專(zhuān)利名稱(chēng)：：應(yīng)用紫外線誘變甘藍(lán)型油菜離體小孢子和突變體篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種應(yīng)用紫外線誘變甘藍(lán)型油菜離體小孢子和突變體的篩選方法
背景技術(shù)：
用物理射線或化學(xué)誘變劑誘變油菜種子或者油菜的組織器官和單細(xì)胞是創(chuàng)造新種質(zhì)和改良品種以及建立突變體庫(kù)的重要方法之一。但是通過(guò)誘變種子、組織器官和多細(xì)胞愈傷組織產(chǎn)生的突變體是突變和沒(méi)突變基因的嵌合體，隱性基因突變于當(dāng)代不表現(xiàn)，不能識(shí)別。因此，發(fā)現(xiàn)和選擇穩(wěn)定的突變體必須通過(guò)自交，尤其是隱性基因和多基因控制的性狀需要多代自交才能獲得基因純合、遺傳穩(wěn)定的突變體。獲得突變體的周期長(zhǎng)、費(fèi)用高。用射線和化學(xué)誘變劑直接誘變單細(xì)胞小孢子，并用秋水仙堿等染色體加倍劑處理小孢子，使其染色體二倍化。由此小孢子產(chǎn)生的雙單倍體植株(DH)的突變基因是純合的，突變性狀可穩(wěn)定遺傳，不存在嵌合體和顯性基因掩蓋隱性基因的雜合體，不需要自交程序。加拿大的Swanson等(Swanson等,Microsporemutagenesisandselection:Canolaplantswithfieldtolerancetotheimidazolinones,TheorA卯lGenet，1989(78):525-53)用r-射線和乙基亞硝基脲和我國(guó)的和江明等(和江明等，用EMS誘變和小孢子培養(yǎng)快速獲得甘藍(lán)型油菜高油酸種質(zhì)材料的研究，西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003,16(2):34-36)用甲基磺酸乙脂誘變甘藍(lán)型油菜小孢子，分別獲得抗除草劑和高油酸的突變體。西班牙的Baxro等(Barro等,DoubledhaploidlinesofBrassiescarinat3withmodifiederucicacidcontentthroughmutagenesisbyEMStreatmentofisolatedmicrospores，PlantBreeding，2001，120:262-264)用甲基磺酸乙脂誘變埃塞俄比亞芥小孢子，使芥酸含量發(fā)生了廣泛變異。由此可見(jiàn)，化學(xué)誘變劑用于油菜小孢子誘變?nèi)〉昧撕玫男Ч?。但是用化學(xué)誘變劑誘變離體小孢子的實(shí)驗(yàn)操作程序過(guò)于繁瑣。小孢子被化學(xué)誘變劑處理后必須通過(guò)離心把誘變劑清除掉，再進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚狀體。操作步驟多，小孢子易污染，誘變成功率低。而且誘變劑為致癌物，在操作過(guò)程中可能污染環(huán)境，甚至對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有毒害。其次藥品價(jià)格貴，費(fèi)用高。用物理射線誘變離體小孢子操作程序簡(jiǎn)便，尤其是采用安裝在超凈臺(tái)上的紫外燈輻照小孢子既簡(jiǎn)便又安全。英國(guó)的Ahmad等從紫外線照射甘藍(lán)型菜離體小孢子的再生植株中獲得了抗除草劑和抗黑斑病的突變體(Ahmad等,HaploidCultureandUVMutagenesisinRapid-cycling5rass/ca朋/HAfortheGenerationofResistancetoChlorsulfuronand/4Aei-朋/'ia力i"a5s/cj'ccr/汰AnnalsofBotany,1991，67:521-525)。日本的Zhang等用紫外線處理大白菜的離體小孢子，其再生植株中出現(xiàn)了抗軟腐病的突變體(ZhangFeng-lan等，MicrosporeMutagenesisandInvitroSelectionforResistancetoSoftDiseaseinChineseCabbage(5!ra5^'cac棚pesWsL.ssp.Pekinensis).BreedingScience,1999，49:161-166)。