專利名稱：一種同時(shí)檢測香蕉束頂病毒和花葉心腐病毒的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物病毒檢測方法，特別涉及一種同時(shí)檢測香 蕉束頂病毒和花葉心腐病毒的檢測方法。
背景技術(shù)：
香蕉是我國南方重要的經(jīng)濟(jì)作物，但病毒病一直是制約其可持續(xù)
發(fā)展的主要因素之一，尤其是香蕉束頂病毒(力朋a朋》〃加Ar力w ia/77/s， BBTV)引起的香蕉束頂病和由黃瓜花葉病毒(cwcw/^ermosaic w>m， CMV)引起的香蕉花葉心腐病是香蕉生產(chǎn)中發(fā)生最為普遍和嚴(yán) 重的二個(gè)病害。由于目前我國南方香蕉種植種苗以組培苗為主，為了 防止大田香蕉病毒病的發(fā)生和蔓延，確保香蕉組培苗不帶病毒是整個(gè) 香蕉產(chǎn)業(yè)無病毒生產(chǎn)中的最為重要的一環(huán)，加強(qiáng)對組培苗早期病毒的 檢測，就能夠從源頭上有效地控制病毒的擴(kuò)散，確保香蕉大田生產(chǎn)的 安全，同時(shí)也能保證國外對我國香蕉組培苗出境的檢疫要求，因此對 香蕉苗病毒的檢測技術(shù)和方法就成為了病毒控制的關(guān)鍵點(diǎn)。本文根據(jù) 在對廣東省中山市香蕉種植基地病毒普査的基礎(chǔ)上，研究和探索了比 較適合基層實(shí)際檢測侵染香蕉的二種最主要的病毒檢測的技術(shù)和方 法。
目前香蕉病毒病一直是我國香蕉生產(chǎn)和香蕉組培苗出境的主要 限制因素之一，而對香蕉種苗特別是對香蕉組培苗的病毒早期檢測已 經(jīng)成為控制香蕉病毒病發(fā)生蔓延和保障其順利出境的非常有效的措施。香蕉束頂病毒(BBTV)和香蕉花葉心腐病毒(CMV)是侵染我國 香蕉的兩個(gè)最主要的病毒，而且它們經(jīng)常復(fù)合侵染。檢測它們的常用 方法是用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)，但香蕉種苗特別是組培苗， 由于植株幼小，體內(nèi)病毒含量很低，用ELISA的方法會(huì)常常會(huì)出現(xiàn)漏 檢和誤檢的情況；而分子生物學(xué)的方法特別是PCR方法，其靈敏度要 比ELISA方法高1000倍以上，非常適合檢測低濃度病毒的樣品。已 經(jīng)有許多文獻(xiàn)報(bào)道用PCR的方法來檢測香蕉苗的病毒。但是它們都是 針對單個(gè)病毒來檢測，雖然彭軍等在《園藝學(xué)報(bào)報(bào)》也報(bào)道了用多重 PCR來檢測BBTV和CMV,但也是分別提取DNA和RNA，然后又對CMV 單獨(dú)反轉(zhuǎn)錄再與BBTV的樣品機(jī)械混合，最后進(jìn)行PCR檢測，不但操 作程序復(fù)雜，而且容易造成樣品交叉污染。
因此，現(xiàn)有用于檢測香蕉束頂病毒和花葉心腐病毒的檢測方法有 待于進(jìn)一步改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種方法 簡單，只需通過一次檢測就能同時(shí)檢測出香蕉束頂病毒和花葉心腐病 毒，有效減少樣品交叉污染，檢測效率高且準(zhǔn)確的檢測方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案
一種同時(shí)檢測香蕉束頂病毒和花葉心腐病毒的檢測方法，其特征 在于包括以下步驟 (1)、香蕉病葉總核酸的提取
a、分別剪取感染BBTV、 CMV和復(fù)合感染BBTV及CMV的香蕉病株幼葉O. lg;
b、 在液氮(一196。C)下研磨成粉末狀，迅速加入900uL經(jīng)過 65。C預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液，轉(zhuǎn)入2mL的離心管中，65*€水浴30min， 期間不時(shí)搖勻；
c、 加入900nLl氯仿/異戊醇(V:V/24:1)，溫和地?fù)u勻，室溫 下用小型臺式離心機(jī)12000rpm離心8min;
d、 將上清液轉(zhuǎn)到新的2mL離心管中，加入1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.2)和2.5X體積冰冷的無水乙醇，一2(TC放置2hr，然后在 4。C下12000rpm離心10min;
