專利名稱：Cofilin 1與癌癥的紫杉烷類化療藥物耐藥性的相關(guān)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及化療藥物耐藥性領(lǐng)域，更具體地本發(fā)明涉及cofilin 1與紫杉烷類化療藥物耐藥性的相關(guān)性，涉及通過改變細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達而提高/降低癌癥細(xì)胞和/或癌癥患者的紫杉烷類化療藥物耐藥性的方法、以及可以用于該方法中改變細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達的藥劑、包含該藥劑的藥物組合物及所述藥劑的篩選方法及用于制備改變癌癥耐藥性的藥物的用途。此外，本發(fā)明還涉及用于檢測和/或預(yù)后癌癥細(xì)胞和/或癌癥患者對紫杉烷類化療藥物的耐藥性的方法、藥劑、藥物組合物及診斷方法和試劑盒、以及用于治療癌癥患者的方法。所述癌癥優(yōu)選是能夠用紫杉烷類化療藥物治療的癌癥，更優(yōu)選所述癌癥是卵巢癌。
背景技術(shù)：
卵巢癌是婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第三位，死亡率占第一位的惡性疾患。在滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔助紫杉烷類化療藥物+順鉑為主聯(lián)合化療的治療策略雖然明顯改善了初治卵巢癌的預(yù)后，但是晚期卵巢癌的5年生存率仍然徘徊在15％-20％左右。紫杉烷類化療藥物作用于微管，通過防止多聚化過程而抑制微管網(wǎng)的正常重組，廣泛用于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、頭頸癌、食管癌等，但化療后腫瘤原發(fā)或獲得性對化療藥物廣泛的交叉耐藥是治療失敗的主要原因之一。目前對腫瘤耐藥機制的認(rèn)識已經(jīng)相對深入，如MDR-1，LRP-1，MRP-1，GST-pi等已成為眾所周知的耐藥相關(guān)基因，而微管(微管蛋白)同型蛋白表達改變也是紫杉烷類化療藥物耐藥的重要機制之一。但是究其對于臨床的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值卻十分有限。已知的相關(guān)耐藥基因在卵巢癌中的表達不能良好地預(yù)測腫瘤的耐藥性和預(yù)后，有關(guān)腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究在體內(nèi)也未達到理想效果。這說明尚有許多未知的耐藥機制有待發(fā)現(xiàn)，耐藥基因的表達和相應(yīng)表達蛋白的功能之間可能存在差異。
蛋白質(zhì)組學(xué)是1994年才提出并發(fā)展的一項新興學(xué)科。它著眼于從生命功能的執(zhí)行體-蛋白質(zhì)水平研究基因的表達和功能，采用高通量，高分辨率，高效率的蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)，試圖從機體或細(xì)胞的整體水平上認(rèn)識生物體蛋白質(zhì)的表達、修飾、結(jié)構(gòu)及功能，以期反映機體內(nèi)代謝動態(tài)變化的過程。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于腫瘤的生物學(xué)研究，與基因組學(xué)研究相比，其最大的優(yōu)勢在于，能夠動態(tài)反映腫瘤發(fā)生發(fā)展各個不同時期蛋白質(zhì)種類和數(shù)量變化，同時找出多個與腫瘤基因表達和功能相關(guān)的蛋白群，為探討腫瘤發(fā)生機制，尋找腫瘤診斷和預(yù)后特異標(biāo)記物提供了極大的可能。
Cofilin是Sakai等[Nishida E，et al.Biochemistry.1984；23(22)5307-131]于1984年首先從豬腦中純化的一種actin結(jié)合蛋白。Cofilin廣泛分布在各種器官和組織中，在非肌肉組織中稱為cofilin1，肌肉組織稱為cofilin2。Cofilin是ADF/cofilin家族中最重要的成員，分子量為21KD，它的主要作用是和actin肌動蛋白單體結(jié)合，促進actin的解聚，是actin循環(huán)重要的調(diào)控因子。由于actin在細(xì)胞分裂(胞質(zhì)分裂)和細(xì)胞運動中起主要作用，因此，作為actin重要調(diào)控因子的cofilin的細(xì)微變化可以引起actin重組和功能改變，從而導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)ADF/cofilin的調(diào)節(jié)失控與阿爾茨海默病，腎病，肌肉萎縮變性有明確相關(guān)性[Bamburg JR，et al.Tends CellBio.2002；12598-605]。2000年以后，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)Cofilin與腫瘤細(xì)胞的活力，滲透力和轉(zhuǎn)移能力的改變有直接相關(guān)性[Wang W，et al.J CellBiol.2006 May 8；173(3)395-404]。目前認(rèn)為cofilin可能在以下三方面[Pawlak G，et al.J.Biol.Chem.2002；27726927 26933；Ichetovkin I，et al.Curr.Biol.2002；1279 84；Abe H，et al.J.Cell Biol.1996；132871 885]對腫瘤細(xì)胞起著重要的調(diào)控作用1)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的啟動，減少對粘附生長的依賴；2)細(xì)胞轉(zhuǎn)移中細(xì)胞動力增強；3)細(xì)胞分裂。在卵巢癌和神經(jīng)腫瘤細(xì)胞和組織中均檢測到了cofilin的上調(diào)[Martoglio AM，et al.Mol.Med.2000；6750 765]。因此阻斷cofilin將可能成為抑制惡性腫瘤生長和蔓延新的靶點。但是，cofilin與腫瘤細(xì)胞化療耐藥的相關(guān)性目前尚無研究報道。
本研究在認(rèn)識腫瘤耐藥相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)磷酸化cofilin1的表達上調(diào)為本研究的所有耐紫杉烷類化療藥物的癌細(xì)胞株所共有，并通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在細(xì)胞中驗證了cofilin表達上調(diào)與紫杉烷類化療藥物的耐藥性的明確相關(guān)性。同時，并在臨床卵巢癌標(biāo)本中驗證了磷酸化cofilin在耐藥卵巢癌組織中表達上調(diào)。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明一方面涉及調(diào)節(jié)癌癥的紫杉烷類化療藥物耐藥性的方法，包括改變癌癥細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達，其中所述癌癥優(yōu)選是卵巢癌，其中所述紫杉烷類化療藥物優(yōu)選是紫杉醇(Taxol)。本發(fā)明該方面的方法可以在體外作用于癌細(xì)胞；或者可以在體內(nèi)施用于癌癥患者。
在此方面的一個實施方案中，通過提高癌癥細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達而提高癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐受性。
在再一實施方案中，通過在癌癥細(xì)胞中表達cofilin 1基因而提高細(xì)胞中的cofilin 1表達，再優(yōu)選地其中通過使用表達cofilin 1基因的正義質(zhì)粒來提高所述細(xì)胞中的cofilin 1含量和/或磷酸化cofilin 1的含量。
在再一實施方案中，其中通過增加癌癥細(xì)胞中的磷酸化cofilin 1而提高癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐受性。
在此方面的另一實施方案中，通過減少和/或抑制癌細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達而降低癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐受性。
在再一實施方案中，其中通過在癌細(xì)胞中表達cofilin 1的反義核苷酸而下調(diào)和/或抑制細(xì)胞中的cofilin 1表達，再優(yōu)選地其中通過使用表達反義cofilin 1的反義質(zhì)粒來降低細(xì)胞中的cofilin 1含量和/或磷酸化cofilin 1的含量。
在再一實施方案中，其中通過減少癌細(xì)胞中的磷酸化cofilin 1而降低癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐受性。
本發(fā)明另一方面涉及通過前述方法改變了對紫杉烷類化療藥物的耐受性的癌癥細(xì)胞，優(yōu)選地卵巢癌細(xì)胞。所述癌細(xì)胞可以例如用于篩選或鑒定與癌癥的紫杉烷類化療藥物耐受性有關(guān)的其它基因。
本發(fā)明該方面的一個實施方案中，所述癌細(xì)胞包含表達正義cofilin1或反義cofilin 1的表達載體，優(yōu)選地，所述載體是質(zhì)粒。
本發(fā)明另一方面涉及一種治療癌癥患者的方法，包括步驟a)通過本發(fā)明調(diào)節(jié)cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達的方法降低癌癥患者對紫杉烷類化療藥物的耐受性；和b)向所述患者施用紫杉烷類化療藥物，任選地，在步驟(a)前檢測癌癥患者的紫杉烷類化療藥物的耐受性以確定耐藥性患者。優(yōu)選地，所述癌癥是卵巢癌。
本發(fā)明另一方面涉及能夠改變癌癥細(xì)胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達的藥劑在制備用于改變癌癥的紫杉烷類化療藥物耐藥性的藥物中的用途。
在所述用途中，一個實施方案中，所述藥劑能夠降低癌癥細(xì)胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表達，由此降低癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐藥性。在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案中，所述藥劑是反義核苷酸、核酶，優(yōu)選反義核苷酸。本發(fā)明反義核苷酸包含能夠特異結(jié)合cofilin 1多核苷酸序列或其互補序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列，更優(yōu)選地所述反義核苷酸含有與cofinlin多核苷酸的一或多個部分互補、更優(yōu)選地基本上互補、甚至更優(yōu)選地完全互補的序列區(qū)域，更優(yōu)選地，所述反義核苷酸包含與全長cofilin 1多核苷酸完全互補的DNA序列。本發(fā)明反義核苷酸優(yōu)選是DNA或者RNA或者其衍生物，最優(yōu)選地，所述反義核苷酸是反義質(zhì)粒。根據(jù)本發(fā)明的核酶是能夠特異切割cofilin1 mRNA的核酶。優(yōu)選地，所述核酶具有與一或多個cofilin1RNA區(qū)域互補的特異底物結(jié)合位點，并且它在該底物結(jié)合位點中或周圍具有賦予該分子RNA切割活性的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的核酶可以是錘頭型核酶、發(fā)夾型核酶、丁型肝炎病毒型核酶、I型內(nèi)含于型核酶或RNaseP RNA型核酶或鏈孢霉屬VS RNA型核酶。
本發(fā)明此方面的另一實施方案中，所述藥劑能夠提高癌細(xì)胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表達，而所述藥物用于提高癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐藥性，其中所述藥劑優(yōu)選是表達cofilin1的DNA構(gòu)建體。
本發(fā)明再一方面涉及一種篩選能夠改變癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐藥性的藥劑的方法，其中所述癌癥優(yōu)選卵巢癌，所述方法包括步驟提供候選藥劑；使所述候選藥劑與癌癥細(xì)胞接觸；檢測所述癌癥細(xì)胞中的cofilin1/磷酸化cofilin 1的表達；將所檢測到的表達量與預(yù)定閾值比較。在本發(fā)明該方法中，優(yōu)選地，所述癌癥細(xì)胞是紫杉烷類化療藥物耐藥細(xì)胞，所述方法用于篩選降低耐藥性的藥劑；或者優(yōu)選地，所述癌癥細(xì)胞是紫杉烷類化療藥物敏感細(xì)胞，所述方法用于篩選提高耐藥性的藥劑。根據(jù)本發(fā)明的篩選方法，所述預(yù)定閾值優(yōu)選是所述癌癥細(xì)胞在接觸候選藥劑之前測定的細(xì)胞內(nèi)cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達量。
本發(fā)明也涉及通過前述篩選方法獲得的能夠改變癌癥細(xì)胞對紫杉烷類化療藥物的耐藥性的藥劑，包含所述藥劑的組合物、以及所述篩選出的藥劑在制備用于改變癌癥細(xì)胞/癌癥患者對紫杉烷類化療藥物的耐受性的藥物中的用途。
本發(fā)明又一方面涉及一種檢測癌癥細(xì)胞對紫杉烷類化療藥物的耐藥性的方法，包括檢測癌癥細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表達，和將所得表達量與預(yù)定閾值進行比較，由此指示癌癥細(xì)胞對紫杉烷類化療藥物的耐藥性，其中優(yōu)選地檢測磷酸化cofinlin的表達量。在該方面的一個實施方案中，所述預(yù)定閾值為紫杉烷類化療藥物敏感的癌細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1含量。
本發(fā)明又一方面涉及能夠檢測癌癥細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達量的藥劑在制備用于檢測癌癥細(xì)胞的紫杉烷類化療藥物耐受性的檢測試劑盒中的用途。一個實施方案中，所述藥劑為cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白質(zhì)的抗體，優(yōu)選單克隆抗體。再優(yōu)選地，其中所述藥劑檢測細(xì)胞中cofilin 1基因的mRNA水平表達量，所述藥劑優(yōu)選是雜交探針或是特異于cofilin 1基因的引物。
本發(fā)明又一方面涉及一種預(yù)測或預(yù)后紫杉烷類化療藥物在癌癥患者中的治療效果的方法，包括檢測癌癥患者的腫瘤組織中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表達量，和將所得的量與預(yù)定閾值進行比較，由此獲得所述患者對紫杉烷類化療藥物的耐藥性。
在本發(fā)明此方面的一個實施方案中，所述預(yù)定閾值為來自對紫杉烷類化療藥物敏感的癌患者的癌細(xì)胞的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的含量。
本發(fā)明再一方面涉及治療癌癥患者的方法，所述方法包括根據(jù)前述本發(fā)明的預(yù)測或預(yù)后方法確定患者的紫杉烷類化療藥物耐藥性，調(diào)整患者的紫杉烷類化療藥物給藥方案。所述調(diào)整包括替換紫杉烷類化療藥物、加大或減少紫杉烷類化療藥物的給藥頻率和/或給藥量，等。
在本發(fā)明上下文中，根據(jù)本發(fā)明的對cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表達量的檢測發(fā)生在cofilin1的mRNA水平或蛋白質(zhì)水平上，或者通過檢測磷酸化cofilin1的蛋白質(zhì)水平來實現(xiàn)，優(yōu)選地檢測磷酸化cofilin1的蛋白質(zhì)水平。在mRNA水平的檢測，優(yōu)選地采用Northern印跡或PCR方法來實現(xiàn)。在蛋白質(zhì)水平上的檢測，優(yōu)選地采用特異地結(jié)合cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的抗體或寡核苷酸適配體來實現(xiàn)。
本發(fā)明又一方面涉及能夠檢測癌癥細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1含量的藥劑在制備用于預(yù)測或預(yù)后紫杉烷類化療藥物對癌癥的治療效果的診斷試劑盒中的用途。優(yōu)選地，所述藥劑為cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白質(zhì)的抗體，優(yōu)選單克隆抗體。再優(yōu)選地，所述藥劑檢測細(xì)胞中cofilin 1基因的mRNA水平表達量，所述藥劑優(yōu)選是雜交探針或是特異于cofilin 1基因的引物。
本發(fā)明其它方面還涉及表達cofilin1蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體和載體、cofilin1的反義核苷酸及核酶、以及cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的抗體和寡核苷酸適配體，以及包含它們之一或任何組合的藥物組合物或診斷組合物，以及它們之一或任何組合在制備改變癌癥的紫杉烷類化療藥物耐藥性的藥物中的用途和/或在制備診斷/預(yù)后癌癥的紫杉烷類化療藥物耐藥性的藥物中的用途。
本發(fā)明最后一方面涉及一種建立紫杉烷類化療藥物耐藥性癌癥細(xì)胞株的方法，包括以大劑量紫杉烷類化療藥物沖擊來誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞。優(yōu)選地，所述大劑量紫杉烷類化療藥物為2μM至2.5μM。再優(yōu)選地，所述方法還包括在耐藥細(xì)胞形成后每隔數(shù)周用所述大劑量的紫杉烷類化療藥物沖擊一次，其中優(yōu)選地每12周沖擊一次。
在本發(fā)明的所有方面，如果適用的話，優(yōu)選的是，所述癌癥是能夠用紫杉烷類化療藥物治療的癌癥，如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、頭頸癌、食管癌等，優(yōu)選卵巢癌，在一個實施方案中，優(yōu)選卵巢上皮癌，包括內(nèi)膜樣癌、漿乳癌、腺癌、移行細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、透明細(xì)胞癌，在另一實施方案中，優(yōu)選人漿液性卵巢癌，上皮性卵巢癌，特別是A2780類型卵巢癌。
在本發(fā)明的所有方面，如果適用的話，優(yōu)選的是，所述紫杉烷類(taxanes)化療藥物是具有抗癌活性的那些紫杉烷類化合物，更優(yōu)選是紫杉醇(paclitaxel，Taxol)和多西他賽(docetaxel，Taxotere)，特別是紫杉醇。