西班牙的Barro等用紫外線輻照埃塞俄比亞芥的離體小孢子，從誘變小孢子的再生植株中獲得了低硫甙和高硫武以及高芥酸突變體(Baxro等,ModificationofGlucosinolateandErucicAcidContentsinDoubledHaploidlinesof"rassic"car/朋tsbyUVTreatmentofIsolatedMicrospores.E叩hytica，2003，129:卜6)。上述結(jié)果表明，紫外線對(duì)油菜小孢子具有誘變效應(yīng)，可作為油菜小孢子的誘變工具。同時(shí)上述報(bào)道為紫外線誘變油菜離體小孢子技術(shù)的深入研究奠定了基礎(chǔ)。但是諸研究者所使用的紫外燈功率和照射劑量率不同，離體小孢子離紫外燈的距離和輻照時(shí)間不同，測(cè)定的小孢子半致死劑量(LD5。)的照射時(shí)間差異很大。而且均沒(méi)有研究照射時(shí)間和劑量率與變異的相關(guān)性，不明確采用多大的劑量率和多長(zhǎng)的照射時(shí)間能獲得更多的變異，至今沒(méi)有對(duì)紫外線誘變離體小孢子的理論和方法進(jìn)行系統(tǒng)的研究，該技術(shù)還未成熟，更未程序化。我們采用安裝在超凈臺(tái)上的紫外燈對(duì)甘藍(lán)型油菜離體小孢子進(jìn)行了系統(tǒng)地誘變研究。根據(jù)小孢子被紫外線誘變后的產(chǎn)胚量(以沒(méi)被誘變的小孢子的產(chǎn)胚量為對(duì)照)和其再生植株的突變率和突變譜確定有效的照射劑量、照射時(shí)間和照射方法，建立了油菜離體小孢子紫外線誘變方法。同時(shí)建立了誘變小孢子單倍體二倍化的雙單倍體植株(DH)再生技術(shù)，為油菜品種遺傳改良和油菜建立突變體庫(kù)創(chuàng)造了新種質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提出一種油菜小孢子離體紫外線(UV)誘變、創(chuàng)造突變體和突變體的篩選方法。本發(fā)明的技術(shù)方案和步驟如下1、分離純化小孢子在花期于田間取甘藍(lán)型油菜植株的主莖或分枝上小孢子發(fā)育到單核晚期的花蕾，用70%乙醇溶液和0.1%升汞水溶液浸泡花蕾滅菌(以下操作均在超凈臺(tái)進(jìn)行)，然后用無(wú)菌水沖洗3次。滅了菌的花蕾放入無(wú)菌的試管(注以下所有器皿均無(wú)菌)中，用玻棒搗碎，并加入13%蔗糖的小孢子提取液。將搗碎的花蕾和提取液倒入裝有孔徑44"m的網(wǎng)篩的漏斗中過(guò)濾，除掉萼片、花瓣等體細(xì)胞組織，將含小孢子的濾液接入離心管。將離心管放入離心機(jī)離心3次，去掉體細(xì)胞組織，獲得純化的小孢子。小孢子提取液的配制蔗糖130g加蒸餾水溶解，定溶至1000ml,pH5.8-6.0,分裝在三角瓶中，于121'C高壓蒸汽滅菌20分鐘。2、小孢子誘變和染色體加倍將步驟1純化了的小孢子懸浮在添加70mg/L秋水仙堿的改良的NLN培養(yǎng)基(見(jiàn)Lichter，R.AntherCultureof5rsssica朋，sinaLiquidMedium.Z.Pflanze叩hysiol，1981，103:229-237)，并分裝入培養(yǎng)皿中。含小孢子的培養(yǎng)皿(不蓋蓋)置于距離紫外燈15cm位置處，照射95-100秒，然后蓋上蓋，并用石臘封膜將皿封住，放入32'C的培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)2天，進(jìn)行小孢于染色體加倍。之后將培養(yǎng)皿中含小孢子的培養(yǎng)液用吸管移入離心管離心1次，棄去秋水仙堿的培養(yǎng)基，再將無(wú)秋水仙堿的改良的NLN'培養(yǎng)基加入離心管，懸浮小孢子，并倒入培養(yǎng)皿，用石臘封膜封好蓋。本發(fā)明的改良NLN培養(yǎng)基配方如下KN03125mg/L，MgS04*7H20125mg/L,KH2P04125mg/L,Ca(N03)24H20750mg/L(原配方是500mg/L)，*Na2EDTA37.3mg/L，*FeS04.7H2027.8mg/L(*原配方是FeEDTA40mg/L)，MnSO,糊25mg/L(原配方是M威腿7.37mg/L)。