e、 棄上清液，用400uL無RNase的70%的乙醇將RNA振蕩懸 浮，使RNA沉淀中的鹽離子被充分溶解，再次離心10min以沉淀RNA， 小心倒掉上清液，隨后快速離心5s，將管壁上的乙醇收集到管底后， 用小槍頭吸凈，置于超凈臺上吹5min左右，最后用50 ii L DEPC水溶 解沉淀，一2(TC貯存?zhèn)溆茫?br> (2)、 RT-PCR擴(kuò)增 反應(yīng)引物
BBTV引物BBTV-Pl : 5' -ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3'
BBTV-P2 : 5' -GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3'
擴(kuò)增產(chǎn)物為748bp; CMV引物CMV-Pl: 5， -CACCCMCCTTTGTGGGTAG-3，
CMV-P2: 5' -CMCACTGCCAACTCAGCTC-3'
擴(kuò)增產(chǎn)物為557bp;在0. 2mL的薄壁PCR管中分別加入去離子水3. 5 u L、 2Xbuffer 12. 5 ii L、擴(kuò)增酶混合液1 y L、擴(kuò)增BBTV和CMV基因片段的上、下 游引物(P1， P2)各1 u L (10 u mol/L)、香蕉病葉總核酸1 li L(O. 5 n g)， 混合均勻后，進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，并以從健康無病毒侵染的香 蕉葉片中提取的總核酸為陰性對照；其中RT-PCR擴(kuò)增過程50°C 30min， 94。C3min;然后94。Clmin， 52。Clniin， 72。Clmin，共35個(gè)
循環(huán)； (3)、電泳分析
取5uL反應(yīng)產(chǎn)物在用1XTAE緩沖液配制的1%的瓊脂糖凝膠上 進(jìn)行電泳分析。
如上所述的一種同時(shí)檢測香蕉束頂病毒和花葉心腐病毒的檢測 方法，其中步驟(l)中所述的CTAB抽提緩沖液為0.1M的 Tris-HCl(p朋.O) ; 0.02M的EDTA(pH8.0); 1.4M的NaCl; 2%的 CTAB (W/V)和0. 2%的P —巰基乙醇的組合物。
本發(fā)明使用的部分材料的原產(chǎn)地
1、 香蕉感病材料采自廣東省中山市香蕉種植基地；
2、 RT-PCR試劑盒PrimeScript"^One—St印Ver. 2.0 :購自寶生
物工程(大連)有限公司，
3、 反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、CTAB(Cetyltriethyl ammonium bromide)、 Trizol RNA提取試劑及其它生物試劑均購自廣州普博生物科技有限 公司。
綜上所述，本發(fā)明的有益效果(1)、本發(fā)明檢測方法采用2.5X的無水乙醇代替通常在CTAB 方法中使用的異丙醇來沉淀總核酸，既可以得到總DNA，也得到了完 整的總RNA。以此總核酸為模板，并結(jié)合使用RT-PCR—步法試劑盒， 即可以單獨(dú)檢測CMV、也可以單獨(dú)檢測BBTV，更可以同時(shí)檢測出這兩 種病毒。
(2 )、本發(fā)明RT-PCR是將反轉(zhuǎn)錄RT與PCR反應(yīng)在同一管中進(jìn)行， 這樣不但可以減少樣品之間的交叉污染，還由于整個(gè)RT的反應(yīng)產(chǎn)物 都用作PCR的模板，使得檢測靈敏度更為提高，而且可以提高檢測效 率。
(3)本發(fā)明能一次性提取樣品總核酸和進(jìn)行一次性RT-PCR檢 測，可以檢出單個(gè)的或復(fù)合的這兩種病毒，從而大大的提高了檢測效 率，并避免了人為混合DNA和RNA核酸樣品所造成的不必要的污染， 是香蕉病毒檢測的一個(gè)實(shí)用且準(zhǔn)確快速的方法。


圖l為本發(fā)明的檢測結(jié)果圖。