圖1Taxol小劑量濃度遞增間歇誘導(dǎo)法示意圖。
圖2Taxol大劑量沖擊誘導(dǎo)法示意圖。
圖3SKOV3，SK-TR30和SKOV3-TR2500對Taxol的劑量反應(yīng)曲線圖4光鏡下SKOV3，SK-TR30和SK-TR2500光鏡下細(xì)胞形態(tài)(×20，×40)。a，b，c20×光鏡下的細(xì)胞形態(tài)；d，e，f40×光鏡下的細(xì)胞形態(tài)；g，h，i紫杉醇沖擊后24h的細(xì)胞形態(tài)(×40)；a，d，gSKOV3細(xì)胞；b，e，hSK-TR30細(xì)胞；c，f，iSK-TR2500細(xì)胞。
圖5SKOV3及其耐藥細(xì)胞的7天對數(shù)生長曲線。SKOV3增殖速度最快，SK-TR30次之，SK-TR2500增殖速度最慢。
圖6SKOV3及耐藥細(xì)胞細(xì)胞周期分布。
圖7-12電鏡下SKOV3，SK-TR30和SK-TR2500細(xì)胞形態(tài)(×8000、×22000)。圖7，8SKOV3細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞核膜光滑、染色質(zhì)呈團塊聚集；圖9，10，11，12耐藥細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)外間隙增寬、在細(xì)胞表面附近出現(xiàn)很多囊泡樣結(jié)構(gòu)、它們有類似細(xì)胞膜的雙層膜樣結(jié)構(gòu)(圖9)；細(xì)胞壁皺褶、細(xì)胞核膜雙層結(jié)構(gòu)粗糙或中斷、出現(xiàn)胞膜內(nèi)陷形成瓶頸樣改變(圖11，12)；耐藥細(xì)胞的線粒體體積增大、并伴有嵴的缺失(圖10)。
圖13基因MDR-1、MRP-1、GST-pi、LRP-1在卵巢癌敏感細(xì)胞SKOV3、A2780和紫杉醇耐藥細(xì)胞SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR中的表達。1SKOV3；2 SK-TR30；3 SK-TR2500；4 A2780；5 A2780-TR圖145種β-微管蛋白亞型基因在卵巢癌敏感細(xì)胞SKOV3、A2780和紫杉醇耐藥細(xì)胞SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR中的表達。1 SKOV3；2SK-TR30；3 SK-TR2500；4 A2780；5 A2780-TR圖15MDR-1蛋白在卵巢癌敏感細(xì)胞和紫杉醇耐藥細(xì)胞中的表達。SKOV3，A2780不表達或表達量很低；SK-TR30，A2780-TR表達顯著升高；SK-TR2500低表達。
圖16SKOV3細(xì)胞全蛋白雙向電泳圖譜(箭頭所指點為差異表達蛋白質(zhì)點)。
圖17SK-TR30細(xì)胞全蛋白雙向電泳圖譜(箭頭所指點為差異表達蛋白質(zhì)點)。
圖18SK-TR2500細(xì)胞全蛋白雙向電泳圖譜(箭頭所指點為差異表達蛋白質(zhì)點)。
圖19A2780細(xì)胞全蛋白雙向電泳圖譜(箭頭所指點為差異表達蛋白質(zhì)點)。
圖20A2780-TR細(xì)胞全蛋白雙向電泳圖譜(箭頭所指點為差異表達蛋白質(zhì)點)。
圖21卵巢癌紫杉醇敏感和耐藥細(xì)胞中差異表達的蛋白點。
圖2269號點cofilin的肽質(zhì)量指紋圖譜。
圖23卵巢癌敏感細(xì)胞SKOV3、A2780和紫杉醇耐藥細(xì)胞SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR中總的cofilin1和磷酸化cofilin1蛋白的表達。結(jié)果1.卵巢癌敏感和耐藥細(xì)胞中蛋白cofilin1表達量相同；2.磷酸化cofilin1蛋白在卵巢癌耐藥細(xì)胞中表達明顯增高，以SK-TR2500細(xì)胞增高最明顯。
圖24載體pcDNA3.1(+)示意圖(NheI和EcoRI為酶切位點)圖25載體pcDNA3.1(+)和cofilin cDNA經(jīng)NheI和EcoRI雙酶切后電泳圖(電泳方向向下)。a載體pcDNA3.1(+)；1-未酶切的pcDNA3.1(+)，2-雙酶切后的pcDNA3.1(+)；b cofilin cDNA；1，2，3均是酶切后的cofilin cDNA。
圖26pcDNA-cof重組載體構(gòu)建過程示意27pcDNA-antisense-cof重組載體構(gòu)建過程示意28pcDNA-cof重組載體經(jīng)NheI和EcoRI雙酶切后電泳鑒定(電泳方向向下)泳道1，2，5-7的pcDNA-cof重組載體雙酶切后得到500bp cofilincDNA，被選取測序。
圖29pcDNA-antisense-cof重組載體經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后電泳鑒定(電泳方向向下)。泳道1-6的pcDNA-cof重組載體雙酶切后得到500bp cofilin cDNA，選取1，4，5質(zhì)粒測序。
圖30載體pEGFP-cof分別轉(zhuǎn)染A2780，SKOV3細(xì)胞，24h后在熒光顯微鏡下觀察的轉(zhuǎn)染效率。a，b載體pEGFP-cof轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞24后的轉(zhuǎn)染效率約為60％(×40)；c，d載體pEGFP-cof轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞24后的轉(zhuǎn)染效率約為20％(×20)圖31穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA-cof的SKOV3、A2780和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA-antisense-cof的SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR細(xì)胞克隆的Western Blot鑒定結(jié)果。P-原代細(xì)胞；C-轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的對照細(xì)胞(即，轉(zhuǎn)染空載體的原代細(xì)胞)；S-轉(zhuǎn)染pcDNA-cof的SKOV3；A-轉(zhuǎn)染pcDNA-antisense-cof的SK-TR2500；T-轉(zhuǎn)染pcDNA-antisense-cof的A2780-TR圖32cofilin1免疫組化染色結(jié)果。A cofilin1染色陰性；B cofilin1染色陽性，陽性部分為細(xì)胞漿圖33磷酸化cofilin1免疫組化染色結(jié)果。A磷酸化cofilin1染色陰性；B磷酸化cofilin1染色陽性，陽性部分為細(xì)胞漿；C磷酸化cofilin1染色陽性，陽性部分為細(xì)胞核。
發(fā)明詳述本申請的發(fā)明人利用蛋白質(zhì)組學(xué)首次確立了cofilin1與癌癥，尤其是卵巢癌的紫杉醇化療藥物耐受性相關(guān)。因此，本說明書就以下幾個方面對本發(fā)明作進一步詳細(xì)闡述。
Cofilin1蛋白及其編碼核苷酸本發(fā)明所指的cofilin1或cofilin1蛋白質(zhì)包括cofilin1的同源物、等位變體、功能等同物，特別是保守變體，優(yōu)選指人cofilin1蛋白質(zhì)。cofilin1蛋白質(zhì)保守變體包括與本文公開的cofilin1蛋白質(zhì)相比具有一個或者多個(例如1-20個，1-10個，1-5個)氨基酸的插入、缺失、和/或添加的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，“多肽”和“蛋白質(zhì)”可以互換使用，可以表示任何長度的多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，多核苷酸可以是單鏈的(編碼鏈或反義鏈)或雙鏈的，而且可以是DNA(基因組DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有內(nèi)含子并以一對一形式與DNA分子對應(yīng)的HnRNA分子，和不含內(nèi)含子的mRNA分子。
多核苷酸可以含有天然序列(即編碼cofilin1蛋白質(zhì)或其部分的內(nèi)源性序列)或可以含有該序列的變體、或生物學(xué)或功能等同物。多核苷酸變體可以含有一或多個替代、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選地，這些改變是保守性的或者這些改變產(chǎn)生的多核苷酸變體保持編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的能力。
當(dāng)進行多核苷酸或多肽序列比較時，如果在按下述方法進行最大匹配比對后，兩個序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，則認(rèn)為這兩個序列是“一致的”。
適合于確定序列一致性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的一個優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如本文所述參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。
因此，本發(fā)明包括與本文所公開序列基本一致的多核苷酸和多肽序列，例如當(dāng)采用本文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析，描述如下)時，與本發(fā)明多核苷酸或多肽序列相比含有至少50％序列一致性、優(yōu)選至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列一致性的那些序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、讀框的定位等，可以對這些值進行適當(dāng)調(diào)整以確定兩個核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)一致性。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有與本文所公開的一或多個序列一致或互補的各種長度連續(xù)序列段的分離多核苷酸和多肽。例如，本發(fā)明提供含有本文所公開的一或多個序列的至少約15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多個連續(xù)核苷酸、以及含有之間的所有居中長度的連續(xù)核苷酸的多核苷酸。易于明了的是，“居中長度”在本文中是指這些引用值之間的任何長度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、51、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1,000等之間的所有整數(shù)。
本發(fā)明的多核苷酸、或其片段，無論其本身的編碼序列有多長，均可以和其它DNA序列，如啟動子、多腺苷酸化信號、額外的限制性酶位點、多克隆位點、其它的編碼區(qū)段等組合，以致它們的整個長度可能出現(xiàn)相當(dāng)大的變化。因此，預(yù)期可以采用幾乎任何長度的核苷酸片段，其總長度優(yōu)選被限制在易于在期望的重組DNA程序中進行操作和應(yīng)用的范圍內(nèi)。例如，預(yù)期總長度約10,000、約5000、約3000、約2,000、約1,000、約500、約200、約100、約50個堿基對等(包括所有的居中長度)的示例性DNA區(qū)段在本發(fā)明的許多實施方案中是有用的。
在其它實施方案中，本發(fā)明涉及在中等嚴(yán)緊條件(優(yōu)選高嚴(yán)緊條件)下與本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互補序列能夠雜交的多核苷酸。在分子生物學(xué)領(lǐng)域中雜交技術(shù)是熟知的。
典型地，“雜交條件”根據(jù)測量雜交時所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5℃(低于探針Tm 5℃)；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5-10℃；“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20℃；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20-25℃。作為替代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6×SSC＝極低嚴(yán)緊性；3×SSC＝低至中等嚴(yán)緊性；1×SSC＝中等嚴(yán)緊性；0.5×SSC＝高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80％或更多序列同一性的核酸序列。
對于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如，選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，實驗室手冊，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。
為便于說明，用于檢測本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液預(yù)洗；在50-65℃下在5×SSC中雜交過夜；隨后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗滌兩次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65℃或65-70℃。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以按照本領(lǐng)域已知的方法制備。參見例如常見實驗室手冊。
表達的改變本發(fā)明一方面涉及通過改變癌細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達，來調(diào)節(jié)癌癥的紫杉醇類紫杉烷類化療藥物耐藥性。
在此方面，所述表達的改變包括上調(diào)和/或激活表達并由此增加癌癥的紫杉醇類紫杉烷類化療藥物耐藥性，也包括下調(diào)和/或抑制表達，由此降低癌癥的紫杉醇類紫杉烷類化療藥物的耐藥性。本發(fā)明對癌癥的耐藥性的調(diào)節(jié)可以發(fā)生在體外施用于癌細(xì)胞上以例如獲得耐藥性細(xì)胞株或降低原耐藥性細(xì)胞的耐藥性。本發(fā)明對癌癥的耐藥性的調(diào)節(jié)也可以發(fā)生在體內(nèi)以患有所述癌癥的患者為施用對象，以改變優(yōu)選降低患者的紫杉醇類紫杉烷類化療藥物耐藥性。
這里所用的“表達的上調(diào)”或者“表達的激活”是指增加基因表達的水平和/或活性基因產(chǎn)物的水平和/或基因產(chǎn)物活性的水平。例如，可以通過在癌細(xì)胞中表達外源cofilin1、增強癌細(xì)胞的內(nèi)源cofilin1表達等方式實現(xiàn)。在本發(fā)明中，外源cofilin1指通過遺傳工程技術(shù)引入的cofilin；而內(nèi)源cofilin1指細(xì)胞中原有的cofilin1。由于磷酸化cofilin1在癌癥的紫杉醇耐藥性中的作用，在本發(fā)明中的一個優(yōu)選實施方案中，通過調(diào)節(jié)磷酸化cofilin1的活性水平來改變癌細(xì)胞的耐藥性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它能夠增加目的基因表達的水平和/或活性基因產(chǎn)物的水平和/或基因產(chǎn)物活性的水平的方法也適用于本發(fā)明此方面，由此包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
這里所用的“表達的下調(diào)”或者“表達的抑制”是指降低基因表達的水平和/或活性基因產(chǎn)物的水平和/或基因產(chǎn)物活性的水平。如Angell和Baulcombe(1998-WO9836083)，Lowe等，(1989-WO9853083)，Lederer等，(1999-WO9915682)或者Wang等(1999-WO9953050)所述，通過，例如以相對于啟動子序列的有義方向(如果引起共抑制)或者反義方向添加編碼序列或其部分，和通過，例如插入誘變(例如T-DNA插入或轉(zhuǎn)座子插入)或通過基因沉默策略可以完成表達的降低。目的在于沉默基因表達的基因構(gòu)建體可以有以相對于啟動子序列有義和/或反義方向包含的所述基因的核苷酸序列(或其一個或多個部分)。另一個下調(diào)基因表達的方法包括核酶的應(yīng)用。
可以通過向細(xì)胞、組織、器官或生物體施用或使之暴露于所述本發(fā)明化合物或藥劑由此實現(xiàn)調(diào)節(jié)，包括降低活性基因產(chǎn)物或基因產(chǎn)物活性的水平。
免疫調(diào)節(jié)是具有下調(diào)活性基因產(chǎn)物和/或基因產(chǎn)物活性水平能力的另一種技術(shù)的例子，包括施用或暴露所述基因產(chǎn)物的抗體于其中要調(diào)節(jié)所述基因產(chǎn)物的水平和/或基因產(chǎn)物活性的細(xì)胞、組織、器官或生物體，或在這種細(xì)胞、組織、器官或生物體中表達所述基因產(chǎn)物的抗體。這種抗體包括單鏈抗體、IgG抗體及其片段。
還可以通過向細(xì)胞、組織、器官或生物體施用或使之暴露于所述基因產(chǎn)物或其活性的激動劑/拮抗劑實現(xiàn)調(diào)節(jié)，包括增強/降低活性基因產(chǎn)物或基因產(chǎn)物活性的水平。這種激動劑/拮抗劑包括按照所述本發(fā)明鑒定的蛋白質(zhì)和化學(xué)化合物。
在本發(fā)明上下文中設(shè)想了cofilin1基因表達的上調(diào)/下調(diào)。本發(fā)明還包括cofilin1活性水平的上調(diào)/下調(diào)。
此外，可以考慮通過重組來使基因沉默。
“重組酶”意指位點特異性重組酶或轉(zhuǎn)座酶。“重組位點”意指位點特異性重組位點或轉(zhuǎn)座子邊界序列?！拔稽c特異性重組事件”意指由一般由3個元件一對DNA序列(位點特異性重組序列或位點)和特異性酶(位點特異性重組酶)組成的系統(tǒng)催化的事件。位點特異性重組酶根據(jù)位點特異性重組序列的方向，僅催化兩個位點特異性重組序列間的重組反應(yīng)。在位點特異性重組酶存在的情況下，當(dāng)位點特異性重組序列以相互相反方向定向(即，反向重復(fù))時，間插在兩個位點特異性重組位點之間的序列將倒置。如果位點特異性序列以相互相同的方向定向(即，同向重復(fù))，那么一旦與位點特異性重組酶相互作用，任何間插序列將缺失。因此，如果位點特異性重組序列做為同向重復(fù)在整合進入真核生物基因組中的外源DNA兩個末端存在，那么所述序列的這種整合隨后可以被位點特異性重組序列與相應(yīng)的位點特異性重組酶的相互作用所逆轉(zhuǎn)。
可以利用大量不同的位點特異性重組酶系統(tǒng)，包括但不限于噬菌體P1的Cre/lox系統(tǒng)，酵母的FLP/FRT系統(tǒng)，噬菌體Mu的Gin重組酶，大腸桿菌(E.coli)的Pin重組酶，志賀氏菌屬(Shigella)的PinB，PinD和PinF，和pSR1質(zhì)粒的R/RS系統(tǒng)。重組酶通常都是整合酶、解離酶或翻轉(zhuǎn)酶(flippases)。而且，雙特異性重組酶可以與對應(yīng)雙特異性重組酶的兩個不同位點特異性重組位點的同向重復(fù)或不同向重復(fù)(indirect repeats)聯(lián)合使用(WO99/25840)。兩個優(yōu)選的位點特異性重組酶系統(tǒng)是噬菌體P1Cre/lox和酵母FLP/FRT系統(tǒng)。在這些系統(tǒng)中，重組酶(Cre或FLP)與其各自位點特異性重組序列(分別是lox或FRT)相互作用以倒置或切除間插序列。
盡管位點特異性重組序列必須與待切除或待倒置的DNA的末端連接，但是編碼位點特異性重組酶的基因可以定位在其它地方。例如，重組酶基因可以已經(jīng)存在真核生物DNA中或者可以由后來引入的DNA片段提供，該DNA片段可以通過交換或通過異體授粉或直接引入細(xì)胞中。做為可替代方案，例如，可以通過顯微注射或粒子轟擊將基本純化的重組酶蛋白質(zhì)直接引入真核細(xì)胞。典型地，位點特異性重組酶編碼區(qū)將可操作地連接調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列能夠使位點特異性重組酶在真核生物細(xì)胞中表達。
在實施本發(fā)明時，優(yōu)選地，例如通過細(xì)胞中重組酶蛋白質(zhì)的表達，該蛋白質(zhì)接觸遺傳因子的整合位點，并促進其中重組事件，在原始整合位點完整地切除遺傳因子或者可替代地留下“足跡”，通常約20個核苷酸長或更長，來誘導(dǎo)遺傳因子運動?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)核酸雜交和/或擴增技術(shù)以檢測可動遺傳因子或包含其的基因構(gòu)建體的存在鑒定根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的這些宿主和宿主部分。做為可替代方案，在可動遺傳因子已經(jīng)切除的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、組織和宿主的情況下，可以用這種技術(shù)檢測切除事件后留下的宿主基因組中足跡。如這里所用術(shù)語“足跡”應(yīng)該理解為指這里所述可動遺傳因子或含該因子的基因構(gòu)建體的任何衍生物，通過先前所述基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞基因組中可動遺傳因子的切除、缺失或其它去除可以產(chǎn)生它。通常地，足跡包含至少用于促進切除的轉(zhuǎn)座子或重組位點的單拷貝。然而，足跡可以包含來源于基因構(gòu)建體的其它序列，例如，如果使用，來源于左邊界序列、右邊界序列、復(fù)制起點、重組酶編碼序列或轉(zhuǎn)座酶編碼序列的核苷酸序列，或其它載體來源的核苷酸序列。因此，根據(jù)所用基因構(gòu)建體重組基因座或轉(zhuǎn)座子的核苷酸序列，如，例如與lox位點或frt位點對應(yīng)或互補的核苷酸序列，可鑒定足跡。
本發(fā)明還涉及通過使用反義技術(shù)在體外和體內(nèi)抑制cofilin1?？衫梅戳x技術(shù)通過三鏈螺旋形成或者通過反義DNA或RNA來控制基因表達，這兩種方法都基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，將編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的5’編碼部分用于設(shè)計長度為大約10-40堿基對的反義RNA核苷酸。設(shè)計與基因中參與轉(zhuǎn)錄的區(qū)域互補的DNA核苷酸(三鏈螺旋參閱Lee等人，Nucl.Acids Res.，63073，1979；Cooney等人，Science，241456，1988；和Dervan等人，Science，2511360，1991)，由此防止cofilin1的轉(zhuǎn)錄和生成。反義RNA核苷酸與mRNA在體內(nèi)發(fā)生雜交，并阻斷mRNA分子翻譯成cofilin1蛋白(反義參與Okano，J.Neurochem.，56560，1991；《Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression》(寡核苷酸作為基因表達的反義抑制劑)，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L，1988)。
或者，可以通過本領(lǐng)域的流程將上文所述核苷酸投遞至細(xì)胞，使得反義RNA或DNA能夠在體內(nèi)表達，從而以上文所述方式抑制cofilin1的生成。
反義核苷酸遺傳信息流的最終結(jié)果是蛋白質(zhì)的合成。DNA通過聚合酶轉(zhuǎn)錄為信使RNA，然后在核糖體上經(jīng)翻譯產(chǎn)生折疊的功能性蛋白質(zhì)。因此，沿該路徑有幾個在其上可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)合成抑制的步驟。編碼本文所述多肽的天然DNA區(qū)段，和所有這樣的哺乳動物DNA鏈一樣，具有通過氫鍵結(jié)合在一起的兩條鏈有義鏈和反義鏈。除了DNA中的胸苷被尿苷所替代外，編碼多肽的信使RNA具有與有義DNA鏈相同的核苷酸序列。因此，合成的反義核苷酸序列將與mRNA結(jié)合，并抑制由該mRNA編碼的蛋白質(zhì)的表達。
因此，使反義核苷酸靶向mRNA是關(guān)閉蛋白質(zhì)合成的一個機制，并由此成為一種有力的定向治療方法。例如，多聚半乳糖醛酸酶和2型毒蠅堿性乙酰膽堿受體的合成受到指向它們各自mRNA序列的反義核苷酸的抑制(美國專利5,739,119和美國專利5,759,829，兩份文獻特此完整地并入本文作為參考)。而且，采用細(xì)胞周期核蛋白、廣譜抗藥基因(MDG1)、ICAM-1、E-選擇蛋白、STK-1、紋狀體GABAA受體和人EGF(Jaskulski等，1988；Vasanthakumar和Ahmed，1989；Peris等，1998；美國專利5,801,154；美國專利5,789,573；美國專利5,718,709和美國專利5,610,288，所有文獻特此完整地并入本文作為參考)也顯示了反義抑制的例子。
因此，在示例性實施方案中，本發(fā)明提供含有能夠特異結(jié)合本文所述多核苷酸序列或其互補序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列。在一個實施方案中，該反義核苷酸含有DNA或其衍生物。在另一實施方案中，該核苷酸含有RNA或其衍生物。在第三個實施方案中，該核苷酸是含有硫代磷酸酯修飾的主鏈的修飾DNA。在第四種實施方案中，該核苷酸序列含有肽核酸或其衍生物。在所有的情況下，優(yōu)選的組合物含有與本文所公開多核苷酸的一個或多個部分互補、更優(yōu)選地基本上互補、甚至更優(yōu)選地完全互補的序列區(qū)域。所述一個或多個部分可以是約10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多個連續(xù)核苷酸、以及具有它們之間的所有居中長度的連續(xù)核苷酸。易于明了的是，“居中長度”在本文中是指這些引用值之間的任何長度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、51、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1,000等之間的所有整數(shù)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的核苷酸可以具有少至約10個、多至約1000個或者更多個核苷酸。
特異于指定基因序列的反義組合物的選擇是基于對所選靶序列(例如，示例性實例中的人序列)的分析、和對二級結(jié)構(gòu)、Tm、結(jié)合能、相對穩(wěn)定性的測定來進行的，并且反義組合物還基于它們相對缺乏形成二聚體、發(fā)夾、或其它將降低或妨礙與宿主細(xì)胞中靶mRNA特異結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)的能力來選擇。
mRNA中高度優(yōu)選的靶區(qū)域是那些位于或靠近AUG翻譯起始密碼子的區(qū)域，和那些基本上與該mRNA的5’區(qū)域互補的序列。對這些二級結(jié)構(gòu)的分析和對靶位點選擇的考慮是采用第4版OLIGO引物分析軟件(Rychlik，1997)和BLASTN 2.0.5算法軟件(Altschul等，1997)來實現(xiàn)的。
本發(fā)明人還考慮采用通過稱作MPG(27個殘基)的短肽載體進行的反義遞送方法。MPG肽含有一個來源于HIV gp41融合序列的疏水域和一個來源于SV40T抗原細(xì)胞核定位序列的親水域(Morris等，1997)。已經(jīng)闡明，幾個MPG肽分子即可包被反義核苷酸，而且它們能夠在不足1小時內(nèi)以相對高的效率(90％)被遞送至培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中。而且，與MPG的相互作用極大地增加了該核苷酸對抗核酸酶的穩(wěn)定性和跨越質(zhì)膜的能力(Morris等，1997)。