KI0.83mg/L(原配方中沒(méi)有KI)，貼0310rag/L,2nS04.他O10mg/L,Na風(fēng)'2H200.25mg/L,CoCl2.6H200.025mg/L,CuS045H200.025mg/L，肌醇lOOmg/L,煙酸5mg/L，維生素B,O.5mg/L，維生素B60.5mg/L，葉酸0.5mg/L,生物素0.05mg/L，甘氨酸5.Orag/L(原配方是2.Omg/L)，谷胱甘肽30mg/L，谷氨酰胺800mg/L,絲氨酸100mg/L:蔗糖130g/L，PH5.8-6.0，用孔徑0.22uM的微孔濾膜抽濾滅菌。紫外燈照射小包子的劑量和參數(shù)懸掛在超凈工作臺(tái)上的直管型(ZSZ30D)紫外線燈功率是30W,波長(zhǎng)253.7nm，被照射的油菜小孢子距離紫外燈15cm。3、小孢子培養(yǎng)和胚狀體誘導(dǎo)將步驟2懸浮在無(wú)秋水仙堿培養(yǎng)基中的油菜小孢子置于約25'C的培養(yǎng)室進(jìn)行靜止暗培養(yǎng)。當(dāng)肉眼可見(jiàn)的胚狀體出現(xiàn)后，把培養(yǎng)皿放入震蕩器，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)(50轉(zhuǎn)/分)。當(dāng)胚狀體發(fā)育到魚(yú)雷后期到子葉初期時(shí)停止震蕩培養(yǎng)。4、誘導(dǎo)小植株將步驟3得到的魚(yú)雷后期至子葉初期的胚狀體接種在附加2%蔗糖的B5固體培養(yǎng)基(GamboryL等，NutrientsRequirementsofSuspensionCulturesofSoybeenRootCells.Exp.CellRes.1968,50:151-158)，于培養(yǎng)室(約25°C，光照強(qiáng)度3000LUX，12小時(shí)/大光照)，誘導(dǎo)胚狀體發(fā)芽，得到完整小植株或畸形小植株；5.誘導(dǎo)壯苗將步驟4的小植株或畸形小植株切除根，轉(zhuǎn)入B5壯苗培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根，培育壯苗。B5壯苗培養(yǎng)基的配制原B5培養(yǎng)基組分，另加0.12mg/L多效唑，原要求分析級(jí)蔗糖改用廉價(jià)食用蔗糖，蔗糖濃度2%，9g/L瓊脂，用自來(lái)水補(bǔ)足至l升，pH5.8-6.0，12rC高壓蒸汽滅菌20分鐘。6.油菜小孢子再生植株移栽到田間培育的油菜小孢子再生植株于5月或6月從試管中直接移栽到夏繁基地的田間，或者于10月下旬移栽到田間(湖北省武漢市)。7.突變體的選擇從苗期至結(jié)角期于田間目測(cè)確認(rèn)形態(tài)變異植株，并于花期對(duì)所有誘變的油菜小孢子產(chǎn)生的植株套袋，迫使其自花傳粉產(chǎn)生自交種子。采用近紅外反射光譜儀(型號(hào)Bruker，Vector22/N)檢測(cè)自交種子中的含油量、芥酸和硫代葡萄糖甙的含量，用高效液相色譜儀(型號(hào)Waters2487-717-600)復(fù)査硫代葡萄糖甙含量，篩選品質(zhì)性狀突變體。8.突變體的遺傳穩(wěn)定性鑒定將形態(tài)變異體和品質(zhì)變異體的種子于油菜的止常種植季節(jié)播種到田間，采用步驟7的方法進(jìn)一步鑒定其遺傳穩(wěn)定性。本發(fā)明的效果1.本發(fā)明的實(shí)施結(jié)果表明，紫外線對(duì)油菜離體小孢子具有較強(qiáng)的誘變效應(yīng)。在誘變的5個(gè)品系油菜小孢子再生植株群體中，出現(xiàn)了雄性不育(圖2)，無(wú)花瓣(圖3)、植株的心葉紫黃色(圖4)、花瓣白色，種皮深棕色等22種變異性狀，變異率10.53-21.57%。沒(méi)有誘變(對(duì)照)的油菜小孢子再生植株出現(xiàn)早開(kāi)花多分枝、淡黃色花、葉片淡綠、光葉、種皮深棕色等6種變異性狀，變異率為5.08-7.69%。表明本發(fā)明明顯提高了油菜突變譜和突變率(見(jiàn)表l)。