋白的單抗能在體內(nèi)和體外實驗中抑制 Her2/neu過表達的腫瘤細胞的生長。
Her2/neu是跨膜受體，可用多種實驗方法直接作用于其胞外域，因而 是一種理想的治療革E向。體內(nèi)外實驗均證明，抗Her2/neu單克隆抗體能抑 制過表達Her2/neu的乳腺癌細胞生長。以Her2為靶抗原的抗體介導(dǎo)己成
3為有效的生物治療手段。美國FDA于1998年批準(zhǔn)一種Her2人源化改良型 抗體群司珠單抗(trastuzumab;又稱赫賽汀，HERc印tin)上市治療轉(zhuǎn)移性 乳腺癌，將乳腺癌的療效提高了約20%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抗人Her2單克隆抗體雜交瘤
細胞系、單克隆抗體，其可以識別人類Herf抗原，可以為腫瘤特別是乳腺
癌的診斷及治療提供有力工具。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種抗人Her2單
克隆抗體雜交瘤細胞系，所述細胞系的保藏號為CGMCC NO. 2748。
一種抗人HER2單克隆抗體，由保藏號為CGMCC NO. 2748雜交瘤分泌。
所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgM/K亞型。
所述的抗人Her2單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑或指導(dǎo)治療腫瘤的
檢測中的應(yīng)用。
一種免疫檢測試劑盒，含有至少一種上述的單克隆抗體。 所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤；或評價惡性腫瘤的發(fā)展和預(yù)
后；或指導(dǎo)惡性腫瘤的治療中的用途。 本發(fā)明的有益效果
1、 所制備的抗體可以特應(yīng)性識別人類Her2抗原，其識別表位滿足用 于免疫組織化學(xué)染色法檢測人類組織中的Her2抗原的要求。
2、 所組裝的試劑盒方便有效、靈敏度高，可以用于臨床標(biāo)本檢測，為 診斷和預(yù)后判斷提供依據(jù)。


圖1是Her2胞外區(qū)編碼基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。1為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分 子量marker, 2為擴增的Her2基因。
圖2是純化的Her2蛋白的SDS-PAGE電泳圖。1為未經(jīng)誘導(dǎo)的全細菌裂
解液，2為IPTG誘導(dǎo)的全細菌裂解液，3為誘導(dǎo)的細菌裂解上清，4為誘
導(dǎo)的細菌裂解沉淀，5為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白marker, 6為純化后的Her2蛋白
圖3是本發(fā)明的試劑盒染色的SK-Br3細胞(標(biāo)本為于載玻片上培養(yǎng)的 SK-Br3細胞)。圖4是本發(fā)明的試劑盒染色的293細胞(標(biāo)本為于載玻片上培養(yǎng)的293 細胞)。
圖5是本發(fā)明試劑盒染色的SK-Br3細胞，左側(cè)為HIHer2抗體染色， 右側(cè)為PBS陰性對照(標(biāo)本為于載玻片上培養(yǎng)的SK-Br3細胞)。
制備特異結(jié)合Her2抗原分子的鼠抗人單克隆抗體的雜交瘤保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCN0: 2748，保藏日2008 一11一19，分類命名為小鼠抗人Her2雜交瘤細胞系。
具體實施例方式
制備特異結(jié)合Her2抗原分子的鼠抗人單克隆抗體的雜交瘤保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCCN0: 2748，保藏日2008 —11一19，分類命名為小鼠抗人Her2雜交瘤細胞系。
下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明 一種抗人Her2單克隆抗體雜交瘤細胞系，所述細胞系的保藏號為CGMCC NO. 2748。
一種抗人Her2單克隆抗體，由保藏號為CGMCC NO. 2748雜交瘤分泌。
所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgM/ic亞型。
所述的抗人Her2單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑或指導(dǎo)治療腫瘤的
檢測中的應(yīng)用。