核酶盡管蛋白質(zhì)傳統(tǒng)上一直被用于核酸的催化反應(yīng)，但另一類大分子已表現(xiàn)出在此方面是有用的。核酶是以位點特異性方式切割核酸的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。核酶具有特異的催化域，該催化域具有內(nèi)切核酸酶活性(Kim和Cech，1987；Gerlach等，1987；Forster和Symons，1987)。例如，很多核酶以高度的特異性加速磷酸酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)，常常僅切割寡核苷酸底物的幾個磷酸酯中的一個(Cech等，1981；Michel和Westhof，1990；Reinhold-Hurek和Shub，1992)。該特異性被歸因于如下必要條件，即該底物在化學(xué)反應(yīng)前通過特異堿基配對相互作用與核酶的內(nèi)部引導(dǎo)序列(“IGS”)結(jié)合。
起初，核酶的催化反應(yīng)是作為涉及核酸的序列特異性切割/連接反應(yīng)的部分被觀察到的(Joyce，1989；Cech等1981)。例如，美國專利5,354,855(特此并入本文作為參考)報道，某些核酶能夠起到內(nèi)切核酸酶的作用，而且其序列特異性高于已知的核糖核酸酶的序列特異性，并接近于DNA限制性酶的序列特異性。因此，序列特異性核酶介導(dǎo)的基因表達抑制可能尤其適于治療應(yīng)用(Scanlon等，1991；Sarver等，1990)。近來，有報道稱，核酶在其所應(yīng)用的某些細(xì)胞系中引發(fā)遺傳改變；這些改變的基因包括癌基因H-ras、c-fos和HIV的基因。該工作的大部分涉及到基于特異核酶切割特異突變密碼子進行的靶mRNA修飾。
目前已知天然存在的酶性RNA的6種基本變體。每一種均能在生理條件下反式催化RNA磷酸二酯鍵的水解(因此能夠切割其它RNA分子)。一般，酶性核酸通過首先與靶RNA的結(jié)合來作用。該結(jié)合通過酶性核酸的靶結(jié)合部分來進行，該部分與該分子中進行靶RNA切割的酶性部分緊靠在一起。因此，該酶性核酸通過互補堿基配對首先識別，然后結(jié)合靶RNA，一旦與正確位點結(jié)合后，通過酶學(xué)作用切開該靶RNA。對該靶RNA的策略性切割將破壞其指導(dǎo)所編碼蛋白合成的能力。在酶性核酸對其RNA靶標(biāo)實現(xiàn)結(jié)合和切割后，它將從該RNA上被釋放出來以尋找另一靶標(biāo)，并能重復(fù)結(jié)合和切割新的靶標(biāo)。
核酶的酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)于許多技術(shù)，例如反義技術(shù)(在該技術(shù)中核酸分子簡單地與核酸靶標(biāo)結(jié)合以阻斷其翻譯)，因為實現(xiàn)治療性處理所必需的核酶濃度比所需的反義寡核苷酸濃度低。此優(yōu)點反映了核酶通過酶學(xué)方式起作用的能力。因此，單一一個核酶分子能夠切割許多靶RNA分子。此外，核酶還是一種高度特異的抑制劑，其抑制特異性不僅依賴于與靶RNA結(jié)合的堿基配對機制，還依賴于對靶RNA實行切割的機制?？拷懈钗稽c的單個堿基錯配、或堿基替代可以完全地消除核酶的催化活性。在反義分子中的相似錯配并不妨礙其作用(Woolf等，1992)。因此，核酶作用的特異性比與相同RNA位點結(jié)合的反義寡核苷酸的作用特異性高。
在錘頭、發(fā)夾、丁型肝炎病毒、I型內(nèi)含子或RNaseP RNA(與RNA引導(dǎo)序列相關(guān))或鏈孢霉屬(Neurospora)VS RNA的基序中可以形成酶性核酸分子。錘頭基序的例子描述于Rossi等(1992)。發(fā)夾基序的例子描述于Hampel等(歐洲專利申請公開文本EP 0360257)、Hampel和Tritz(1989)、Hampel等(1990)和美國專利5,631,359(特此并入本文作為參考)。丁型肝炎病毒基序的例子描述于Perrotta和Been(1992)；RNaseP基序的例子描述于Guerrier-Takada等(1983)；鏈孢霉屬VS RNA的核酶基序描述于Collins(Saville和Collins，1990；Saville和Collins，1991；Collins和Olive，1993)；I型內(nèi)含子的例子描述于美國專利4,987,071(特此并入本文作為參考)。對于本發(fā)明的酶性核酸分子重要的僅是，該分子具有與一或多個靶基因RNA區(qū)域互補的特異底物結(jié)合位點，并且它在該底物結(jié)合位點中或周圍具有賦予該分子RNA切割活性的核苷酸序列。因此，無需將該核酶的結(jié)構(gòu)限定于本文所提及的具體基序。
在某些實施方案中，制備對目的靶標(biāo)(例如本文所公開的其中一個序列)的RNA表現(xiàn)出高度特異性的酶性切割劑可能是重要的。該酶性核酸分子優(yōu)選定向于靶mRNA的高度保守序列區(qū)。根據(jù)需要可以向特定細(xì)胞遞送外來的這些酶性核酸分子。或者，可以從遞送至特定細(xì)胞的DNA或RNA載體表達核酶。
小的酶性核酸基序(例如錘頭或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的基序)也可以用于外來遞送。這些分子的簡單結(jié)構(gòu)增加了該酶性核酸侵入mRNA結(jié)構(gòu)的靶區(qū)的能力?；蛘?，可以在細(xì)胞中從真核啟動子表達催化性RNA分子(例如Scanlon等，1991；Kashani-Sabet等，1992；Dropulic等，1992；Weerasinghe等，1991；Ojwang等，1992；Chen等，1992；Sarver等，1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，任何核酶都可以在真核細(xì)胞中從適合的DNA載體上表達。這些核酶的活性可以通過它們借助于第二種核酶自初級轉(zhuǎn)錄本中釋放而得以提高(國際專利申請公開文本W(wǎng)O93/23569，和國際專利申請公開文本W(wǎng)O 94/02595，兩者均籍此并入本文作為參考；Ohkawa等，1992；Taira等，1991；和Ventura等，1993)。
可以將核酶直接加入靶細(xì)胞中，或可以使其與陽離子脂質(zhì)、脂類復(fù)合物混合、或包裝在脂質(zhì)體中、或以其它方式遞送至靶細(xì)胞中。該RNA或RNA復(fù)合物可以通過注射、氣霧劑吸入、輸注泵或支架，以摻入或不摻入生物聚合物中的形式，離體或體內(nèi)局部施用給相關(guān)組織。
核酶可按國際專利申請公開文本W(wǎng)O 93/23569和WO 94/02595(均引入本文作為參考)所述設(shè)計，并按所述合成用于體外和體內(nèi)實驗。也可優(yōu)化這些核酶便于遞送。盡管提供了具體實例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉，必要時可采用其它物種的等同RNA靶標(biāo)。
可以通過計算機折疊(Jaeger等，1989)單獨地對錘頭或發(fā)夾核酶進行分析，以評價該核酶序列是否折疊成適當(dāng)?shù)亩壗Y(jié)構(gòu)。將在結(jié)合臂和催化核心之間具有不利分子間相互作用的那些核酶排除在考慮之外?？梢赃x擇不同的結(jié)合臂長度以優(yōu)化活性。一般，每條臂上至少5個左右的堿基能夠結(jié)合靶RNA，或以其它方式與靶RNA相互作用。
可以將具有錘頭或發(fā)夾基序的核酶設(shè)計成與mRNA信息中的各位點退火，并且可以對其進行化學(xué)合成。所用的合成方法同Usman等(1987)和Scaringe等(1990)所述的用于正常RNA合成的程序，并且采用通常的核酸保護和偶聯(lián)基團，例如5’末端采用二甲氧基三苯甲基，而3’末端采用亞磷酰胺。典型地，平均的逐步偶聯(lián)產(chǎn)量大于98％。發(fā)夾核酶可以分兩部分合成，然后退火以重新構(gòu)建活性核酶(Chowrira和Burke，1992)?？梢詫嗣高M行廣泛的修飾，以便通過采用核酸酶抗性基團如2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-o-甲基、2’-H增加穩(wěn)定性(綜述參見例如Usman和Cedergren，1992)。核酶可以采用一般方法通過凝膠電泳或通過高壓液相層析獲得純化，并重懸在水中。
核酶的活性可以通過改變核酶結(jié)合臂的長度、或化學(xué)合成修飾的核酶來優(yōu)化，所述修飾有防止該核酶受到血清核糖核酸酶降解的修飾(見例如國際專利申請公開文本W(wǎng)O 92/07065；Perrault等，1990；Pieken等，1991；Usman和Cedergren，1992；國際專利申請公開文本W(wǎng)O 93/15187；國際專利申請公開文本W(wǎng)O 91/03162；歐洲專利申請公開文本92110298.4；美國專利5,334,711；和國際專利申請公開文本W(wǎng)O 94/13688，它們描述了能夠?qū)γ感訰NA分子的糖部分進行的各種化學(xué)修飾)，增強核酶在細(xì)胞中的效力的修飾、以及為了縮短RNA合成時間和減少化學(xué)必要條件而進行的莖區(qū)II堿基的清除。
Sullivan等(國際專利申請公開文本W(wǎng)O 94/02595)描述了遞送酶性RNA分子的一般方法。核酶可以通過熟悉本領(lǐng)域的人員已知的多種方法施用給細(xì)胞。這些方法包括但不限于包裝在脂質(zhì)體內(nèi)、離子電滲療法、或摻入其它載體(如水凝膠、環(huán)化糊精、生物可降解微型囊(nanocapsule)、和生物粘著微球體)中。對于一些情況，可以在有或沒有上述載體的情況下直接將核酶離體遞送給細(xì)胞或組織?；蛘撸梢酝ㄟ^直接吸入、直接注射、或利用導(dǎo)管、輸注泵或支架，進行RNA/載體組合的局部遞送。其它遞送途徑包括，但不限于，血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或關(guān)節(jié)注射，氣霧劑吸入，口服(片劑或丸劑形式)，局部的、系統(tǒng)的、眼、腹膜內(nèi)和/或鞘內(nèi)遞送。關(guān)于核酶遞送和施用的更為詳細(xì)的描述參見國際專利申請公開文本W(wǎng)O 94/02595和國際專利申請公開文本W(wǎng)O 93/23569，所有文獻均特此并入本文作為參考。
在細(xì)胞內(nèi)積聚高濃度核酶的另一方法是將該核酶編碼序列摻入DNA表達載體中。核酶序列的轉(zhuǎn)錄由針對真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的啟動子驅(qū)動。從pol II或pol III啟動子獲得轉(zhuǎn)錄本將在所有細(xì)胞中以高水平表達；在指定細(xì)胞類型中指定的pol II啟動子的水平將取決于附近存在的基因調(diào)節(jié)序列(增加子、沉默子等)的性質(zhì)。也可以采用原核RNA聚合酶啟動子，只要在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中有該原核RNA聚合酶表達即可(Elroy-Stein和Moss，1990；Gao和Huang，1993；Lieber等，1993；Zhou等，1990)。從這些啟動子表達的核酶可以在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮功能(例如Kashani-Saber等，1992；Ojwang等，1992；Chen等，1992；Yu等，1993；L’Huillier等，1992；Lisziewicz等，1993)?？梢詫⑦@些轉(zhuǎn)錄單位摻入多種用于導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的載體中，這些載體包括，但不限于，質(zhì)粒DNA載體、病毒DNA載體(例如腺病毒或腺相關(guān)病毒載體)、或病毒RNA載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、無名森林病毒、新培斯病毒載體)。
核酶可以用作診斷工具檢查患病細(xì)胞中的遺傳漂變(geneticdrift)和突變。它們還可以用于評價靶RNA分子的水平。核酶活性和靶RNA結(jié)構(gòu)間的緊密關(guān)系使得可以在改變了靶RNA堿基配對和三維結(jié)構(gòu)的該分子任何區(qū)域中檢測到突變。通過采用多種核酶，可以給在體外、以及細(xì)胞和組織內(nèi)對RNA的結(jié)構(gòu)和功能重要的核苷酸改變進行作圖。可以采用核酶對靶RNA的切割抑制基因表達和(基本上)確定疾病進程中指定基因產(chǎn)物的作用。以此方式，可以將其它遺傳靶標(biāo)確定為該疾病的重要中介體。這些研究將通過提供綜合治療(例如靶向不同基因的多種核酶、與已知小分子抑制劑偶聯(lián)的核酶、或聯(lián)合核酶和/或其它化學(xué)或生物分子進行的間歇療法)的可能性導(dǎo)致對該疾病進程的更好治療。核酶的其它體外應(yīng)用是本領(lǐng)域熟知的，包括檢測與IL-5相關(guān)疾病有關(guān)的mRNA的存在。該RNA通過采用標(biāo)準(zhǔn)方法在以核酶進行處理后測定切割產(chǎn)物的存在來檢測。
結(jié)合劑本發(fā)明還提供特異地與cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白質(zhì)結(jié)合的藥劑，例如抗體和其抗原結(jié)合片段。在本文中，如果抗體或其抗原結(jié)合片段與cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白質(zhì)的反應(yīng)(在例如ELISA中)處于可檢測到的水平，而在相似條件下與無關(guān)蛋白質(zhì)的反應(yīng)不能被檢測到時，則被認(rèn)為與cofilin 1和/或磷酸化cofilin1蛋白質(zhì)“特異結(jié)合”。本文所用“結(jié)合”是指兩個獨立分子之間的非共價聯(lián)接以致形成復(fù)合物。結(jié)合能力可以通過例如測定形成該復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來評價。結(jié)合常數(shù)是當(dāng)用各成分的濃度乘積除該復(fù)合物的濃度時獲得的值。一般地，在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)大于約103L/mol時，兩個化合物被認(rèn)為是“相結(jié)合的”。該結(jié)合常數(shù)可以采用本領(lǐng)域熟知的方法測定。
采用本文提供的代表性測定方法，結(jié)合劑還能夠區(qū)分癌癥患者/癌細(xì)胞是否具有耐受紫杉醇類紫杉烷類化療藥物的耐受性。換言之，與cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體或其它結(jié)合劑將在至少約20％耐藥性患者/癌細(xì)胞中產(chǎn)生指示耐藥性存在的信號，而將在至少約90％敏感患者/癌細(xì)胞中產(chǎn)生指示耐藥性不存在的信號。為了確定結(jié)合劑是否滿足此要求，可以按本文所述方法測定在來自(用標(biāo)準(zhǔn)臨床檢驗確定的)耐藥和敏感的患者的生物樣品(例如血液、血清、痰、尿和/或腫瘤活檢組織)中或在耐藥或敏感癌細(xì)胞中是否存在與該結(jié)合劑結(jié)合的多肽。很明顯，分析的耐藥性和敏感樣品的數(shù)量應(yīng)當(dāng)具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。每個結(jié)合劑都應(yīng)滿足以上標(biāo)準(zhǔn)；然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知道，可以聯(lián)合使用多個結(jié)合劑以提高靈敏度。
滿足以上要求的任何藥劑都可以是結(jié)合劑。例如，結(jié)合劑可以是含有或不含有肽成分的核糖體、RNA分子或多肽。在一個優(yōu)選實施方案中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段?？贵w的制備可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種技術(shù)中的任意一種。見例如Harlow和Lane，抗體實驗室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，1988。一般地，可以通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備抗體，這些技術(shù)包括按本文所述制備單克隆抗體，或通過用抗體基因轉(zhuǎn)染適合的細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞宿主，以便使得可以產(chǎn)生重組抗體。在一項技術(shù)中，首先給多種哺乳動物(例如小鼠、大鼠、家兔、綿羊或山羊)中的任一種注射含有本發(fā)明多肽的免疫原。在該步驟中，可以將本發(fā)明的多肽不經(jīng)修飾用作免疫原。或者，尤其是對于相對短的多肽，如果將該多肽與載體蛋白質(zhì)，例如牛血清白蛋白或匙孔血藍蛋白，連接在一起，則可以引起極佳的免疫應(yīng)答。給該動物宿主注射該免疫原，并優(yōu)選地根據(jù)預(yù)先確定的時間表摻入一或多次加強免疫，然后定期采取該動物的血液。然后可以從抗血清中，通過例如采用與適合固相支持物偶聯(lián)的該多肽進行親和層析，純化對該多肽具有特異性的多克隆抗體。
對目的抗原多肽具有特異性的單克隆抗體可以采用例如Kohler和Milstein的技術(shù)(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)，及其改良方法來制備。簡而言之，這些方法涉及制備能夠產(chǎn)生具有期望特異性(即與目的多肽的反應(yīng)性)的抗體的永生化細(xì)胞系。可以從例如獲自按上述方法免疫的動物的脾細(xì)胞制備這些細(xì)胞系。然后通過例如和骨髓瘤細(xì)胞融合伴侶，優(yōu)選與該免疫動物同基因的骨髓瘤細(xì)胞，融合，使該脾細(xì)胞永生化。可以采用多種融合技術(shù)。例如，可以將該脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞與非離子去污劑混合幾分鐘，然后以低密度鋪在支持雜種細(xì)胞而不支持骨髓瘤細(xì)胞生長的選擇培養(yǎng)基上。優(yōu)選的篩選技術(shù)采用了HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)篩選。在足夠長的時間之后，通常為約1-2周，可觀察到雜種集落。選擇單集落，并測試其培養(yǎng)物上清液與本發(fā)明多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。
可以從培養(yǎng)的雜交瘤集落的上清液中分離單克隆抗體。此外，還可以采用各種技術(shù)增加產(chǎn)量，例如將該雜交瘤細(xì)胞系注射入適合的脊椎動物宿主例如小鼠的腹腔內(nèi)。然后可以從腹水或血液中收獲單克隆抗體?？梢酝ㄟ^常規(guī)技術(shù)例如層析、凝膠過濾、沉淀和抽提從這些抗體中除去雜質(zhì)。本發(fā)明多肽可以用于純化方法的例如親和層析步驟中。
在某些實施方案中，可能優(yōu)選采用抗體的抗原結(jié)合片段。這些片段包括Fab片段，它們可以采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。簡而言之，可以通過在A蛋白珠柱上通過親和層析從兔血清中純化免疫球蛋白(Harlow和Lane，抗體實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，然后通過木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生Fab和Fc片段。該Fab和Fc片段可以在A蛋白珠柱上通過親和層析分離。
可以將本發(fā)明的單克隆抗體與一或多種治療劑偶聯(lián)在一起。在此方面適合的治療劑包括放射性核素、分化誘導(dǎo)劑、藥物、毒素和它們的衍生物。優(yōu)選的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。優(yōu)選的藥物包括氨甲蝶呤、及嘧啶和嘌呤的類似物。優(yōu)選的分化誘導(dǎo)劑包括佛波酯和丁酸。優(yōu)選的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、假單孢菌外毒素、志賀氏菌毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。
寡核苷酸適配體SELEX技術(shù)是近年來發(fā)展起來的研究核酸結(jié)構(gòu)、功能及進化等的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，它不僅在基礎(chǔ)研究、生物篩選等方面有很好的應(yīng)用，而且在臨床診斷方面也顯示廣闊的前景(Brody EN & Gold L，J.Biotechnol.，2000，755-13)。篩選出的寡核苷酸適配子(aptamer)可高親和力和高特異性地識別不同的分子。它的親和力和特異性可與抗體相媲美，被認(rèn)為是“挑戰(zhàn)”抗體地位的一種新型試劑，在疾病的診斷和治療中發(fā)揮越來越重要的作用。SELEX技術(shù)一般需要數(shù)輪或數(shù)十輪才能得到其相應(yīng)配基。最近，Santa-Coloma TA等報道了用靶標(biāo)切換技術(shù)制備的高特異性“polyclonal oligobody(多克隆寡核苷酸適配體)”、“monoclonal oligobody(單克隆寡核苷酸適配體)”或“synthetic oligobody(合成寡核苷酸適配體)”(BianchiniM et al，J.Immunol.methods，2001，252191-197)可特異性地識別相應(yīng)的蛋白質(zhì)，應(yīng)用于蛋白質(zhì)印跡、免疫組化、免疫共沉淀等分析實驗中。
蛋白類抗體的產(chǎn)生與應(yīng)用存在以下限制(1)用毒性抗原時，免疫動物承受不了，免疫原性弱的難以產(chǎn)生抗體；(2)雜交瘤產(chǎn)生于鼠，在人體應(yīng)用受限；異源抗體在診斷中還產(chǎn)生非特異性反應(yīng)(假陽性)；(3)成本高、費時費力，稀有抗體需大量篩選才能得到；(4)克隆細(xì)胞株的有效保存不易，有些雜交瘤難以在體內(nèi)生長；(5)批間質(zhì)量不一，診斷時要重新優(yōu)化；(6)體內(nèi)與體外的識別特異性有差別；(7)抗體-靶分子相互作用的動力學(xué)參數(shù)無法依要求改變；(8)壽命有限，對溫度敏感，發(fā)生不可逆變性。而核酸(適配子或適配體)有以下的優(yōu)越性(1)在體外而非體內(nèi)(動物、細(xì)胞)條件下篩選，特性可依要求改變；(2)動力學(xué)參數(shù)可依體外診斷條件的要求而改變；(3)無毒性抗原和免疫原性弱的抗原所受的限制；(4)在體外化學(xué)合成，可以保證時間、質(zhì)量和數(shù)量；(5)特異性和親和性不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾；(6)可以在合成時精確、定點、隨意連接其它功能基團和分子，如巰基、氨基和熒光素、生物素、酶等；(7)比抗體分子小，更適用于體內(nèi)影像診斷和治療。如接上硫代磷酸，可用于細(xì)胞內(nèi)診斷和治療；(8)變性和復(fù)性可逆，而且速度快，可反復(fù)使用、長期保存和在室溫下運輸(Jayasena SD，Clin.Chem.，1999，451628-1650)。
調(diào)節(jié)紫杉醇化療藥物耐藥性的藥劑的篩選本發(fā)明此篩選方法中將獲得的或鑒定的化合物可以是能結(jié)合本發(fā)明任何核酸、肽或蛋白質(zhì)的化合物。將鑒定的其它目的化合物是調(diào)節(jié)基因或本發(fā)明蛋白質(zhì)表達的化合物，這樣通過所述化合物的作用增加或降低所述基因或蛋白質(zhì)的表達。做為替代方案，該化合物可以通過增加或降低任何本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性發(fā)揮它的作用。
例如在樣品，例如來源于動物的細(xì)胞提取物中可以包含所述一種化合物或所述多種化合物。而且，所述化合物可以是本領(lǐng)域已知的，但是迄今為止不知道其具有抑制或激活cofilin1/磷酸化相互作用蛋白質(zhì)的能力。反應(yīng)混合物可以是無細(xì)胞提取物或可以包含細(xì)胞或組織培養(yǎng)物。用于本發(fā)明方法的適合設(shè)備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且，一般地，在Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第3版(1994)，特別是17章中進行了描述。多種化合物可以，例如添加到反應(yīng)混合物、細(xì)胞培養(yǎng)基中或者注射進入細(xì)胞中。
如果在本發(fā)明方法中鑒定了含有化合物或多種化合物的樣品，那么可以從鑒定含有能起拮抗劑/激動劑作用的化合物的原始樣品分離化合物，或者如果，例如原始樣品由多種不同化合物組成，人們可以進一步細(xì)分原始樣品，以降低每個樣品的不同物質(zhì)的數(shù)量，并且利用原始樣品的細(xì)分部分重復(fù)該方法。根據(jù)樣品的復(fù)雜性，可以進行上述步驟幾次，優(yōu)選地，直到根據(jù)本發(fā)明方法鑒定的樣品僅僅含有有限數(shù)量或僅僅含有一種物質(zhì)為止。優(yōu)選地，所述樣品含有具有類似化學(xué)和/或物理特性的物質(zhì)，最優(yōu)選所述物質(zhì)相同。優(yōu)選地，根據(jù)上述方法鑒定的化合物或其衍生物被進一步制成適于給動物給藥的形式。
作為本發(fā)明方法的候選藥劑，可以利用適合的計算機程序可以進行本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基序的折疊模擬和計算機再設(shè)計(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.1(1995)，675-679)或者可以通過化合物組合文庫篩選獲得。蛋白質(zhì)折疊的計算機模擬可以用于詳細(xì)肽和蛋白質(zhì)模型的構(gòu)象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。特別地，通過計算機輔助檢索互補肽序列，適合的程序可以用于cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1、其配體或其它相互作用蛋白質(zhì)的相互作用位點的鑒定(Fassina，Immunomethods 5(1994)，114-120)。而且，在背景技術(shù)中，例如在Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann，N.Y.Acac.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991中描述了用于蛋白質(zhì)和肽設(shè)計的適合的計算機系統(tǒng)。從上述計算機分析獲得的結(jié)果可以用于例如本發(fā)明蛋白質(zhì)或其片段的肽模擬物的制備。這種蛋白質(zhì)天然氨基酸序列的假肽類似物可以非常有效地模擬親本蛋白質(zhì)(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，在蛋白質(zhì)或其片段中容易得到的非手性Ω-氨基酸殘基的摻入將引起脂肪族鏈聚亞甲基單元對氨基鍵的置換，因此提供了構(gòu)建肽模擬物的方便策略(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。在現(xiàn)有技術(shù)中還描述了其它系統(tǒng)中的小肽激素的超活性肽模擬類似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。也可以通過連續(xù)胺烷基化合成肽模擬物組合文庫，和檢測由此得到化合物，例如它們的結(jié)合，激酶抑制和/或免疫特性鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)適合的肽模擬物。在現(xiàn)有技術(shù)，例如在Ostresh，Methods inEnzymology 267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715中描述了肽模擬物組合文庫產(chǎn)生的方法和用途。而且，可以利用本發(fā)明蛋白質(zhì)的三維和/或晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計生物活性肽模擬物抑制劑(Rose，Biochemistry 35(1996)，12933-12944；Ruterber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。
本發(fā)明相應(yīng)地也提供調(diào)節(jié)本發(fā)明耐藥性的藥劑、以及包含所述藥劑的藥物組合物和所述藥劑在制備調(diào)節(jié)本發(fā)明所述耐藥性中的用途。