誘變小孢子再生植株的種子品質(zhì)性狀發(fā)生了廣泛變異。誘變?cè)偕?個(gè)DH群體中低于和高于小孢子供體硫代葡萄糖甙含量的最低和最高值植株比率是25.53-78.70%,對(duì)照是13.56-23.68%。誘變?cè)偕?個(gè)DH群體中低于和高于小孢子供體含油量的最低值和最高值的株率是22.22-59.09%,對(duì)照是9.21-19.23%。誘變?cè)偕?個(gè)DH群體中，低于和高于小孢子供體芥酸含量的最低值和最高值的株率是38.89-46.97%,對(duì)照是18.42-20.34%(見(jiàn)表2-1和表2-2)。2.利用紫外燈用于油菜小孢子離體誘變具有射線源利用方便，比使用化學(xué)誘變劑對(duì)操作人員安全和簡(jiǎn)便、省時(shí)及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。例如，純化了的小孢子于培養(yǎng)皿中被照射95-100秒后，用石臘封膜封好培養(yǎng)皿，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚狀體，3分鐘可完成誘變流程，污染機(jī)率低。3.本發(fā)明建立的小孢于離體誘變和植株再生體系使TILLING技術(shù)(targetinginducedlocallesionsingenomes)能在大規(guī)模的突變基因篩選中發(fā)揮應(yīng)有的作用。4.本發(fā)明建立的油菜小孢子離體誘變和植株再生方法與離體抗逆境(抗冷、抗病、抗除草劑等)篩選技術(shù)結(jié)合，可以快速獲得有益種質(zhì)資源。5.本發(fā)明建立的小孢子離體誘變和植株再生系統(tǒng)可在胚狀體階段用子葉測(cè)定篩選品質(zhì)性狀突變體'從子葉提取DNA進(jìn)行遺傳研究。6.本發(fā)明建立的小孢子離體誘變和植株再生技術(shù)也適用于十字花科其它作物的小孢子離體誘變和突變體篩選。圖l:本發(fā)明技術(shù)路線圖；圖2:本發(fā)明獲得的甘藍(lán)型油菜雄性不育突變株；圖3:本發(fā)明獲得的甘藍(lán)型油菜無(wú)花瓣突變株；圖4:本發(fā)明獲得的甘藍(lán)型油菜心葉紫黃色突變株。具體實(shí)施方式實(shí)施例l甘藍(lán)型油菜小孢子的分離和離體誘變?cè)谟筒说幕ㄆ?，于試?yàn)田取甘藍(lán)型油菜品種中油821、華雙5號(hào)、華雙2號(hào)、華黃1號(hào)、華油8號(hào)(上述品種為中國(guó)公開(kāi)推廣的甘藍(lán)型油菜品種)植株的主莖或分枝花序，帶到實(shí)驗(yàn)室，選擇小孢于發(fā)育到單核晚期的花蕾，然后將花蕾放在70%乙醇水溶液中浸泡0.5-1分鐘，再于0.1%升汞水溶液中浸泡8-10分鐘(以下操作均在超凈臺(tái)進(jìn)行)，隨后用無(wú)菌水沖洗3次。表面滅了菌的花蕾放入無(wú)菌的試管(以下所用器皿均經(jīng)過(guò)滅菌)中，用玻棒碾碎，然后加含13%蔗糖的小孢子提取液到試管中(依花蕾的數(shù)量確定加入量)。將碾碎的花蕾和提取液倒入裝有孔徑44nm的網(wǎng)篩的漏斗(下接離心管)中過(guò)濾，除掉萼片和花瓣等大體細(xì)胞組織，將含小孢子的濾液接入離心管。將離心管放入離心機(jī)離心，1000轉(zhuǎn)/pm，5分鐘。隨后用吸管吸出離心管中含體細(xì)胞組織的懸浮液，再加小孢子提取液懸浮沉淀在離心管底部的小孢子，按第一次離心的轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間進(jìn)行第二次離心。第三次離心，800轉(zhuǎn)/pra，3分鐘，分離出純化的小孢子。將分離純化的油菜小孢子懸浮在附加70mg/L秋水仙堿改良的NLN培養(yǎng)基中，按120000/ml小孢子密度分裝在7.5ml的培養(yǎng)皿中，每皿6ml。然后把培養(yǎng)皿(不蓋蓋)放在距離紫外燈15cm處，照射95秒(在另外的實(shí)施例為IOO秒)，蓋上蓋，并用石臘封膜將皿封住，放入32'C的培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。