一種免疫檢測試劑盒，含有至少一種上述的單克隆抗體。 所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤；或評價惡性腫瘤的發(fā)展和預(yù)
后;或指導(dǎo)惡性腫瘤的治療中的用途。
本發(fā)明是通過傳統(tǒng)雜交瘤融合技術(shù)得到一株鼠抗人單克隆抗體。該抗
體特異的識別表達在人類細胞上的表皮生長因子受體家族成員erbB-2，即
Her2分子。
1、 Her2蛋白的制備 (1)引物的設(shè)計
根據(jù)GenBank中登錄的Her2編碼基因序列(NM—004448. 2)，設(shè)計胞外 區(qū)引物
Her2-pET41d-F: 5' -GGGATCCGAATTCGTGGGCGAGGGCCTGGCCTG-3 Her2-pET41d-R: 5' -TGGTGGTGCTCGAGAGGCTGGCATGCGCCCTCCTC-3(2) Her2胞外區(qū)編碼基因的擴增
采用RT-PCR方法。使用Trizol試劑盒按說明從高表達Her2的SK-Br3 細胞系中提取總RNA。以提取的總RNA為模板，01 igo (dT)為引物，合成cDNA， 用于PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件94'C預(yù)變性5min;94。C變性lmin，55。C退火lmin， 72。C延伸1.5min,共進行30次循環(huán)；最后72。C延伸10min。
(3) 目的基因的克隆及測序
將回收的目的基因克隆入PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a 。
(4) 原核表達載體pET41d/HER2的構(gòu)建
將質(zhì)粒PMD18-T/HER2用和JMt雙酶切，回收的目的片段與用 同樣酶酶切的原核表達載體pET41d連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a。
(5) 目的蛋白的誘導(dǎo)表達
將重組質(zhì)粒pET41d/HER2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取生長良好的 單菌落接種到5 ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37"C震蕩培養(yǎng)過夜。 取過夜培養(yǎng)的菌液5ml轉(zhuǎn)移到500ml含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培 養(yǎng)至A,二O. 6，加入0. 5廳1/L的IPTG， 16°C 200rpm/min過夜誘導(dǎo)大量 表達。
(6) 表達產(chǎn)物的純化
收集菌體沉淀，重懸于1/30培養(yǎng)體積的裂解緩沖液(50腿ol/L Tris-HCl、 100腿ol/LNaCl、 lmmol/L EDTA)中，超聲破菌后，4°C 12000g 離心30min。沉淀重懸于1/30培養(yǎng)體積的包涵體溶解緩沖液(給出成分)， 4°C 12000g離心30min，收集包涵體。用1/40培養(yǎng)體積的6mol/L鹽酸胍、 0. lmol/L Tris-HCl (pH7. 0)溶液于4。C搖動過夜溶解包涵體。收集上清， 利用表達載體上的組氨酸標(biāo)簽進行親和層析純化。平衡鎳柱后上樣，分別 用6個柱體積的結(jié)合緩沖液洗柱，4個柱體積的洗滌緩沖液洗柱，最后用6
個柱體積的咪唑洗脫液洗脫結(jié)合在鎳柱上的目的蛋白。為了去除純化洗脫 時咪唑等小分子成分，將純化蛋白裝入透析袋，置于PBS緩沖液中透析12h， 期間更換3次透析液。最后透析袋中即為制備的Her2蛋白 2、 鼠抗人Her2單克隆抗體制備與檢定
(1)制備
I、免疫使用原核表達的Her2融合蛋白常規(guī)方法免疫6周齡Balb/c小鼠，皮下注射。首次基礎(chǔ)免疫使用福氏完全佐劑，每隔2周進行一次加強 免疫，使用不完全福氏佐劑，共三次，每次每只100iig，融合前4天末次
免疫，脾內(nèi)注射，每只50yg。
II、 融合取小鼠脾細胞與NS-1細胞系融合，融合劑采用50%PEG (MW 1,540)。
III、 篩選用原核表達的Her2融合蛋白包被酶標(biāo)板，以間接ELISA法 進行第一步篩選；轉(zhuǎn)化了Her2基因，表達Her2融合蛋白的酵母細胞為靶 細胞，以細胞ELISA法進行第二步篩選；SK-Br3為靶細胞，以免疫組化實驗 進行第三步篩選，最終得到陽性克隆。
IV、 克隆化以有限稀釋法克隆化2 3次，取培養(yǎng)上清重復(fù)上述第二、 三步篩選，得到穩(wěn)定分泌抗體的細胞株。
V、 保存將陽性雜交瘤細胞株于液氮中保存。