耐藥性的檢測和診斷一般地，可以基于癌細(xì)胞株或從患者獲得的腫瘤活檢組織中cofilin1和/或磷酸化cofilin 1蛋白質(zhì)的含量和/或編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸的含量，檢測所述癌細(xì)胞和患者是否具有紫杉醇類紫杉烷類化療藥物耐藥性。一般本文提供的結(jié)合劑可以檢測生物樣品中與該藥劑結(jié)合的抗原的水平。多核苷酸引物和探針可以用于檢測編碼腫瘤蛋白質(zhì)的mRNA的水平，該水平也指示了耐藥性的存在與否。
對于采用結(jié)合劑檢測樣品中的多肽標(biāo)志而言，有多種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的測定形式可以使用。見例如Harlow和Lane，抗體實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般地，癌細(xì)胞株和癌癥患者的紫杉醇化療藥物耐藥性可以通過以下步驟確定(a)用結(jié)合劑接觸癌細(xì)胞株或從患者獲得的腫瘤樣品；(b)檢測樣品中與該結(jié)合劑結(jié)合的多肽的水平；和(c)將該多肽水平與預(yù)先確定的截斷值進行比較。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該測定涉及采用固定在固相支持物上的結(jié)合劑結(jié)合該多肽，并從樣品剩余物中分離該多肽。然后采用含有報道基團并特異與該結(jié)合劑/多肽復(fù)合物結(jié)合的檢測試劑檢測該結(jié)合的多肽。這些檢測試劑可以含有例如，與該多肽特異結(jié)合的結(jié)合劑、或與該結(jié)合劑特異結(jié)合的抗體或其它藥劑，例如抗免疫球蛋白、G蛋白、A蛋白或凝集素?；蛘撸梢岳酶偁帨y定法，在該方法中用報道基團標(biāo)記多肽，并在固定化結(jié)合劑與樣品一起孵育后，允許該多肽和該結(jié)合劑結(jié)合。該樣品中的成分對該標(biāo)記多肽與該結(jié)合劑結(jié)合的抑制程度指示了該樣品與該固定化結(jié)合劑的反應(yīng)性。適合用于這些測定方法的多肽包括以上所述的全長cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白質(zhì)和其與該結(jié)合劑結(jié)合的部分。
正如以上指出的，還可以，或者作為替代方案可以，基于癌細(xì)胞樣品中編碼cofilin蛋白質(zhì)的mRNA的水平檢測耐藥性。例如，可以在基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的測定中采用至少兩個寡核苷酸引物擴增來源于樣品的腫瘤cDNA的部分，其中該寡核苷酸引物中的至少一個對編碼該cofilin1蛋白質(zhì)的多核苷酸是特異的(即可以與之雜交)。然后采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，例如凝膠電泳，分離并檢測該擴增的cDNA。相似地，可以在雜交測定(hybridization assay)中采用特異與編碼cofilin1蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交的寡核苷酸探針，檢測生物樣品中是否存在編碼該腫瘤蛋白質(zhì)的多核苷酸。
本發(fā)明還提供用于任一種以上檢測和診斷方法的試劑盒。這些試劑盒典型地含有進行診斷測定所必需的兩種或多種成分。這些成分可以是化合物、試劑、容器和/或設(shè)備。例如，試劑盒中的一個容器可含有特異與cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白質(zhì)結(jié)合的單克隆抗體或其片段，或者該試劑盒中的一個容器可含有特異于cofilin1編碼序列的核酸探針或引物。
癌癥治療在本發(fā)明的其它方面，涉及基于本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1與癌癥的紫杉醇化療藥物耐藥性的相關(guān)性，治療癌癥。在這些方法中，典型地通過本發(fā)明的診斷方法鑒定患者的耐藥性，然后根據(jù)耐藥性結(jié)果確定患者的紫杉醇類紫杉烷類化療藥物施用方案。在一個實施方案中，本發(fā)明的治療方法包括對確定為具備耐藥性的患者通過本發(fā)明的調(diào)節(jié)耐藥性的方法降低其耐藥性后，再施用紫杉醇類紫杉烷類化療藥物。另一實施方案中，本發(fā)明的治療方法包括根據(jù)確定的耐藥性結(jié)果，調(diào)整紫杉醇類紫杉烷類化療藥物的給藥量、給藥頻率等。再一實施方案中，本發(fā)明治療方法包括根據(jù)確定的耐藥性結(jié)果，替代紫杉烷類化療藥物用于該患者的治療中。本文所用“患者”是指任何恒溫動物，如哺乳動物，優(yōu)選人類。
藥物組合物在其它實施方案中，本發(fā)明涉及本文所公開的一或多種多核苷酸、多肽、反義寡核苷酸、核酶、寡核苷酸適配體和/或抗體在可藥用載體或者賦形劑中的制劑，用于單獨或聯(lián)合一或多種其它形式的診斷/治療方法施用給細(xì)胞或動物。一個實施方案中，本發(fā)明藥物組合物可以用于診斷本發(fā)明患者的紫杉醇化療藥物耐藥性并預(yù)測/預(yù)后所述化療藥物的治療效果。另一實施方案中，本發(fā)明藥物組合物可以用于調(diào)整本發(fā)明患者的紫杉醇化療藥物耐藥性，在此情況下，優(yōu)選地，本發(fā)明藥物組合物以靶向患者腫瘤細(xì)胞并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達改變(優(yōu)選下調(diào))的方式實現(xiàn)對患者耐藥性的調(diào)整。
可藥用賦形劑和載體溶液的配制是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。同樣，對于在各種治療方案中使用本文所述具體組合物的適合給藥和治療方案(包括例如口服、非腸道途徑、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、和肌內(nèi)給藥和藥物配制)的研制也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
本文所述治療組合物的施用途徑和頻率及劑量將因人而異，而且可以由臨床醫(yī)師確定。一般地，可以通過注射(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、鼻腔途徑(例如通過吸入)或口服，施用這些藥物組合物。一般地，適當(dāng)?shù)膭┝亢椭委煼桨柑峁┳阋垣@得治療益處的活性成分量，其可以通過確定與未治療患者相比經(jīng)治療的患者出現(xiàn)改善的臨床效果來監(jiān)測或確定。
以下通過實施例進一步對本發(fā)明進行舉例說明。但是應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例不以任何方式對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
實施例一、卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞株的建立及相關(guān)耐藥機制檢測的研究(一)方法1.耐藥細(xì)胞株的建立采用小劑量濃度遞增間歇誘導(dǎo)和大劑量沖擊誘導(dǎo)法誘導(dǎo)人漿液性卵巢癌細(xì)胞SKOV3(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生。
(1)小劑量濃度遞增間歇誘導(dǎo)方法SKOV3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)條件(37℃、5％CO2)至對數(shù)生長期(密度至70％-80％)時，加入紫杉醇泰索(Taxol)(美國百時美施貴寶公司)10nM，37℃、5％CO2培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)液，次日會有約50％的細(xì)胞死亡；待細(xì)胞漸漸恢復(fù)，達到密度約70％～80％時，重復(fù)這樣的刺激10次，細(xì)胞在同樣藥物濃度下已經(jīng)基本上無死亡時，提高藥物濃度，遞增10hM，重復(fù)誘導(dǎo)10次，最終的藥物誘導(dǎo)濃度為紫杉醇30hM。耐藥細(xì)胞培養(yǎng)在含紫杉醇30nM培養(yǎng)液(含10％小牛血清的HG-DMEM(美國Gibco公司))中，見圖1。
(2)大劑量沖擊誘導(dǎo)方法SKOV3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)條件(含10％小牛血清的HG-DMEM)(37℃、5％CO2)，對數(shù)生長期時，加入紫杉醇2.5uM，37℃、＞5％CO2培養(yǎng)1h，更換培養(yǎng)液。次日會有約50％的細(xì)胞死亡；待細(xì)胞漸漸恢復(fù)，達到密度約70％～80％時，重復(fù)同樣的刺激共計21次。最終藥物誘導(dǎo)濃度為紫杉醇2.5uM。耐藥細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)時，每12周用2.5uM紫杉醇沖擊一次，見圖2。
2.耐紫杉醇耐藥細(xì)胞生物學(xué)特性的研究(1)耐藥指數(shù)(resistant index，RI)的測定——MTT法1)對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25％胰酶消化離心，用HG-DMEM培養(yǎng)液制成1×106/ml細(xì)胞懸液；2)接種到96孔板中，每孔加入100ul培養(yǎng)液，約含2×103個細(xì)胞，37℃、5％CO2過夜；3)第2日加入不同濃度梯度的化療藥物溶液(用HG-DMEM配制梯度濃度的化療藥物溶液)，為紫杉醇20、2、0.2、0.02、0.002、0.0002、0.0002ng/ml，每個濃度設(shè)3孔，每孔加100ul藥液，并留3孔加100ul培養(yǎng)液做空白對照，37℃、5％CO2培養(yǎng)；4)72h后、棄去培養(yǎng)液，在濾紙上輕拍令干。PBS洗滌1次。
5)每孔加入100ul無藥培養(yǎng)液，1mg/ml MTT(四甲基偶氮唑鹽)20ul，37℃、5％CO2培養(yǎng)4-6h6)每孔加二甲基亞砜100ul，37℃、5％CO2培養(yǎng)過夜。
7)酶標(biāo)儀檢測各孔于波長540nm處OD值。最終OD值為各孔OD值與空白對照孔平均值的差值。
按下面公式計算抑制率，以抑制率為縱軸、藥物濃度為橫軸繪制抑制率曲線。抑制率為50％時的藥物濃度即為半數(shù)抑制率(IC50)。耐藥株細(xì)胞的IC50與敏感株的IC50的比值為耐藥指數(shù)RI。各耐藥株凍存3個月后復(fù)蘇仍維持相似的耐藥性時，即視為誘導(dǎo)成功。
(2)細(xì)胞染色(姬姆薩-瑞氏染色)1)對數(shù)期生長的細(xì)胞，胰酶消化后稀釋到約2×104/ml細(xì)胞懸液；2)接種到Φ3cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長至50％；3)吸盡培養(yǎng)基，PBS漂洗2次；4)甲醇2ml/孔固定30分鐘，加入去離子水；5)配染色液Na2HPO46mlKH2PO44ml瑞氏染色劑(美國Sigma公司) 160ul梅格-葛氏染色劑(Sigma) 120ul姬姆薩染色劑(Sigma)0.5ml6)倒掉培養(yǎng)皿中的去離子水，晾干后，加入染色液1.5ml/孔，4℃過夜；7)顯微鏡下照相。
(3)細(xì)胞生長曲線的檢測(7天法)1)對數(shù)期生長的細(xì)胞，0.25％胰酶消化離心，HG-DMEM培養(yǎng)基稀釋成約5×103/ml細(xì)胞懸液；2)接種24孔板，加1ml/孔，即5×103細(xì)胞/孔。37℃、5％CO2培養(yǎng)；3)每天取3孔細(xì)胞胰酶消化，分別計數(shù)，取其均值；如此連續(xù)7天。
取所得細(xì)胞數(shù)的對數(shù)值，繪制細(xì)胞生長曲線。根據(jù)Patterson公式計算細(xì)胞在對數(shù)生長期的群體倍增時間(Td)Td＝Tlg2/lg(N/N0)。
(4)細(xì)胞生長周期的檢測對數(shù)期生長的細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)≥1×106)1)固定(a)0.25％胰酶消化成細(xì)胞懸液，1500g離心10分鐘，棄上清；(b)PBS洗滌一次，1500g離心10分鐘，棄上清；(c)加入0.3ml PBS(含10％小牛血清30ul)重懸；(d)懸液加至放有0.7ml無水乙醇的EP管內(nèi)，-20℃保存。
2)PI(碘化丙啶，Sigma)染色(a)-20℃固定的細(xì)胞3000g離心1分鐘；(b)PBS洗滌2次，每次1500g離心10分鐘，棄上清；(c)加入0.2ml RNaseA(1mg/ml)；(d)37℃水浴30分鐘；(e)加入0.3ml PI(100ug/ml)，暗處染色20分鐘；(f)流式細(xì)胞儀分析DNA含量分布、multicycle軟件分析G1、G2、S各期細(xì)胞比例。
(5)細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)觀察1)對數(shù)期生長的細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)≥1×106)，離心棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次；2)加入PBS10ml，送至軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院(北京海淀區(qū)太平路27號)儀器檢測中心電鏡室進行細(xì)胞切片；
3)細(xì)胞長至對數(shù)生長期，PBS洗兩遍，用細(xì)胞刷將細(xì)胞刮下，1000g離心10分鐘，3％戊二醛(1/15M PBS pH7.4)，4℃下固定2小時，4℃下1/15M PBS+0.19M蔗糖緩沖液漂洗15分鐘。乙醇4℃下梯度脫水(50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、90％乙醇+90％丙酮、90％丙酮、100％丙酮各10分鐘)，100％丙酮在室溫下脫水10分鐘。100％丙酮∶包埋劑(1∶1)室溫浸透30分鐘，純包埋劑浸透過夜。進行包埋聚合時間為35℃，12小時45℃，12小時；60℃，24小時。ULTRACUT E/S型切片機(美國RMC公司)進行超薄切片，醋酸鈾染液避光染色10分鐘，檸檬酸鉛染色10分鐘。
3)電壓75kV，EM400T電鏡(荷蘭Philips公司)觀察，選擇×8000、×22000電鏡照相。
3.已知耐藥相關(guān)基因表達的測定(1)mRNA水平測定已知耐藥相關(guān)基因1)細(xì)胞總RNA的提取a)培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期，0.25％胰酶消化離心收集，PBS洗滌2次。
b)加1ml Trizol(Sigma)，吹打均勻，靜置5min。
c)加0.5ml氯仿，靜置10min。
d)4℃12000g，10min。
e)取上清，加入0.5ml異丙醇，室溫靜置10分鐘。
f)4℃12000g，10min。
g)棄上清，沉淀用DEPC水配制的75％乙醇漂洗，9000g 5min。
h)棄上清，靜置干燥10min。
i)沉淀用DEPC水50～100ml溶解，經(jīng)電泳、紫外分光光度計鑒定，-70℃保存。
2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(日本TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)2×RNA selective PCR buffer25ulMgcl210uldNTP 5ulAMV RTase 1ul
Rnase抑制劑1ulOligo dt 1ulRNA樣品7ul總體積50ul，42℃孵育60min。
3)PCR以β2M為內(nèi)參，引物見表1，反應(yīng)體系(總體積20ul)Taq MasterMix buffer(美國10ulInvitrogen公司)上游引物 0.5ul下游引物 0.5ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1ulH2O 8ul對于MDR-1、MRP-1、LRP-1、GST-pi的擴增程序95℃ 5min；95℃ 30s；60℃ 60s；72℃ 60s×30 cycles；72℃ 10min。
對β-微管蛋白亞型的擴增程序94℃ 10min；94℃ 30s；55℃ 60s；72℃ 90s×30 cycles；72℃ 10min。
4)電泳a)配制50×TAE242g Tris、57.1ml冰乙酸、100ml 0.5mol/L EDTA(PH 8.0)、加水至總體積1000ml。取10ml、加水至總體積達500ml，即1×TAE，備用。
b)制取1.5％瓊脂糖凝膠稱取agarose 1.5g，加1×TAE 100ml，微波爐加熱至沸，加入3～5ul溴化乙啶，混勻，倒入電泳槽中，放涼后取出電泳梳。
c)點樣(10ul/孔)后，120V/cm電泳10min，紫外燈下觀察結(jié)果。
5)結(jié)果掃描和分析電泳結(jié)束后、把瓊脂糖凝膠置入JS-380自動凝膠圖像分析儀(上海培清科技有限公司)的暗箱中，用gel scan系統(tǒng)掃描。使用QCapturePro軟件分析掃描結(jié)果。
(2)蛋白水平測定已知耐藥基因相關(guān)蛋白表達(Western Blot免疫印跡方法)所用試劑10×TBS(1L)Tris堿24.2gNaCl 80g鹽酸調(diào)PH值至7.65×Tris-甘氨酸電泳緩 Tris堿15.1g沖液甘氨酸94g10％SDS 50ml補充水至1000ml轉(zhuǎn)移緩沖液(終濃度) Tris堿25mM甘氨酸(PH 8.5)0.2M甲醇 20％洗滌緩沖液 1×TBS、0.1％Tween-20(TBST)封閉緩沖液 1×TBS、0.1％Tween-205％(w/v)脫脂牛奶1)抗原蛋白的提取a)培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期(約80％)，0.25％胰酶消化離心收集，PBS洗滌2次。
b)冰水浴中加入laemmli裂解液(美國Bio-Rad公司)(100ul/106個細(xì)胞)。
c)99℃，煮沸10min。
d)4℃，10000g 10min。樣品放入冰水浴中。
e)加入2-巰基乙醇(5％(v/v))，4℃4000g 10min，-20℃保存。
f)按照BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)操作規(guī)程進行樣品濃度測定。
2)電泳
a)SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制先灌分離膠，待分離膠完全聚合后(20-30min)，再灌注積層膠。
Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠配方溶液成分10ml凝膠中各成分所需體積(ml)(2塊膠)水 4.630％丙烯酰胺溶液2.71.5mol/L Tris(PH8.8)2.510％SDS 0.110％過硫酸胺0.1TEMED 0.006溶液成分4ml凝膠中各成分所需體積(ml)(2塊膠)水 2.730％丙烯酰胺溶液0.671.5mol/L Tris(PH8.8)0.510％SDS 0.0410％過硫酸胺0.04TEMED 0.004(灌膠前加)b)加樣。上樣量為40～60ug/泳道，分子量Marker 3ul。
c)電泳。電壓為8V/cm，當(dāng)染料前沿進入分離膠后，電壓提高到10V/cm，直至溴酚蘭到達分離膠底部，關(guān)閉電源。
3)蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。
a)轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和PVDF膜，將PVDF膜鋪在凝膠上，排盡氣泡。
b)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕)，將凝膠夾在中間、保持濕潤和沒有氣泡。
c)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
d)將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。
e)接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移，100V 16℃ 2h。
f)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
4)PVDF膜的封閉和抗體孵育a)取下PVDF膜，做好標(biāo)記，1×TBST洗滌，5min×1次。
b)放入5％脫脂牛奶(1×TBST，0.5％TWEEN-20)封閉1h。
c)1×TBST洗滌，5min×3次。
d)PVDF膜放入塑料袋內(nèi)，加入封閉液和適量的一抗(0.1/ml)，封袋口。
e)PVDF膜，平置于搖床，4℃過夜，或室溫孵育1h。
f)1×TBST洗滌，5min×3次。
g)加入二抗，室溫孵育1h。
h)1×TBST洗滌，5min×3次。
5)檢測蛋白表達a)加入化學(xué)熒光劑ECL(Pierce)，室溫孵育5min。
b)暗室里，膠片曝光顯象。
(二)結(jié)果1.建立了具有高耐藥指數(shù)的SKOV3耐紫杉醇耐藥細(xì)胞系，SK-TR30和SK-TR2500。
采用小劑量濃度遞增間歇誘導(dǎo)和大劑量沖擊誘導(dǎo)法對SKOV3細(xì)胞進行體外誘導(dǎo)，分別歷時12個月和18個月獲得2種耐藥細(xì)胞系，分別為SK-TR30、SKOV3-TR2500，見表2，圖3。
2.SKOV3及其耐藥細(xì)胞生物學(xué)特性比較(1)細(xì)胞形態(tài)觀察SKOV3細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞均貼壁生長。光鏡下SKOV3細(xì)胞成短梭形、上皮樣生長、邊界清楚、折光性好。SKOV3細(xì)胞在誘導(dǎo)過程中可見明顯的形態(tài)學(xué)改變細(xì)胞體膨脹、伸出許多不規(guī)則樹突狀分支、整體呈蜘蛛狀或星狀、胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡狀顆粒；給藥24～72h內(nèi)最明顯，96h～120h后逐漸恢復(fù)原狀。耐藥細(xì)胞的形態(tài)與原株細(xì)胞之間無明顯差異，見圖4。
(2)細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞群體倍增時間耐藥株細(xì)胞生長速度明顯延遲，細(xì)胞群體倍增時間隨誘導(dǎo)藥物濃度的增加而增加。耐藥細(xì)胞株群體倍增時間Td約為原代細(xì)胞株的1.2～3.4倍，經(jīng)t檢驗，差異有顯著性意義(p＜0.05)見表3以及圖5所示。
(3)細(xì)胞生長周期耐藥株細(xì)胞各期細(xì)胞比例與母細(xì)胞株相比，G0/G1期延長(p＜0.01)、S期縮短(p＜0.01)；SK-TR2500的G2/M期縮短(p＜0.05)，見表4，圖6。
(4)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)SKOV3、SK-TR30和SK-TR2500細(xì)胞在光鏡下觀察到耐藥細(xì)胞的胞漿較原代細(xì)胞豐富。此外SK-TR30細(xì)胞形態(tài)改變較明顯細(xì)胞呈多形性、邊界模糊。通過電鏡觀察進一步了解耐藥細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。
低倍(×8000)電鏡SKOV3細(xì)胞細(xì)胞間隙窄、細(xì)胞膜光滑、染色質(zhì)呈團塊聚集。耐藥細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)外間隙增寬、有空泡樣改變、細(xì)胞壁皺褶、染色質(zhì)均勻分散。
高倍(×22000)電鏡同SKOV3細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞的線粒體數(shù)量增多、體積增大、并伴有嵴的缺失。耐藥細(xì)胞最顯著的差異是在細(xì)胞表面附近出現(xiàn)很多囊泡樣結(jié)構(gòu)，它們有類似細(xì)胞膜的雙層膜樣結(jié)構(gòu)，有些是空的，有些內(nèi)有細(xì)胞質(zhì)樣組織。而原株細(xì)胞中基本觀察不到類似結(jié)構(gòu)。電鏡還觀察到耐藥細(xì)胞膜以及核膜的雙層結(jié)構(gòu)粗糙或中斷、出現(xiàn)胞膜內(nèi)陷形成瓶頸樣改變，見圖7-12。
3.卵巢癌化療敏感細(xì)胞SKOV3、A2780(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科李力教授提供)和耐紫杉醇耐藥細(xì)胞SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科李力教授提供)的耐藥相關(guān)基因的檢測RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖13-14。經(jīng)凝膠成像分析，所獲結(jié)果見表5.
1)MDR-1在SKOV3、A2780中不表達或表達量很低，在SK-TR30、A2780-TR中表達顯著增高，在SK-TR2500中表達量低；2)MRP-1在SKOV3、A2780、A2780-TR中不表達，在SK-TR30，SK-TR2500中低表達；3)LRP-1、GST-pi在所有實驗細(xì)胞中表達，并且表達量無明顯改變；4)微管蛋白-βI在SK-TR2500、A2780-TR中表達量提高1倍；5)微管蛋白-βII在所有實驗細(xì)胞中表達量無明顯改變；6)微管蛋白-βIII在A2780-TR中表達量提高1.77倍；7)微管蛋白-βIVa在SK-TR2500、A2780-TR中表達提高約1倍；8)微管蛋白-βIVb在SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR中表達提高約1倍；4.卵巢癌化療敏感細(xì)胞SKOV3、A2780和耐紫杉醇耐藥細(xì)胞SK-TR30、SK-TR2500、A2789-TR的耐藥相關(guān)蛋白的檢測因為無法獲得β-微管蛋白亞型對應(yīng)的抗體，只進行了MDR-1，LRP-1，MRP-1，GST-pi的蛋白表達檢測。
Western結(jié)果總結(jié)1)蛋白MDR-1在SKOV3中不表達，在SK-TR2500中表達量低，在SK-TR30中表達顯著增高；在A2780胞中表達量低，在A2780-TR中表達顯著增高，見圖15。
2)MRP-1的蛋白表達在各細(xì)胞中未檢測到。LRP-1、GST-pi蛋白在各實驗細(xì)胞中表達無差異。
(三)結(jié)論采用小劑量濃度遞增間歇誘導(dǎo)建立的紫杉醇耐藥細(xì)胞株SK-TR30，耐藥指數(shù)為622.76±71.37；采用大劑量沖擊誘導(dǎo)建立的紫杉醇耐藥細(xì)胞株SK-TR2500，耐藥指數(shù)為261.98±32.89；獲購的紫杉醇耐藥細(xì)胞株A2780-TR，耐藥指數(shù)為7.97±0.95。有關(guān)耐藥基因的檢測結(jié)果表明，SK-TR30、A2780-TR有MDR-1的高表達，但SK-TR2500的MDR-1呈低表達；MRP-1、LRP-1、GST-pi在耐藥細(xì)胞株表達無明顯差異；I、III、IVb、IVa四種β-微管蛋白亞型在耐藥細(xì)胞中表達增高。采用大劑量沖擊誘導(dǎo)法建立的紫杉醇耐藥細(xì)胞株SK-TR2500的耐藥指數(shù)低于小劑量誘導(dǎo)法建立的紫杉醇耐藥細(xì)胞株SK-TR30，但其耐藥誘導(dǎo)過程與臨床化療過程接近，從而為研究紫杉醇耐藥機制建立了一種良好的體外模型。
二、卵巢癌紫杉醇化療敏感與化療耐藥細(xì)胞株的比較蛋白質(zhì)組分析研究(一)實驗方法1.細(xì)胞總蛋白的制備細(xì)胞裂解液配方Tris(40mM)48.4mg尿素(urea)(7M)4.204g硫脲(thiourea)(2M)1.522g4％CHAPS 0.4g1％二硫蘇糖醇(DTT)(20mM) 0.1g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(1mM) 3.72mg加蒸餾水至10ml(1)細(xì)胞總蛋白的提取1)培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期(約80％)，0.25％胰酶消化離心收集。
2)冰PBS洗滌，1000g，2×10min，棄上清。
(以下均在冰水浴中操作)3)加入細(xì)胞裂解液(150ul/107)，冰水浴30min。
4)液氮反復(fù)凍融3次。
5)超聲至透明，加入適量cocktail蛋白酶抑制劑(德國Roche公司)，5ul DNA酶、RNA酶(Sigma)，冰水浴30min。
6)離心4℃，12000-14000g，20-25分鐘。
7)收集上清，-80℃保存至進行2-DE(雙向凝膠電泳)。
(2)蛋白定量采用Bradford蛋白定量試劑(美國Bio-Rad公司)進行蛋白定量。
1)按照下表配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為BSA 2mg/ml，