小孢子提取液配制130g蔗糖加蒸餾水溶解，并加蒸餾水定溶至1000ml，pH5.8-6.0，121'C高壓蒸汽滅菌20分鐘。改良的NLN培養(yǎng)基配方跳125mg/L，MgS(X7H20125mg/L'KH2P04125mg/L，Ca(N03)2他0750mg/L(原配方是500mg/L)，*Na2EDTA37.3mg/L,*FeS04.7H2027.8mg/L(*原配方是FeEDTA40mg/L),MnS044H2025mg/L(原配方是MnsO，.腿7.37mg/L)，KI0.83mg/L(原配方中沒(méi)有KI)，貼0310mg/L,2nS0.,'4H20lOmg/L,Na2MA'2H200.25mg/L，CoCl2.6H200.025mg/L，CuS04'5H200.025mg/L,肌醇100mg/L，煙酸5mg/L,維生素B,0.5mg/L，維生素BeO.5mg/L，葉酸0.5mg/L，生物素0.05mg/L，甘氨酸5.0mg/L(原配方是2.Omg/L),谷胱甘肽30rag/L,谷氨酰胺800mg/L，絲氨酸100mg/L;蔗糖130g/L,pH5.8-6.0，用孔徑0.22uM的微孔濾膜抽濾滅菌。實(shí)施例2甘藍(lán)型油菜小孢子染色體加倍和胚狀體誘導(dǎo)將懸浮在秋水仙堿NLN培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)紫外線照射的油菜小孢子在32r的培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)2天進(jìn)行染色體加倍。之后，于超凈工作臺(tái)將培養(yǎng)皿中含小孢子的秋水仙堿培養(yǎng)基用吸管移入離心管中離心(500轉(zhuǎn)/分'3分鐘)，沉淀小孢子。再用吸管吸掉秋水仙堿培養(yǎng)基，把無(wú)秋水仙堿的改良的NLN培養(yǎng)基6ml加入離心管，懸浮小孢子，然后倒入直徑7.5ml培養(yǎng)皿，用石臘封膜封住蓋，放于約25'C的培養(yǎng)室靜止暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚狀體。實(shí)施例3甘藍(lán)型油菜再生植株的誘導(dǎo)當(dāng)于約25。C下暗培養(yǎng)的小孢子產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的小胚狀體時(shí)(一般在小孢子分離IO天后)，把培養(yǎng)皿放入震蕩器，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)(50轉(zhuǎn)/分)。在胚狀體發(fā)育到魚(yú)雷后期到子葉初期時(shí)停止震蕩培養(yǎng)'將其轉(zhuǎn)接到附加2%蔗糖的B5固體培養(yǎng)基，并于25'C左右的培養(yǎng)室培養(yǎng)(每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度3000LUX)，誘導(dǎo)胚狀體發(fā)芽。當(dāng)胚狀體產(chǎn)生帶葉和莖的小植株或畸形小植株時(shí)，切除這些小植株的根，然后轉(zhuǎn)入附加0.12mg/L多效唑的B5壯苗培養(yǎng)基，培育健壯的再生植株。上述B5壯苗培養(yǎng)基的配制采用原B5培養(yǎng)基組分，附加0.12mg/L多效唑，將原B5培養(yǎng)基要求的分析級(jí)蔗糖改用廉價(jià)食用蔗糖，濃度2%，用9g/L瓊脂固化，蒸餾水由自來(lái)水代替，定溶至1升，pH5.8-6.0,12rC高壓蒸汽滅菌20分鐘，備用。實(shí)施例4甘藍(lán)型油菜小孢子再生的突變植株的鑒定和選擇于10月底，用鑷子將試管中的再生植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基后立即移栽到湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。在再生植株生長(zhǎng)期間，觀察其農(nóng)藝性狀與小孢子供體植株的差異，并于花期將變異植株和所有再生植株套袋自交。