其中，M: 100bp DNA marker; 1:陰性對照；2: CMV PCR檢測； 3:BBTVPCR檢測；4: CMV、 BBTV同時(shí)PCR檢領(lǐng)!l; 5:香蕉病葉總DNA; 6:香蕉病葉總核酸。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步描述 實(shí)施例1
本發(fā)明一種同時(shí)檢測香蕉束頂病毒和花葉心腐病毒的檢測方法包括以下步驟
(1)、香蕉病葉總核酸的提取
分別剪取感染BBTV、 CMV和復(fù)合感染BBTV及CMV的香蕉病株幼 葉0. lg;在液氮(一196。C)下研磨成粉末狀，迅速加入900uL經(jīng) 過65i:預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液，轉(zhuǎn)入2mL的離心管中，65"C水浴 30min，期間不時(shí)搖勻；加入900u Ll氯仿/異戊醇(V:V/24:1)，溫 和地?fù)u勻，室溫下用小型臺式離心機(jī)12000rpm離心8min;將上清液 轉(zhuǎn)到新的2mL離心管中，加入1/10體積的3mol/L NaAc (pH5. 2)和2. 5 X體積冰冷的無水乙醇，一2(TC放置2hr，然后在4-C下12000rpm離 心10min;棄上清液，用400p L無RNase的70%的乙醇將RNA振蕩 懸浮，使RNA沉淀中的鹽離子被充分溶解，再次離心10min以沉淀 RNA，小心倒掉上清，隨后快速離心5s，將管壁上的乙醇收集到管底 后，用小槍頭吸凈，置于超凈臺上吹5min左右，最后用50pLDEPC 水溶解沉淀，一2(TC貯存?zhèn)溆茫?(2)、 RT-PCR擴(kuò)增
在0. 2mL的薄壁PCR管中分別加入去離子水3. 5u L、 2Xbuffer 12.5iiL、擴(kuò)增酶混合液luL、擴(kuò)增BBTV和CMV基因片段的上、下 游引物(Pl， P2)各1 u L (10 p mol/L)、香蕉病葉總核酸1 p L(O, 5 u g)， 混合均勻后，進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，并以從健康無病毒侵染的香 蕉葉片中提取的總核酸為陰性對照；其中RT-PCR擴(kuò)增過程50°C 30min， 94。C3min;然后94。Clmin， 52。Clmin， 72。Clmin，共35個(gè) 循環(huán)；其中BBTV和CMV基因片段的上、下游引物分別為BBTV引物BBTV-PI : 5， -ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3， BBTV-P2 : 5' -GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3'
CMV引物CMV-PI: 5， -CACCCAACCTTTGTGGGTAG-3' CMV-P2: 5， -CMCACTGCCMCTCAGCTC-3，； (3)、電泳分析
取5u L反應(yīng)產(chǎn)物在用1XTAE緩沖液配制的1%的瓊脂糖凝膠上 進(jìn)行電泳分析。
分析結(jié)果如圖1所示，當(dāng)用常規(guī)CTAB法提取香蕉病葉總DNA時(shí)， 結(jié)果顯示一條完整的23kb植物總DNA，如第5電泳帶；而使用本發(fā) 明方法提取相同的香蕉樣品葉片，結(jié)果顯示除了完整的23kb植物總 DNA外，還包含有完整的28S和18S rRNA條帶，說明該樣品中不僅 含有完整的DNA，而且還有完整的總RNA，如第6電泳帶。以此總核 酸為模板，當(dāng)只有CMV引物時(shí)，可以擴(kuò)增出CMV的557bp特異帶，如 第2電泳帶；而只加入BBTV引物時(shí)，也能擴(kuò)增出其748bP的特異帶， 如第3電泳帶；當(dāng)同時(shí)加入CMV和BBTV引物時(shí)，在相同的反應(yīng)條件 下，可以同時(shí)擴(kuò)增出它們的特異帶，如第4電泳帶；而陰性對照沒有 任何條帶，如第1電泳帶。
由此可見，本發(fā)明檢測方法能快速準(zhǔn)確的通過一次檢測就能同時(shí) 檢測出香蕉束頂病毒和花葉心腐病毒。
權(quán)利要求