2)取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液以及各待測樣品和空白對照(裂解液)溶液各2ul加入裝有998ul雙蒸水的EP管中，混勻后，各取800ul溶液加入新的EP管內(nèi)。
3)每個EP管內(nèi)加入200ul工作液(dye reagent concentrate)溶液，混勻，上機測定。
4)設(shè)定波長595nm，分別設(shè)定空白對照，同時測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白和樣品的吸收值。
5)以吸收值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中的蛋白質(zhì)含量。
2.雙向凝膠電泳(2-DE)2-DE各種溶液配方(1)平衡液Tris(1.5mol/L PH8.8)3.35ml尿素(urea) 36.04g87％甘油(glycerol) 30ml十二烷基硫酸鈉(SDS) 2g溴酚蘭 微量加蒸餾水至 100ml試管D1，D2，E1，E2分別取上述溶液8ml平衡液AD1，D2中加入二硫蘇糖醇(DTT)160ul(使用前加)。
平衡液BE1，E2中加入碘乙酰胺(iodacetamide)2.5％u/v 0.18g(使用前加)。
(2)水化液尿素(urea)2.4gCHAPS 0.1g溴酚蘭微量加蒸餾水至5ml(3)T＝13％凝膠溶液溶液 體積超純水11.85ml
30％丙烯酰胺/0.8％甲叉17.34mlTris(1.5mol/L PH8.8) 10ml10％SDS 400ul10％APSw/v(用前加)400ulTEMED(用前加) 16ul總體積40ml(4)0.5％瓊脂糖封膠溶液電泳緩沖液100ul瓊脂糖0.5g溴酚蘭微量(5)5×電泳緩沖液(Tris-甘氨酸-SDS)Trisbase 3.25g甘氨酸18gSDS 1.25g加水至250ml(6)固定液乙醇 100ml冰醋酸25ml加水至250ml(7)考染固定液乙醇 100ml冰醋酸25ml加水至250ml0.05％考馬斯蘭R-350(w/v)(8)考染脫色液乙酸 8ml乙醇 25ml加水至100ml(9)考馬斯蘭染色液
0.05％考馬斯蘭R-350(w/v)考馬斯蘭R-350(Amersham Pharmacia)1片加入1600ml雙蒸水，待完全溶解后過濾。
(1)第一向固相PH梯度等電聚焦電泳1)細(xì)胞總蛋白提取物(1mg)與重泡脹液(8mol/L urea+4％CHAPS+20mmol/L DTT+0.5％ IPG buffer Ph3-10NL+痕量溴酚藍)充分混合，總體積350ul。
2)將樣品加入IPGstrip持膠槽。
3)從酸性端小心揭去IPG干膠條(英國Amersham Biosciences公司)保護膜，膠面向下置于膠槽內(nèi)，前后移動膠條排除氣泡并使膠條與兩極接觸。
4)取1ml覆蓋油(mineral oil)覆蓋膠條，蓋好持膠槽蓋子。
5)數(shù)個膠槽平行放置于IPGphor等電聚焦儀(AmershamBiosciences)的電板上；重泡脹和聚焦在20℃自動進行，總電壓是60000-80000Vh。
等電聚焦參數(shù)如下步驟進行