于成熟期收自交種子，種子曬干后用近紅外反射光譜儀(Bruker,Vector22/N)檢測(cè)自交種子中的含油量、芥酸和硫代葡萄糖甙等成分的含量。用高效液相色譜儀(Waters2487-717-600)復(fù)測(cè)硫代葡萄糖甙含量，篩選品質(zhì)性狀變異體。篩選的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀發(fā)生變異的植株的種子于9月底播種到華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，進(jìn)一步觀察其變異性狀是否為穩(wěn)定遺傳，同時(shí)于花期對(duì)所有再生植株套袋自交，收獲的種子再次進(jìn)行品質(zhì)分析，鑒定其遺傳穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)兩個(gè)季節(jié)的重復(fù)鑒定，從5個(gè)誘變的品種中獲得了穩(wěn)定遺傳的甘藍(lán)型油菜雄性不育植株(圖2)、無(wú)花瓣植株(圖3)和心葉紫黃色植株(圖4)，花瓣白色植株，種皮深棕色植株等22種形態(tài)性狀突變體，變異株率達(dá)10.53-21.57%。未誘變處理的小孢子(對(duì)照)產(chǎn)生了早花多分枝，花瓣淡黃色，葉片淡綠色等6種突變體，變異率5.08-7.69%，同時(shí)種在田間的小孢子供體植株沒(méi)有產(chǎn)生變異(見(jiàn)表l)。誘變?cè)偕?個(gè)雙單倍體群體中低于和高于小孢子供體含油量的最低值和最高值的株率是22.22-59.09%，對(duì)照是9.21-19.23%。誘變?cè)偕?個(gè)雙單倍體雙群體中，低于和高于小孢子供體硫代葡萄糖甙含量的最低和最高值株率是25.53-78.70%，對(duì)照是13.56-23.68%。2個(gè)群體中低于和高于小孢子供體芥酸含量的最低和最高值的株率是38.89-46.97%，對(duì)照是18.42-20.34%(見(jiàn)表2-1，2-2)。說(shuō)明在本說(shuō)明書(shū)中出現(xiàn)的"小孢子"、"油菜小孢子"術(shù)語(yǔ)就是"甘藍(lán)型油菜小孢子"，它們是指同一個(gè)試驗(yàn)材料。表1紫外線誘變甘藍(lán)型油菜離體小孢子再生植株的形態(tài)變異<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注1、對(duì)照是未經(jīng)紫外線照射的小孢子再生植株。2、小孢子供體植株收獲的種子于秋天種到田間，產(chǎn)生的株系(每株系20株)均沒(méi)有出現(xiàn)變異。表2-1紫外線誘變甘藍(lán)型油菜離體小孢子再生植株的品質(zhì)性狀變異<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2-2紫外線誘變甘藍(lán)型油菜離體小孢子再生植株的品質(zhì)性狀變異<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2、從小孢子供體植株收獲的種子與誘變和對(duì)照植株種在同一田間。權(quán)利要求1、一種應(yīng)用紫外線誘變甘藍(lán)型油菜離體小孢子和突變體的篩選方法，其特征在于，用蔗糖水溶液分離甘藍(lán)型油菜小孢子，將小孢子懸浮在添加秋水仙堿的改良的NLN培養(yǎng)基上進(jìn)行紫外線照射及染色體加倍，將染色體加倍后的小孢子轉(zhuǎn)入改良NLN培養(yǎng)基上誘導(dǎo)成胚狀體；將再生的胚狀體轉(zhuǎn)入B5培養(yǎng)基誘導(dǎo)成雙單倍體植株，將所述的植株移栽至田間進(jìn)行鑒定，篩選突變體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其步驟如下(1)用含13%蔗糖的水溶液分離甘藍(lán)型油菜單核晚期的小孢子；(2)將分離出的小孢子按120000/mL密度懸浮在添加秋水仙堿的改良NLN液體培養(yǎng)基上，置于超凈臺(tái)上用紫外燈照射95-100秒；(3)將紫外線處理過(guò)的小孢子置于32'C的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2天，使其染色體加倍，然后再于25'C的培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚狀體；(4)將步驟(3)誘導(dǎo)的胚狀體轉(zhuǎn)入附加2。