1、一種同時(shí)檢測香蕉束頂病毒和花葉心腐病毒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)、香蕉病葉總核酸的提取a、分別剪取感染BBTV、CMV和復(fù)合感染BBTV及CMV的香蕉病株幼葉0.1g；b、在液氮(-196℃)下研磨成粉末狀，迅速加入900μL經(jīng)過65℃預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液，轉(zhuǎn)入2mL的離心管中，65℃水浴30min，期間不時(shí)搖勻；c、加入900μLl氯仿/異戊醇(V∶V/24∶1)，溫和地?fù)u勻，室溫下用小型臺式離心機(jī)12000rpm離心8min；d、將上清液轉(zhuǎn)到新的2mL離心管中，加入1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.2)和2.5×體積冰冷的無水乙醇，-20℃放置2hr，然后在4℃下12000rpm離心10min；e、棄上清液，用400μL無RNase的70％的乙醇將RNA振蕩懸浮，使RNA沉淀中的鹽離子被充分溶解，再次離心10min以沉淀RNA，小心倒掉上清液，隨后快速離心5s，將管壁上的乙醇收集到管底后，用小槍頭吸凈，置于超凈臺上吹5min左右，最后用50μL DEPC水溶解沉淀，-20℃貯存?zhèn)溆茫?2)、RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物BBTV引物BBTV-P15’-ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3’BBTV-P25’-GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3’CMV引物CMV-P15’-CACCCAACCTTTGTGGGTAG-3’CMV-P25’-CAACACTGCCAACTCAGCTC-3’在0.2mL的薄壁PCR管中分別加入去離子水3.5μL、2×buffer12.5μL、擴(kuò)增酶混合液1μL、擴(kuò)增BBTV和CMV基因片段的上、下游引物(P1，P2)各1μL(10μmol/L)、香蕉病葉總核酸1μL(0.5μg)，混合均勻后，進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，并以從健康無病毒侵染的香蕉葉片中提取的總核酸為陰性對照；其中RT-PCR擴(kuò)增過程50℃30min，94℃3min；然后94℃1min，52℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；(3)、電泳分析取5μL反應(yīng)產(chǎn)物在用1×TAE緩沖液配制的1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測香蕉束頂病毒和花葉心 腐病毒的檢測方法，其中步驟(l)中所述的CTAB抽提緩沖液為0. 1M 的Tris-HCl(pH8.0); 0. 02M的EDTA(pH8. 0); 1.4M的NaCl; 2%的 CTAB (W/V)和0. 2%的P —巰基乙醇的組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測香蕉束頂病毒和花葉心腐病毒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)香蕉病葉總核酸的提?。?2)RT-PCR擴(kuò)增和(3)電泳分析。本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種方法簡單，只需通過一次檢測就能同時(shí)檢測出香蕉束頂病毒和花葉心腐病毒，有效減少樣品交叉污染，檢測效率高且準(zhǔn)確的檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK101561415SQ20081002759
公開日2009年10月21日 申請日期2008年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日
發(fā)明者楊雷亮, 宏 王, 王云華, 王章根, 王龍貴, 維 管, 陳定虎 申請人:陳定虎;王龍貴;楊雷亮