(2)平衡1)將IPG膠條放入加有平衡液A(10ml/strip)的試管中，封管口，平放搖床，輕微振蕩15min。
2)將IPG膠條放入加有平衡液B(10ml/strip)的試管中，封管口，平放搖床，輕微振蕩15min。
(3)第二向垂直平板SDS-PAGE電泳1)安裝好灌膠裝置，配置13％聚丙烯酰胺凝膠溶液，灌制1.5mm厚的線性梯度膠。灌后立即依次用無水乙醇，去離子水封壓。
2)室溫放置4小時，除去表面水并用濾紙吸干水分。
3)將平衡好的IPG膠條置于PAGE凝膠頂端，輕輕擠壓膠條使其緊貼膠面。
4)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Mark上于堿性端，3-5ul/塊膠。
5)排凈氣泡后用含溴酚蘭的0.5％瓊脂糖封固。
6)接通電源，16℃循環(huán)水恒溫冷卻。電流設(shè)置初始恒流為20mA/2塊膠，40min后換用40mA/2塊膠，直至溴酚蘭前沿抵玻璃板下緣時停止電泳。
(4)考馬斯蘭染色1)小心取下凝膠板放入考染固定液(350ml/盒)中，水平搖床上輕微振蕩30min。
2)雙蒸水洗滌3次，每次5min。
3)凝膠板放入加熱的考馬斯蘭染液(勿煮沸)中，完全沒入，輕微振蕩染色10min。
4)傾去染色液，放入脫色液，完全覆蓋凝膠。
5)水平搖床上脫色，室溫過夜，直至蛋白質(zhì)點清晰為止，期間可以多次更換脫色液。
6)雙蒸水洗滌3次，每次5min。
3.凝膠掃描和圖像分析經(jīng)過染色的凝膠應(yīng)用Labscan5掃描儀(Amersham Biosciences)進行圖像掃描。參數(shù)設(shè)置分辨率300dpi，8位灰度值，以TIF文件格式儲存。使用ImageMaster 2-DElite 3.0 software(Aersham Biosciences)專用軟件進行分析步驟參照廠商說明書進行。主要步驟為1)圖像修飾2)點的識別
3)點的編輯4)背景扣除5)斑點匹配6)標(biāo)準(zhǔn)化7)圖形化分析蛋白質(zhì)的量被定義為構(gòu)成這個斑點的所有像素值的總和。為了較準(zhǔn)確反映蛋白質(zhì)斑點量的變化，將每個點的含量表示為相對百分含量(％Vol)，也就是一個蛋白質(zhì)斑點的像素值占整個凝膠內(nèi)所有蛋白質(zhì)斑點像素值的百分?jǐn)?shù)。斑點位置的重復(fù)性按Corbett[Corbett JM，et al.Electrophoresis.1994；151205-1211.]等的方法進行計算。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析在SPSS for Windows 11.5軟件上進行。
4.考染膠內(nèi)蛋白點酶切和質(zhì)譜樣品的制備(1)脫色切割考染凝膠中的蛋白點，放入盛有200ul超純水的EP管中。用超純水清洗幾次后，加入含50％乙腈的100mM NH4HCO3脫色液50-100ul浸泡膠粒。振蕩20分鐘，棄去溶液。重復(fù)2-3次至膠中的藍色褪盡(2)酶解脫色后的膠粒真空干燥30min使其完全脫水，體積縮小。加入3-10ul酶液，4℃，20-30min。吸出多余的酶液。加入5-10ul 25mM NH4HCO3，密封樣品管超聲1-2min，置于37℃水浴＞12h.
(3)肽提取和干燥將步驟2)的樣品，離心吸出上清液置于新的EP管中。膠中加入5ul的5％TFA。密封管口后超聲1-2分鐘。37℃保溫1hr。離心后吸出上清液。加入適量ACN，室溫放置，待膠粒脫水變白，吸取，合并上清液，冰凍干燥。
5.質(zhì)譜分析制備好的樣品置于ProFlexTMIII MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀上進行分析。采用線性模式，正離子譜測定，離子源加速電壓20kV，N2激光波長為337nm，脈沖寬度為3ns，離子延遲提取500ns，真空度4×10-7Torr，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次，并用基質(zhì)峰和胰蛋白酶自動降解離子峰作為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜峰，獲得肽質(zhì)量指紋圖。
6.數(shù)據(jù)庫查詢通過Mascot軟件(http//www.matrixcience.com)查詢Swiss-prot或NCBInr數(shù)據(jù)庫資料。查詢條件查詢類型肽質(zhì)量指紋圖譜酶 胰酶固定修飾無可變修飾脲甲基化和氧化作用質(zhì)量值 單一同位素的蛋白質(zhì)分子量不限肽質(zhì)量誤差 ±100ppm肽電荷狀態(tài) 陽離子不完全裂解位點 1肽質(zhì)指紋圖中的肽片段質(zhì)量控制在＜100ppm，酶解片段不完全選擇為1個。物種來源選擇人類。最少匹配片段數(shù)規(guī)定為5。蛋氨酸氧化和半胱氨酸脲甲基的修飾均被考慮到。
7.差異蛋白質(zhì)點的鑒定(Western Blot)方法詳見實驗一部分。
(二)、結(jié)果1人卵巢癌化療敏感細(xì)胞系SKOV3，A2780和耐紫杉醇耐藥細(xì)胞系SK-TR2500，SK-TR30，A2780-TR細(xì)胞總蛋白的雙向凝膠電泳圖譜分析。為了保證雙向電泳的可比性，分別以SKOV3和SK-TR30，SKOV3和SK-TR2500，A2780和A2780-TR分組進行平行實驗，并在相同條件下對各組的總蛋白樣品重復(fù)試驗3次以上。結(jié)果表明(1)同一樣品雙向電泳圖譜重復(fù)性較好，平均匹配率是80-85％；從肉眼觀察發(fā)現(xiàn)同一樣品的3次雙向電泳圖譜非常相似，以pI 4-8和Mr 15-70kD范圍的蛋白斑點分布最多。因為選用PH3-10NL固相IPG干膠條，使PH4-7之間的蛋白點得以充分分離，有利于以后的圖譜分析和鑒定(見圖18，19)。每張圖譜檢測到斑點數(shù)量約為1003±111.5個。同一細(xì)胞樣品選擇3塊膠的圖譜，以其中一塊膠為參考進行3塊膠間的斑點匹配，平均匹配的點數(shù)為892，平均匹配率為80-85％，而且同一蛋白質(zhì)點的濃度無顯著差別。
(2).卵巢癌化療敏感細(xì)胞與耐藥細(xì)胞蛋白表達的差異將實驗細(xì)胞按化療敏感細(xì)胞與紫杉醇耐藥細(xì)胞分為2-3組，分別為SKOV3與SK-TR2500和/或SK-TR30，A2780與A2780-TR。在雙向凝膠電泳的重復(fù)性得到保障下，分別比較了幾組細(xì)胞的雙向電泳圖譜。應(yīng)用ImageMaster 2-D Elite 3.0 software專用分析軟件對3組2-DE圖譜的蛋白質(zhì)點表達量化，通過比較，選取濃度升高或降低＞2倍的蛋白質(zhì)點22個，進行質(zhì)譜分析。
2.MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析結(jié)果將22個2-DE差異蛋白質(zhì)點經(jīng)切割，脫色，還原，烷基化，胰酶酶解，萃取，脫鹽后，用MALDI-TOF-MS并以基質(zhì)峰，酶自動降解片段進行校正，測定各自的肽質(zhì)指紋圖譜(PMF)，如圖22為SK-TR30雙向電泳圖譜中69號蛋白質(zhì)點(cofilin1)的肽質(zhì)指紋圖。22個點中獲得了21張肽質(zhì)指紋圖譜，其中部分質(zhì)譜圖的質(zhì)量較高(峰信號較強，以1000-2500間的片段峰較多，酶自動降解峰很明顯)；部分PMF的肽片段峰信號較弱，且1000-2500間的片段峰較少；另有1個蛋白點未獲得肽質(zhì)量指紋圖譜。通過MASCOT查詢軟件應(yīng)用MALDI-TOF-MS-PMF數(shù)據(jù)在限制相應(yīng)的查詢條件下搜索SWISS-PORT，將查詢結(jié)果結(jié)合雙向凝膠電泳相應(yīng)點的表觀等電點，分子量，匹配肽段的多少(5個片段以上)和覆蓋率(＞15％)等綜合分析，在獲得的21張肽質(zhì)指紋圖數(shù)據(jù)中的搜索結(jié)果有3種①沒有匹配數(shù)據(jù)庫中任何記錄，有2個；②匹配到數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)，蛋白只有其部分序列被測定，尚需進一步鑒定，該種情況有2個；③在數(shù)據(jù)庫中匹配到符合結(jié)果要求的已知蛋白質(zhì)有16個(另有1蛋白點為角蛋白，未列入本表)，見圖16-21，表6-7。這些蛋白分別與細(xì)胞骨架，氧化反應(yīng)，調(diào)節(jié)代謝，細(xì)胞調(diào)亡和蛋白酶的合成代謝相關(guān)。
3.差異蛋白質(zhì)點的鑒定用Western免疫印跡方法對3種耐藥細(xì)胞中共同上調(diào)蛋白cofilin1進行了檢測。因為蛋白cofilin1在細(xì)胞內(nèi)是以去磷酸化的形式被活化并發(fā)揮作用，所以我們同時檢測了磷酸化cofilin(phospho-cofilin)表達以反映細(xì)胞內(nèi)去磷酸化cofilin。見圖23，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白總cofilin1在敏感和耐藥細(xì)胞中表達無差異，但是磷酸化cofilin在耐藥細(xì)胞中表達明顯上調(diào)。
(三)、結(jié)論應(yīng)用雙向電泳技術(shù)，成功制備了卵巢癌化療敏感細(xì)胞株SKOV3、A2780和卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR蛋白質(zhì)表達圖譜。經(jīng)比較蛋白質(zhì)組分析，共發(fā)現(xiàn)16個差異表達2倍以上的蛋白點，其中蛋白質(zhì)cofilin1，destrin，prohibitin，hsp27，proteasome、Lasp-1、TCP-1、stathmin、SOD2等上調(diào)，Annexin家族蛋白、peroxiredoxin 6蛋白下調(diào)。質(zhì)譜鑒定的結(jié)果表明它們分別與細(xì)胞骨架，氧化反應(yīng)，調(diào)節(jié)代謝，細(xì)胞調(diào)亡和蛋白酶的合成代謝相關(guān)。其中cofilin1和destrin的表達上調(diào)為所有耐藥細(xì)胞株共有，提示cofilin1和destrin可能為卵巢癌紫杉醇耐藥標(biāo)記候選蛋白三、卵巢癌紫杉醇化療耐藥相關(guān)候選蛋白cofilin1的功能研究(一)實驗方法LB培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5gNaCL 10g搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用5M NaOH調(diào)節(jié)PH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L，在15lbf/in2(1.034×105Pa)，高壓下蒸氣滅菌20min。高壓完，置于4℃冰箱保存。
LB瓊脂糖培養(yǎng)基(1.5％)LB培養(yǎng)基200ml瓊脂糖 3g
上述配方放入500ml錐形瓶，用鋁箔紙封口，在15lbf/in2(1.034×105Pa)，高壓下蒸氣滅菌20min，從高壓滅菌器中取出培養(yǎng)基輕輕旋動以使溶解的瓊脂或瓊脂糖能均勻分布一)構(gòu)建含cofilin1(COF1)目的基因正義序列的質(zhì)粒(pcDNA-cof)1.提取cofilin 1(COF1)目的基因(1)細(xì)胞總RNA的提取所用細(xì)胞SK-TR30細(xì)胞詳細(xì)步驟見實驗2部分(2)RT-PCR提取目的基因1)從GeneBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中查詢cofilin 1編碼區(qū)(500bp)(gi|49472823)，設(shè)計并合成引物(上海搏亞生物技術(shù)有限公司)5’端引物5’aacta gctagc atg gcc tcc ggt gtg gct gtc3’，3’引物5’g gaat tca caa agg ctt gcc ctc cag3’，并分別在5’，3’端加入NheI，EcoRI酶切位點。
2)以Titan One Tube RT-PCR Kit試劑盒(Roche)進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA和PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件50℃逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，94℃變性2分鐘后進入循環(huán)，前10個循環(huán)94℃變性30秒，56℃退火30秒，68℃延伸45秒；后25個循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸45秒；35個循環(huán)后68℃延伸7分鐘。
3)PCR產(chǎn)物COF1經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，將凝膠放入JS-380自動凝膠圖像分析儀，使用QCapturePro軟件進行PCR條帶光密度掃描，參照DNA markerDL2000(TaKaRa)，在500bp位置檢測到產(chǎn)物片斷。
2.PCR產(chǎn)物回收1)用DNA Fragment Purification Kit 2.0(20次量)試劑盒(TaKaRa)進行PCR產(chǎn)物回收。
2)回收產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，將凝膠放入JS-380自動凝膠圖像分析儀，使用QCapturePro軟件進行PCR條帶光密度掃描，參照DNA markerDL2000，在500bp位置檢測到產(chǎn)物片斷。
3.COF1基因片斷和載體(pcDNA3.1(+))的雙酶切
1)選用EcoRI，NheI(Roche公司)分別將COF1的PCR擴增產(chǎn)物和載體pcDNA3.1(+)(圖24)(Invitrogen)進行雙酶切。
反應(yīng)體系25μlDNA ＜1μg10×M buffer 2.5μlEcoRI(TaKaRa)1μlNheI(TaKaRa) 1μl去離子水 補足25μl37℃水浴，3小時2)全部酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠回收試劑盒(Invitrogen)分別進行凝膠回收。
3)分別測定回收后產(chǎn)物的濃度4.COF1和pcDNA3.1(+)的連接反應(yīng)體系10μlT4連接酶(TaKaRa)1μl10×buffer 1μlpcDNA3.1(+) 0.2-1.2μlCOF1 DNA 補足10μl16℃水浴，過夜5.制備感受態(tài)細(xì)胞(氯化鈣重懸法)1)取大腸桿菌DH5α原菌液(-80℃保存)100μl加入5ml LB，200g，37℃溫育12-16h。
2)取上述菌液100μl加入5ml LB中，250g，37℃溫育3小時，每隔20-30s，監(jiān)測OD600。
3)將菌液轉(zhuǎn)移至一無菌，用冰預(yù)冷的離心管中，冰浴10min。
4)4℃，4000g，離心10min。
5)棄凈上清，用預(yù)冷的0.1moL CaCl25ml重懸細(xì)菌，冰浴30min。
6)4℃，4000g，10min。
7)按每50mL初始培養(yǎng)液用2mL預(yù)冷的0.1mol CaCl2重懸細(xì)菌，將細(xì)菌分裝成小份，加入15％甘油，-70℃保存。
6.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和收獲1)50-200μl感受態(tài)細(xì)胞加入10μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min。
2)EP管放入預(yù)加溫到42℃的循環(huán)水浴中，恰恰放置90s，不要搖動EP管3)取出EP管迅速放入冰浴中冷卻1-2min。加入150μlLB/管培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至37℃搖床上，100g，溫育45分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇。
4)將適當(dāng)體積(每個90mm平板上200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞分別加到到含氨芐100μg/mL的LB瓊脂培養(yǎng)基上，用一無菌的彎頭玻棒輕輕將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂勻。
5)將平板置于室溫直至液體完全吸收。
6)倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12-16小時后出現(xiàn)菌落。
7)每塊平板分別挑取6個單菌落，分別接入5mL含100μg/ml氨芐的LB加入10ml。通氣良好的試管中，于37℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。
8)將1.5ml培養(yǎng)物導(dǎo)入微量離心管中，4℃，12000g，30s，剩余的培養(yǎng)物儲存4℃。
9)吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌盡可能干燥。
7.質(zhì)粒提取選用Qiagen質(zhì)粒小提取試劑盒1)將3-5ml菌液離心，棄凈上清，加入0.3ml PI溶液(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(PH8.0)，10mmol/L EDTA(PH 8.0)，RNA酶)，充分混勻2)加入0.3ml PII溶液(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，溫和混勻，室溫放置5min，期間上下翻轉(zhuǎn)4-6次。
3)加入冰預(yù)冷的PIII溶液(5mol/L乙酸鉀60mL，冰醋酸11.5mL，水28.5mL)，立即混勻，冰浴5min，期間上下翻轉(zhuǎn)4-6次。
4)4℃，13000rpm離心10min。
5)取上清，再次4℃，13000rpm離心10min。
6)吸取上清加入預(yù)先用1mL QBT平衡過的Qiagen-tip20中，注意不要將沉淀吸入。
7)用QC 1mL洗滌Qiagen-tip20 4次。
8)0.8mLQF加入Qiagen-tip20，其下用干凈的EP管接收流出的液體。
9)向EP管中加入0.56mL異丙醇(0.7終體積)，13000rpm/min，離心30min。10)小心吸盡上清，加入1mL75％酒精，9000rpm/min，離心10min吸盡上清，室溫干燥5min。
11)加入10μl TE完全溶解核酸沉淀。得到含cofilin1(COF1)目的基因正義序列的質(zhì)粒pcDNA-cof。
12)測定質(zhì)粒的濃度。
8.質(zhì)粒鑒定1)電泳鑒定所有提取質(zhì)粒各取3μl，以空載體pcDNA3.1(+)為對照，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，將凝膠放入JS-380自動凝膠圖像分析儀，使用QCapturePro軟件進行PCR條帶光密度掃描，參照DNA markerDL15000，選取電泳速度慢于對照的質(zhì)粒進行下一步的雙酶切2)EcoRI，NheI(TaKaRa公司)雙酶切鑒定反應(yīng)體系20μl，同前述。
酶切產(chǎn)物全部經(jīng)經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，將凝膠放入JS-380自動凝膠圖像分析儀，使用QCapturePro軟件進行PCR條帶光密度掃描，參照DNA markerDL15000，選取分別在500bp，4000bp出現(xiàn)片段的質(zhì)粒，各取100ul菌液進行測序。測序公司華大中生科技發(fā)展有限公司。
二)構(gòu)建含cofilin1(COF1)目的基因反義序列的質(zhì)粒(pcDNA-antisense-cof)1.PCR擴增cofilin 1目的基因1)質(zhì)粒pRKcof的轉(zhuǎn)化，收獲和提取(實驗步驟見前)。
2)測定質(zhì)粒濃度。
3)高保真酶PCR擴增cofilin 1目的基因。
引物如前述，以質(zhì)粒pRKcof(由德國馬普學(xué)會精神病學(xué)研究所TheoRein教授饋贈)為DNA模板
50μl反應(yīng)體系Pfu DNA Polymerase(美國5μlPromega公司)Pfu DNA Polumerase 10×1.25μ/50μlbufferdNTPmix(200μM終濃度)1μl上游引物 1μl下游引物 1μlDNA模板 ＜0.5μg/50μl去離子水 補足到50μl2.PCR產(chǎn)物回收實驗步驟與前相同3.COF1基因片斷和載體(pcDNA3.1(+))的雙酶切選用BamHI，XhoI(TaKaRa公司)進行雙酶切；其余步驟，包括連接，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，收獲，提取和鑒定均同前實驗。
測序公司華大中生科技發(fā)展有限公司。
三)細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.取前述實驗中得到的測序結(jié)果完全符合的質(zhì)粒(pcDNA-cof，pcDNA-antisense-cof)和pEGFP-cof(英國愛丁堡大學(xué)Sutherland K.Maciver教授饋贈)進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，收獲和提取，實驗方法見前。
2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，pcDNA-cof，PRK-cof，pEGFP-cof細(xì)胞SKOV3，A2780，SK-TR30，SK-TR2500，A-TS細(xì)胞1)培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期(約80％)，0.25％胰酶消化離心收集。
2)轉(zhuǎn)染前一天，在不包含抗生素的適量DMEM(HG)或1640培養(yǎng)基中接種細(xì)胞(0.5-2×105cell/500μl)到24孔板，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞的匯合度要達到90-95％。
3)每一個轉(zhuǎn)染樣品都要按照如下的方法準(zhǔn)備DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物a.50ulOpti-MEMI(Invitrogen)低血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，輕輕混勻。
b.使用前輕輕混合Lipofectamine 2000(Invitrogen)，然后加入50ulOpti-MEMI低血清培養(yǎng)基中稀釋，輕輕混勻后在室溫下孵育5min。
c.孵育5min后，混合稀釋的DNA和稀釋的Lipofectamine 2000，輕輕混合，在室溫下孵育20min。
4)將DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物加入到每一個包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合。
5)37℃，CO2培養(yǎng)箱孵育18-48小時，直到收獲細(xì)胞進行實驗。在轉(zhuǎn)染后6小時改換培養(yǎng)基。
6)瞬時轉(zhuǎn)染檢測轉(zhuǎn)染效率。
a.熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，攝像，計算轉(zhuǎn)染效率。
b.收獲瞬時轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，Western免疫印跡方法檢測轉(zhuǎn)染效率，調(diào)整DNA和Lipofectamine 2000用量。
四)篩選穩(wěn)定表達目的基因的單細(xì)胞克隆1.按前述實驗方法進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
2.G418篩選穩(wěn)定表達目的基因的細(xì)胞克隆。
1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，0.25％胰酶消化，收集細(xì)胞，按照1∶6-10的比例重新接種在新的6孔板內(nèi)。次日，換成不同濃度的G418培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)(37℃，5％CO2)培養(yǎng)10-14天。下表給出不同細(xì)胞對應(yīng)的G418濃度