/。蔗糖的B5固體培養(yǎng)基，于25'C，光照強(qiáng)度3000LUX，12小時(shí)/天光照下發(fā)芽，得到小植株或畸形小植株；(5)將步驟(4)的小植株或畸形小植株切除根后，轉(zhuǎn)入附加0.12mg/L多效唑，2%蔗糖的B5固體壯苗培養(yǎng)基上，于25'C培養(yǎng)成壯苗；(6)將步驟(5)的壯苗從試管中直接移栽到田間；(7)在田間觀察植株的形態(tài)特征，選擇變異體；(8)在花期將所述的雙單倍體植株套袋自交，于成熟期收獲自交種子，檢測(cè)種子的含油量、芥酸和硫代葡萄糖甙含量，進(jìn)一步篩選品質(zhì)性狀變異體；(9)將產(chǎn)生的形態(tài)變異體和品質(zhì)性狀變異體的種子于油菜種植季節(jié)播種到田間，進(jìn)一步鑒定其遺傳穩(wěn)定性，其中步驟(2)所述的改良的NLN培養(yǎng)基的組分如下KN03125mg/L,MgS04'7H20125mg/L，KH2P04125mg/L，Ca(N03)2'4H20750mg/L,Na2EDTA37.3mg/L,FeS04.7H2027.8mg/L，MnSCX4H2025mg/L，KI0.83mg/L，H3B0310mg/L，2nS04*4H2010mg/L，Na2M0O4'2^[200.25mg/L，CoCl2'6H200.025mg/L，CuS045H2O0.025mg/L，肌醇100mg/L,煙酸5mg/L，維生素B,0.5mg/L,維生素B60.5mg/L,葉酸0.5mg/L,生物素0.05mg/L,甘氨酸5.0mg/L，谷胱甘肽30mg/L,谷氨酰胺800mg/L,絲氨酸100mg/L;蔗糖130g/L。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(2)的秋水仙堿添加量為70mg/L。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的紫外燈照射小孢子的劑量和參數(shù)是功率30W，波長(zhǎng)253.7nm，被照射的小孢子距紫外燈15cm。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述的胚狀體是魚(yú)雷后期至子葉初期的胚狀體。全文摘要本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種甘藍(lán)型油菜離體小孢子紫外線誘變和突變體的篩選。特征是，用蔗糖水溶液分離甘藍(lán)型油菜小孢子，將小孢子懸浮在添加秋水仙堿改良的NLN培養(yǎng)基上進(jìn)行紫外線照射和染色體加倍，將加倍后的小孢子轉(zhuǎn)入改良的NLN培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚狀體。再將胚狀體轉(zhuǎn)入B5培養(yǎng)基上誘導(dǎo)成雙單倍體植株。將所述的植株移栽至田間進(jìn)行鑒定，篩選出突變體。形態(tài)性狀突變株率為10.53-21.57％，種子中硫甙、含油量及芥酸含量的變異株率分別是25.53-78.7％，22.22-59.09％和38.89-46.97％。本發(fā)明的方法具有操作程序簡(jiǎn)便，省時(shí)和費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。適用于十字花科作物小孢子離體誘變和突變體篩選。文檔編號(hào)C12N15/01GK101250516SQ20081004723公開(kāi)日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年4月7日優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日發(fā)明者吳江生,石淑穩(wěn)申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)