VI、 抗體工作液制備復(fù)蘇凍存的雜交瘤細胞株，于RPMI-1640培養(yǎng)液 中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37t:， 5%C02，擴大培養(yǎng)并收集培養(yǎng)上清，其中即含鼠 抗人Her2抗體。
3、 試劑盒操作方法
(1) 標(biāo)本放入固定液中(甲醇丙酮二l: 1)固定90秒，晾干，做好標(biāo)記。
(2) 加鼠抗人服R2抗體工作液(蓋滿標(biāo)本)30 — 50分鐘，室溫。用PBS 將抗體沖凈，用PBS浸泡2次，每次5分鐘。
(3) 加生物素一羊抗鼠二抗
(4) 加堿性磷酸酶一鏈霉卵白素(蓋滿標(biāo)本)20_40分鐘，室溫。用 PBS將抗體沖凈，用PBS浸泡2次，每次5分鐘。
(5) 顯色取lml底物液溶解lmg堅固紅(現(xiàn)用現(xiàn)配)滴加于標(biāo)本上， 顯色10-20分鐘。鏡下觀察，待胞膜或胞漿出現(xiàn)明顯的紅色，蒸餾水輕輕 沖凈，晾干。
(6) Mayer蘇木素復(fù)染60分鐘，蒸餾水沖凈；用O. 5%氨水返藍5秒，蒸 餾水沖凈晾干。
標(biāo)本如需保存用明膠甘油封片。
如圖3、 4、 5所示，圖3是本發(fā)明的試劑盒染色的于載玻片上培養(yǎng)的
7SK-Br3細胞。圖4是本發(fā)明的試劑盒染色的于載玻片上培養(yǎng)的293a細胞。 圖5是于載玻片上培養(yǎng)的SK-Br3細胞，左側(cè)為Her2單克隆抗體染色，右 側(cè)為PBS對照。
本發(fā)明的雜交瘤細胞系分泌的能夠特異結(jié)合人類Her2抗原分子的鼠抗 人Her2單克隆抗體，識別人類正常細胞和腫瘤細胞表面表達的Her2分子 胞外區(qū)部分。該抗體可以用于人類組織特別是乳腺癌組織的診斷和治療。
本發(fā)明利用傳統(tǒng)的雜交瘤制備技術(shù)，獲得穩(wěn)定分泌抗人Her2分子單克 隆抗體的雜交瘤細胞株，由此獲得的單克隆抗體與通用SAP試劑盒組裝檢 測人類Her2抗原的免疫組化試劑盒。
本發(fā)明的目的旨在制備抗Her2/neu的特異性單抗，并且篩選出分泌能 夠結(jié)合天然Her2/neu抗原，用于免疫組化抗體的雜交瘤細胞株，用于指導(dǎo) 乳腺癌的治療和預(yù)后評估。
綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的 有識之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例， 但這種實施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種抗人Her2單克隆抗體雜交瘤細胞系，其特征是所述細胞系的保藏號為CGMCC NO.2748。
2、 一種抗人Her2單克隆抗體，其特征是由保藏號為CGMCC NO. 2748雜交瘤分泌。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人Her2單克隆抗體，其特征是所述的抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgM/K亞型。
4、 權(quán)利要求2-3中任一項所述的抗人Her2單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑或指導(dǎo)治療腫瘤的檢測中的應(yīng)用。
5、 一種免疫檢測試劑盒，其特征是含有至少一種權(quán)利要求2 — 3所述的單克隆抗體。
6、 權(quán)利要求5所述的免疫檢測試劑盒在診斷惡性腫瘤；或評價惡性腫瘤的發(fā)展和預(yù)后；或指導(dǎo)惡性腫瘤的治療中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人Her2單克隆抗體雜交瘤細胞系、單克隆抗體、試劑盒及其用途，能夠在體內(nèi)外特異性結(jié)合人類Her2抗原，鑒別不同水平表達Her2的人類正?；蚰[瘤細胞。所述細胞系的保藏號為CGMCCNO.2748，單克隆抗體由保藏號為CGMCC NO.2748雜交瘤分泌。抗體是鼠源性單克隆抗體，屬于IgM/κ亞型。本發(fā)明采用經(jīng)典雜交瘤制備技術(shù)成功制備抗人Her2單克隆抗體，為腫瘤特別是乳腺癌的診斷和指導(dǎo)治療提供了一種有效的檢測手段。
文檔編號C12N5/20GK101463344SQ200910067698
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者何大水, 馮春玲, 劉紅芹, 浩 屈, 毅 張, 張麗艷, 朱衛(wèi)彬, 王冬梅, 晨 田, 琳 石, 黃麗華 申請人:協(xié)和干細胞基因工程有限公司