2)當(dāng)光鏡下觀察到單個細(xì)胞長成細(xì)胞克隆時，顯微鏡下挑取細(xì)胞克隆(條件單個，孤立，約有500-1000個細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)均一)約20-40個，分別接種到24孔板孔內(nèi)，以后的培養(yǎng)均用含G418(200ug/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
3)待細(xì)胞在24孔板內(nèi)生長至對數(shù)生長期(約80％)時，0.25％胰酶消化細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
4)待細(xì)胞在6孔板內(nèi)生長至對數(shù)生長期(約80％)時，0.25％胰酶消化，收集，凍存細(xì)胞；并留少量細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)進行實驗。
5)細(xì)胞至對數(shù)生長期時，0.25％胰酶消化，收獲細(xì)胞。
3.檢測細(xì)胞內(nèi)cofilin1蛋白的表達。
鑒定方法Western印跡法。(具體實驗步驟見實驗一部分)五)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的耐藥指數(shù)的測定分別選取cofilin1蛋白表達量最高的SKOV3和A2780轉(zhuǎn)染細(xì)胞亞群，cofilin1蛋白表達量最低的SK-TR30，SK-TR2500，A-TS轉(zhuǎn)染細(xì)胞亞群各2-3個，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期(約80％)時，消化收集細(xì)胞。分別以轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的細(xì)胞為參照，測定相應(yīng)細(xì)胞的耐藥指數(shù)(resistant index，RI)-MTT法(具體實驗步驟見實驗一部分)。
(二)結(jié)果1.RT-PCR擴增產(chǎn)物鑒定SK-TR30細(xì)胞總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄以及PCR擴增，反應(yīng)產(chǎn)物有瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示在分子量為500bp左右有單一清晰的DNA條帶，與原設(shè)計產(chǎn)物分子量大小相符。
2.正、反義載體pcDNA-cof，pcDNA-antisense-cof的構(gòu)建、篩選和鑒定(1)正義載體pcDNA-cof的構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增產(chǎn)物500bp的cofilin1片段和載體pc-DNA3.1(+)經(jīng)NheI，EcoRI位點酶切后，在T4連接酶作用下粘端連接(圖25)，cofilin1 cDNA正向插入序列載體pc-DNA3.1(+)中(見圖25，26)；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素(100ug/ml)的LB瓊脂糖培養(yǎng)皿中，獲重組質(zhì)粒產(chǎn)生的菌落，將菌落擴增并提取質(zhì)粒，樣品經(jīng)NheI和EcoRI完全酶切后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定顯示出兩條特異DNA條帶一條分子量與pc-DNA3.1(+)質(zhì)粒大小相符，另一條則與PCR擴增片段大小完全一致(見圖25)。結(jié)果表明PCR擴增產(chǎn)物帶有原設(shè)計引物中的酶切位點，此片段被克隆在pc-DNA3.1(+)的NheI和EcoRI位點上。
(2)反義載體pcDNA-antisense-cof的構(gòu)建質(zhì)粒PRKcof中cofilin1的PCR擴增產(chǎn)物和序列載體pc-DNA3.1(+)經(jīng)BamHI，XhoI位點酶切后，cofilin1序列反向克隆入序列載體pc-DNA3.1(+)中。將通過轉(zhuǎn)化和擴增的質(zhì)粒經(jīng)BamHI，XhoI雙酶切后電泳鑒定顯示出兩條特異DNA條帶一條分子量與pc-DNA3.1(+)質(zhì)粒大小相符，另一條則與PCR擴增片段大小完全一致(見圖27)。
(3)PCR擴增片段的DNA序列的測定1)pcDNA-cof被測片段全長498bp，包括了編碼cofilin1蛋白的全部核苷酸以及兩側(cè)的酶切位點，與原設(shè)計相符。證實了逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增產(chǎn)物為cofilin1。下面是cofilin1的核苷酸序列ATGGCCTCCGGTGTGGCTGTCTCTGATGGTGTCATCAAGGTGTTCAACGACATGAAGGTGCGTAAGTCTTCAACGCCAGAGGAGGTGAAGAAGCGCAAGAAGGCGGTGCTCTTCTGCCTGAGTGAGGACAAGAAGAACATCATCCTGGAGGAGGGCAAGGAGATCCTGGTGGGCGATGTGGGCCAGACTGTCGACGACCCCTACGCCACCTTTGTCAAGATGCTGCCAGATAAGGACTGCCGCTATGCCCTCTATGATGCAACCTATGAGACCAAGGAGAGCAAGAAGGAGGATCTGGTGTTTATCTTCTGGGCCCCCGAGTCTGCGCCCCTTAAGAGCAAAATGATTTATGCCAGCTCCAAGGACGCCATCAAGAAGAAGCTGACAGGGATCAAGCATGAATTGCAAGCAAACTGCTACGAGGAGGTCAAGGACCGCTGCACCCTGGCAGAGAAGCTGGGGGGCAGTGCCGTCATCTCCCTGGAGGGCAAGCCTTTGTGA(SEQ ID NO1)其氨基酸序列見SEQ ID NO2。
2)pcDNA-antisense-cof被測片段全長502bp，包括了反序列的cofilin1蛋白的全部核苷酸以及兩側(cè)的酶切位點，與原設(shè)計相符。證實了cofilin1被反向插入載體。
(4)PCR擴增片段的DNA序列的測定1)pcDNA-cof重組載體經(jīng)NheI和EcoRI雙酶切后電泳鑒定得到500bp條帶，與目的片段大小相符(圖28)。
2)pcDNA-antisense-cof重組載體經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后電泳鑒定得到500bp條帶，與目的片段大小相符(圖29)。
3.轉(zhuǎn)染結(jié)果以及cofilin表達效率1)在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下，通過瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-cof評價轉(zhuǎn)染效果，見圖30。SKOV3轉(zhuǎn)染效率為60％，A2780轉(zhuǎn)染效率為20％。
2).通過不同濃度的G418培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的卵巢癌化療敏感和耐藥細(xì)胞克隆，并通過western blot檢測cofilin1蛋白表達差異，見圖31。
4.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞耐藥性的改變1)卵巢癌化療敏感細(xì)胞SKOV3，A2780細(xì)胞，選取cofilin1蛋白表達量增高最明顯的克隆細(xì)胞以各自的原代細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的原代細(xì)胞為參照用MTT法進行耐藥指數(shù)測定。結(jié)果見表8，當(dāng)cofilin1表達量增高時，細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性增加；2)卵巢癌耐紫杉醇耐藥細(xì)胞SK-TR30，SK-TR2500，A2780-TR細(xì)胞，因為考慮轉(zhuǎn)染過程以及篩選過程可能會影響細(xì)胞的耐藥性，僅以轉(zhuǎn)染空載體的原代細(xì)胞為參照，參考原代細(xì)胞，選取cofilin1蛋白表達量降低最明顯的克隆細(xì)胞用MTT法進行耐藥指數(shù)測定。結(jié)果見表8，當(dāng)cofilin1表達受抑制時，細(xì)胞對紫杉醇耐藥性減弱。
(三)、結(jié)論利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)染正義質(zhì)粒pcDNA-cof后，卵巢癌敏感細(xì)胞SKOV3、A2780的cofilin1表達量上調(diào)，對紫杉醇耐藥性增加6-7倍(表8)；轉(zhuǎn)染反義質(zhì)粒pcDNA-antisense-cof后，卵巢癌耐藥細(xì)胞SK-TR30、SK-TR2500、A2780-TR的cofilin1表達量下調(diào)，對紫杉醇耐藥性下降3-4倍(表8)。結(jié)果表明cofilin1可能為卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥相關(guān)候選蛋白，提示actin骨架蛋白可能參與卵巢癌紫杉醇耐藥機制。
四、耐藥相關(guān)候選蛋白cofilin在卵巢上皮癌組織中表達的研究(一)實驗方法1.卵巢癌標(biāo)本收集收集2002年11月至2005年1月期間，在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科行卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)后病理證實為卵巢癌的患者46例。實驗分組，卵巢癌化療敏感組和卵巢癌化療耐藥組。入組標(biāo)準(zhǔn)1)病理診斷的原發(fā)性卵巢上皮癌。
2)卵巢癌化療敏感組經(jīng)過滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和規(guī)范化療后達到臨床完全緩解(CR)，持續(xù)時間＞6個月。
3)卵巢癌化療耐藥組經(jīng)過滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和規(guī)范化療后達到完全緩解(CR)，持續(xù)時間＜6個月；化療期間腫瘤的最好療效為PR、SD或PD者。
共收集卵巢癌化療敏感組織標(biāo)本24例和耐藥組織標(biāo)本22例，石蠟包埋形式保存，由北京協(xié)和醫(yī)院病理科協(xié)助提供。相應(yīng)患者的臨床資料見表9，10。
協(xié)和醫(yī)院病案室查閱化療敏感和耐藥共46例患者的病歷，按病理號找出全部的術(shù)中標(biāo)本切片，經(jīng)病理科大夫閱片后，挑選卵巢癌組織較大，無壞死及出血，以腫瘤實質(zhì)為主的切片，并尋找相應(yīng)的癌組織蠟塊用于免疫組化。
2.免疫組織化學(xué)染色1)將石蠟包埋腫瘤組織進行連續(xù)切片，厚度約4um。切下石蠟薄片后，順次經(jīng)30％酒精，50℃水浸泡片刻，使其充分展開。轉(zhuǎn)移至載玻片上，75℃烤片45min。
2)順次二甲苯脫石蠟(15min×3)。系列濃度乙醇(100％，95％，80％)順次浸泡片刻，蒸餾水沖洗2遍，PBS浸泡15-30min。
3)事先對組織抗原進行各種方法的修復(fù)，選擇效果最好的抗原修復(fù)方法。經(jīng)試驗后Cofilin1采用微波修復(fù)，磷酸化cofilin采用胰酶修復(fù)。
4)3％過氧化氫封閉10min。
5)加入一抗，將切片放入濕盒中，室溫下孵育75min，PBS沖洗5min×3次。
6)全自動免疫組化染色儀加入二抗，將切片放入濕盒中，室溫下孵育45min，PBS洗5min×3次。
7)DAB顯色1-5min，光鏡控制。PBS，蒸餾水沖洗。
8)蘇木素復(fù)染蘇木蘇中浸泡1min，蒸餾水沖洗，鹽酸酒精消化片刻，淡氨水中浸泡1min，蒸餾水沖洗。
9)系列濃度乙醇(80％，95％，100％)順次浸泡片刻，二甲苯順次浸泡片刻(×2)。
10)中性樹脂膠封片。
3.閱片，判定標(biāo)準(zhǔn)及陰陽性對照所有切片均由病理科?？漆t(yī)生在不知道任何臨床資料的情況下進行閱片。
判定標(biāo)準(zhǔn)cofilin1和磷酸化cofilin均以細(xì)胞漿棕色為染色陽性。根據(jù)著色腫瘤細(xì)胞占全部腫瘤細(xì)胞的百分比，＜5％為(-)，5-25％為(+)，25-50％為(++)，50％-75％為(+++)，＞75％為(++++)，隨機選取10個視野，平均值作為最終結(jié)果。
陽性對照兩者的陽性對照均為扁桃體生發(fā)中心。二者的陽性部位均為細(xì)胞漿。
陰性對照用PBS取代一抗。
4.統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS11.5軟件進行如下統(tǒng)計分析采用等級資料的秩和檢驗評價化療敏感及耐藥患者的cofilin1和磷酸化cofilin1表達量是否存在顯著性差異。
(二)、結(jié)果卵巢癌化療敏感組平均年齡51.13歲，化療耐藥組平均年齡54.32歲，兩組間年齡無統(tǒng)計學(xué)差異(U值＝213.0，P＝0.261)。兩組間卵巢癌期別無統(tǒng)計學(xué)差異(U值＝261.5，P＝0.948)。
一)化療敏感和耐藥組的cofilin1表達的差異比較采用等級資料的秩和檢驗比較化療敏感組和耐藥組患者的總cofilin1表達量無顯著性差異，結(jié)果顯示統(tǒng)計量U值＝263.6，P值＝0.991＞0.05，說明化療敏感組與耐藥組的總cofilin1表達量之間無顯著性差異，見圖32，表11，13。
二)化療敏感和耐藥組的磷酸化cofilin1表達的差異比較采用等級資料的秩和檢驗比較化療敏感組和耐藥組患者的磷酸化cofilin1表達量有無顯著性差異，結(jié)果顯示統(tǒng)計量U值＝157.5，P值＝0.014＜0.05，說明化療敏感組與耐藥組的磷酸化cofilin1表達量之間存在顯著性差異，化療耐藥組的磷酸化cofilin1表達量高于敏感組，見圖33，表12，14。
(三)結(jié)論通過對24例化療敏感患者與22例耐藥患者的卵巢癌組織免疫組化染色研究，結(jié)果顯示，兩組的總cofilin1表達無顯著性差異(P＝0.991)，提示耐藥性與總cofilin1無關(guān)；而磷酸化cofilin1的表達存在顯著性差異(P＝0.014)，提示cofilin1在卵巢癌組織內(nèi)可能通過以磷酸化的形式發(fā)揮耐藥作用。
表1 引物序列、目的片段長度及退火溫度。

表2 SKOV3和紫杉醇耐藥細(xì)胞IC50濃度。

表3 7天(d)細(xì)胞生長情況(表內(nèi)數(shù)值為細(xì)胞數(shù)×103/ml)，Td為細(xì)胞株群體倍增時間(小時)。

表4 SKOV3及耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。

(*P＜0.05，**P＜0.01與SKOV3相比)表5 耐藥相關(guān)基因在耐藥與敏感細(xì)胞之間的表達比。

(*p＜0.05，**p＜0.01)
表6 經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定在耐藥細(xì)胞中表達上調(diào)的蛋白質(zhì)。

表7經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定在耐藥細(xì)胞中表達下調(diào)的蛋白質(zhì)。

表8pcDNA-cof和pcDNA-antisense-cof轉(zhuǎn)染細(xì)胞后紫杉醇耐藥性的改變。SK PC、A-PC、SKTR30-PC、SKTR2500-PC、ATR-PC為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的對照細(xì)胞；SK-COF、A-COF分別為轉(zhuǎn)染pcDNA-cof的SKOV3和A2780細(xì)胞；SKTR30-ACOF、SKTR2500-ACOF、ATR-ACOF分別為轉(zhuǎn)染pcDNA-antisense-cof的SK-TR30，SK-TR2500，A2780-TR細(xì)胞。

(*p＜0.05，**p＜0.01)
表924例卵巢癌化療敏感組織標(biāo)本的相應(yīng)患者臨床資料。

表1022例卵巢癌化療耐藥組織標(biāo)本的相應(yīng)患者臨床資料。

表11卵巢癌化療敏感組標(biāo)本的cofilin1和磷酸化cofilin1免疫組化染色結(jié)果。


表12卵巢癌化療耐藥組標(biāo)本的cofilin1和磷酸化cofilin1免疫組化染色結(jié)果。

表13化療敏感組與耐藥組標(biāo)本的cofilin1表達結(jié)果比較。

表14化療敏感組與耐藥組標(biāo)本的磷酸化cofilin1表達結(jié)果比較。

序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院<120>Cofilin 1與癌癥的紫杉烷類化療藥物耐藥性的相關(guān)性<130>IDC060072<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>501<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(501)<400>1atg gcc tcc ggt gtg gct gtc tct gat ggt gtc atc aag gtg ttc aac48Met Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Asp Gly Val Ile Lys Val Phe Asn1 5 10 15gac atg aag gtg cgt aag tct tca acg cca gag gag gtg aag aag cgc96Asp Met Lys Val Arg Lys Ser Ser Thr Pro Glu Glu Val Lys Lys Arg20 25 30aag aag gcg gtg ctc ttc tgc ctg agt gag gac aag aag aac atc atc 144Lys Lys Ala Val Leu Phe Cys Leu Ser Glu Asp Lys Lys Ash Ile Ile35 40 45ctg gag gag ggc aag gag atc ctg gtg ggc gat gtg ggc cag act gtc 192Leu Glu Glu Gly Lys Glu Ile Leu Val Gly Asp Val Gly Gln Thr Val50 55 60gac gac ccc tac gcc acc ttt gtc aag atg ctg cca gat aag gac tgc 240Asp Asp Pro Tyr Ala Thr Phe Val Lys Met Leu Pro Asp Lys Asp Cys65 70 75 80cgc tat gcc ctc tat gat gca acc tat gag acc aag gag agc aag aag 288Arg Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Thr Tyr Glu Thr Lys Glu Ser Lys Lys85 90 95gag gat ctg gtg ttt atc ttc tgg gcc ccc gag tct gcg ccc ctt aag 336Glu Asp Leu Val Phe Ile Phe Trp Ala Pro Glu Ser Ala Pro Leu Lys100 105 110agc aaa atg att tat gcc agc tcc aag gac gcc atc aag aag aag ctg 384
Ser Lys Met Ile Tyr Ala Ser Ser Lys Asp Ala Ile Lys Lys Lys Leu115 120 125aca ggg atc aag cat gaa ttg caa gca aac tgc tac gag gag gtc aag432Thr Gly Ile Lys His Glu Leu Gln Ala Asn Cys Tyr Glu Glu Val Lys130 135 140gac cgc tgc acc ctg gca gag aag ctg ggg ggc agt gcc gtc atc tcc480Asp Arg Cys Thr Leu Ala Glu Lys Leu Gly Gly Ser Ala Val Ile Ser145 150 155 160ctg gag ggc aag cct ttg tga501Leu Glu Gly Lys Pro Leu165<210>2<211>166<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Asp Gly Val Ile Lys Val Phe Asn1 5 10 15Asp Met Lys Val Arg Lys Ser Ser Thr Pro Glu Glu Val Lys Lys Arg20 25 30Lys Lys Ala Val Leu Phe Cys Leu Ser Glu Asp Lys Lys Asn Ile Ile35 40 45Leu Glu Glu Gly Lys Glu Ile Leu Val Gly Asp Val Gly Gln Thr Val50 55 60Asp Asp Pro Tyr Ala Thr Phe Val Lys Met Leu Pro Asp Lys Asp Cys65 70 75 80Arg Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Thr Tyr Glu Thr Lys Glu Ser Lys Lys85 90 95Glu Asp Leu Val Phe Ile Phe Trp Ala Pro Glu Ser Ala Pro Leu Lys100 105 110Ser Lys Met Ile Tyr Ala Ser Ser Lys Asp Ala Ile Lys Lys Lys Leu
115 120 125Thr Gly Ile Lys His Glu Leu Gln Ala Asn Cys Tyr Glu Glu Val Lys130 135 140Asp Arg Cys Thr Leu Ala Glu Lys Leu Gly Gly Ser Ala Val Ile Ser145 150 155 160Leu Glu Gly Lys Pro Leu165<210>3<211>20<212>DNA<213>引物<400>3cccatcattg caatagcagg20<210>4<211>21<212>DNA<213>物<400>4acaactactg cgtgattctc g 21<210>5<211>20<212>DNA<213>引物<400>5gttcaaactt ctgctcctga20<210>6<211>21<212>DNA<213>引物<400>6ggtcttgaca tcctgcacat a 21<210>7
<211>20<212>DNA<213>引物<400>7accaagacgt atcaggtggc20<210>8<211>17<212>DNA<213>引物<400>8ggtggtgacc gtggaga 17<210>9<211>20<212>DNA<213>引物<400>9ctgtcaggtt ccagctcctc20<210>10<211>19<212>DNA<213>引物<400>10ctcatggatc agcagcaag 19<210>11<211>20<212>DNA<213>引物<400>11acctcgctgc tccagcctct20<210>12<211>20<212>DNA<213>引物<400>12ccggcctgga tgtgcacgat20
<210>13<211>20<212>DNA<213>引物<400>13cgcatctccg agcagttcac20<210>14<211>19<212>DNA<213>引物<400>14tcgccctcct cctcctcga 19<210>15<211>20<212>DNA<213>引物<400>15ctgctcgcag ctggagtgag20<210>16<211>20<212>DNA<213>引物<400>16cataaatact gcaggagggc20<210>17<211>20<212>DNA<213>引物<400>17tctccgccgc atcttccacc20<210>18<211>20<212>DNA<213>引物<400>18
ccggcctgga tgtgcacgat20<210>19<211>20<212>DNA<213>引物<400>19gagcttgcca gcctcgttct20<210>20<211>20<212>DNA<213>引物<400>20ccgatctggt tgccgcactg20<210>21<211>20<212>DNA<213>引物<400>21acccccactg aaaaagatga20<210>22<211>20<212>DNA<213>引物<400>22atcttcaaac ctccatgatg20
權(quán)利要求
1.調(diào)節(jié)癌癥的紫杉烷類化療藥物耐藥性的方法，包括改變癌癥細(xì)胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表達，其中優(yōu)選地，所述癌癥是卵巢癌，所述紫杉烷類化療藥物是紫杉醇，其中所述方法用于體外調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的耐藥性或者用于體內(nèi)調(diào)節(jié)癌癥患者的耐藥性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過提高癌細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達而提高癌細(xì)胞對紫杉烷類化療藥物的耐受性，優(yōu)選地，通過在癌細(xì)胞中表達cofilin 1基因而提高細(xì)胞中的cofilin 1表達，再優(yōu)選地其中通過使用表達cofilin 1基因的質(zhì)粒來提高所述細(xì)胞中的cofilin 1含量和/或磷酸化cofilin 1的含量；或者優(yōu)選地，通過增加癌細(xì)胞中的磷酸化cofilin 1而提高癌細(xì)胞對紫杉烷類化療藥物的耐受性。
3.權(quán)利要求1的方法，其中通過減少和/或抑制癌細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達而降低癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐受性，優(yōu)選地，通過在癌細(xì)胞中表達cofilin 1的反義核酸和/或特異于cofilin 1的核酶而減少和/或抑制細(xì)胞中的cofilin 1表達，再優(yōu)選地其中通過使用表達反義cofilin 1的質(zhì)粒來降低細(xì)胞中的cofilin 1含量和/或磷酸化cofilin 1的含量；或者優(yōu)選地，通過減少癌細(xì)胞中的磷酸化cofilin 1表達而降低癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐受性。
4.一種治療癌癥患者的方法，包括步驟a)通過權(quán)利要求1或4的方法降低患者對紫杉烷類化療藥物的耐受性；和b)向所述患者施用紫杉烷類化療藥物，任選地，在步驟(a)之前檢測癌癥患者的紫杉烷類化療藥物耐受性以確定耐藥性患者。
5.通過權(quán)利要求1的方法改變了對紫杉烷類化療藥物的耐受性的癌癥細(xì)胞，優(yōu)選地，所述細(xì)胞包含表達正義cofilin 1或反義cofilin 1的表達載體，優(yōu)選地，所述載體是質(zhì)粒。
6.抑制cofilin 1表達的反義核苷酸。
7.權(quán)利要求6的反義核苷酸，其包含能夠特異結(jié)合cofilin 1多核苷酸序列或其互補序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列，更優(yōu)選地所述反義核苷酸含有與cofinlin多核苷酸的一或多個部分互補、更優(yōu)選地基本上互補、甚至更優(yōu)選地完全互補的序列區(qū)域，更優(yōu)選地，所述反義核苷酸包含與全長cofilin 1多核苷酸完全互補的DNA序列，優(yōu)選地，所述反義核苷酸是DNA或者RNA或者其衍生物，最優(yōu)選地，所述反義核苷酸是反義質(zhì)粒。
8.能夠特異切割cofilin1 mRNA的核酶。
9.權(quán)利要求8的核酶，其具有與一或多個cofilin1 RNA區(qū)域互補的特異底物結(jié)合位點，并且它在該底物結(jié)合位點中或周圍具有賦予該分子RNA切割活性的核苷酸序列，優(yōu)選地所述核酶選自錘頭型核酶、發(fā)夾型核酶、丁型肝炎病毒型核酶、I型內(nèi)含子型核酶或RNaseP RNA型核酶或鏈孢霉屬VS RNA型核酶
10.能夠改變癌細(xì)胞中cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達的藥劑在制備用于改變癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐藥性的藥物中的用途，其中所述藥物用于體外改變癌細(xì)胞的耐藥性或者用于體內(nèi)改變癌癥患者的耐藥性，其中所述癌癥優(yōu)選是卵巢癌，所述紫杉烷類化療藥物優(yōu)選是紫杉醇。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述藥劑能夠降低癌細(xì)胞中cofilin1和/或磷酸化cofilin 1的表達，而所述藥物用于降低癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐藥性，其中所述藥劑優(yōu)選選自權(quán)利要求6或7的反義核苷酸和權(quán)利要求8或9的核酶。
12.權(quán)利要求10的用途，其中所述藥劑能夠提高癌細(xì)胞中cofilin1和/或磷酸化cofilin 1的表達，而所述藥物用于提高癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐藥性，其中所述藥劑優(yōu)選是表達cofilin1的DNA構(gòu)建體。
13.一種篩選能夠改變癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐藥性的藥劑的方法，其中所述癌癥優(yōu)選是卵巢癌，所述紫杉烷類化療藥物優(yōu)選是紫杉醇，所述方法包括步驟提供候選藥劑；使所述候選藥劑與癌細(xì)胞接觸；檢測所述癌細(xì)胞中的cofilin1/磷酸化cofilin 1的表達；將所檢測到的表達量與預(yù)定閾值比較。
14.一種檢測癌細(xì)胞對紫杉烷類化療藥物的耐藥性的方法，其中所述癌癥優(yōu)選是卵巢癌，所述紫杉烷類化療藥物優(yōu)選是紫杉醇，所述方法包括檢測癌細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表達量，和將所得表達量與預(yù)定閾值進行比較，由此指示卵巢癌細(xì)胞對紫杉烷類化療藥物的耐藥性。
15.一種預(yù)測或預(yù)后紫杉烷類化療藥物在癌癥患者中的治療效果的方法，其中所述癌癥優(yōu)選是卵巢癌，所述紫杉烷類化療藥物優(yōu)選是紫杉醇，所述方法包括檢測癌癥患者的腫瘤組織中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1的表達量，和將所得的量與預(yù)定閾值進行比較，由此預(yù)測或預(yù)后向所述患者施用紫杉烷類化療藥物的治療效果。
16.權(quán)利要求13至15之任一項的方法，其中所述檢測cofilin 1和/或磷酸化cofillin 1的表達量的檢測步驟通過檢測cofilin1的mRNA水平或蛋白質(zhì)水平，或者通過檢測磷酸化cofilin1的蛋白質(zhì)水平來實現(xiàn)，優(yōu)選地檢測磷酸化cofilin1的蛋白質(zhì)水平；其中，優(yōu)選地，在蛋白質(zhì)水平上的檢測，通過抗體或寡核苷酸適配體來實現(xiàn)，優(yōu)選利用抗體；而在mRNA水平上的檢測，優(yōu)選通過Northern印跡或PCR方法來實現(xiàn)。
17.特異結(jié)合cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白質(zhì)的抗體或者抗體片斷，該抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體，優(yōu)選其是中和抗體。
18.特異結(jié)合cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1蛋白質(zhì)的寡核苷酸適配體，優(yōu)選地其是DNA，優(yōu)選地，其連接或標(biāo)記了其它功能基團或分子，例如巰基、氨基、放射性同位素、熒光素、生物素、或酶等。
19.能夠檢測癌細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達量的藥劑在制備用于檢測或診斷癌細(xì)胞或癌癥患者的紫杉烷類化療藥物耐藥性的檢測或診斷試劑盒中的用途，其中所述癌癥優(yōu)選是卵巢癌，所述紫杉烷類化療藥物優(yōu)選是紫杉醇。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述藥劑為權(quán)利要求17抗體及其片段或權(quán)利要求18的寡核苷酸適配體，優(yōu)選單克隆抗體；或者所述藥劑檢測細(xì)胞中cofilin 1基因的mRNA水平表達量，優(yōu)選是特異于cofilin 1基因的雜交探針或引物。
21.一種治療癌癥患者的方法，其中所述癌癥優(yōu)選是卵巢癌，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求15的方法確定患者的紫杉烷類化療藥物耐藥性，和調(diào)整患者的紫杉烷類化療藥物給藥方案。
22.藥物組合物，其包含權(quán)利要求11或12的藥劑、權(quán)利要求6或7的cofilin1的反義核苷酸、權(quán)利要求8或9的核酶、權(quán)利要求19的cofilin1/磷酸化cofilin1的抗體和權(quán)利要求20的寡核苷酸適配體中的一個或任何組合。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其用于診斷和/或改變癌癥的紫杉醇耐藥性，其中所述癌癥是卵巢癌。
24.一種建立紫杉烷類化療藥物耐藥性癌細(xì)胞株的方法，包括以大劑量紫杉烷類化療藥物沖擊誘導(dǎo)癌細(xì)胞。
25.權(quán)利要求30的方法，其中所述大劑量紫杉烷類化療藥物優(yōu)選為2μM至2.5μM，其中所述方法優(yōu)選地還包括在耐藥細(xì)胞形成后每各數(shù)周用所述大劑量的紫杉烷類化療藥物沖擊一次，其中優(yōu)選地每12周沖擊一次。
26.前述權(quán)利要求的發(fā)明，其中所述癌癥是能夠用紫杉烷類化療藥物治療的癌癥，例如，卵巢癌、肺癌、乳腺癌、頭頸癌、食管癌等優(yōu)選卵巢癌，更優(yōu)選人漿液性卵巢癌和上皮樣卵巢癌，包括內(nèi)膜樣癌、漿乳癌、腺癌、移行細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、透明細(xì)胞癌。
27.前述權(quán)利要求的發(fā)明，其中所述紫杉烷類化療藥物是紫杉醇、多西他賽等，優(yōu)選是紫杉醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及Cofilin 1與癌癥的紫杉烷類化療藥物耐藥性的相關(guān)性，具體地涉及通過改變癌細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達而提高/降低癌癥的紫杉烷類化療藥物耐藥性的方法、以及可以用于該方法中改變細(xì)胞中的cofilin 1和/或磷酸化cofilin 1表達的藥劑及所述藥劑的篩選方法和在制備藥物試劑盒中的用途。此外，本發(fā)明還涉及用于檢測和/或預(yù)后癌癥對紫杉烷類化療藥物的耐藥性的診斷方法和試劑盒。此外，本發(fā)明還涉及通過大劑量紫杉醇沖擊癌細(xì)胞建立癌細(xì)胞耐藥株的方法。在本發(fā)明中，所述癌癥優(yōu)選是卵巢癌，所述紫杉烷類化療藥物是紫杉醇。
文檔編號C12N15/09GK1931373SQ20061012683
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月6日
發(fā)明者潘凌亞, 李旻, 閆雪冬 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院