專利名稱：大菱鲆紅體病虹彩病毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚類病毒檢測技術(shù)，是涉及用聚合酶鏈反應(yīng)檢測大菱鲆紅體病虹彩病毒的一種分子生物學(xué)方法。
背景技術(shù)：
大菱鲆是于1992年引進(jìn)我國的優(yōu)質(zhì)海水魚類養(yǎng)殖品種，目前已成為我國北方沿海地區(qū)最重要的工廠化海水養(yǎng)殖魚類之一。但近年來我國養(yǎng)殖大菱鲆疾病流行日益嚴(yán)重，特別是由大菱鲆紅體病虹彩病毒(turbot reddish bodyiridovirus，簡稱TRBIV)引起的病毒性紅體病，已嚴(yán)重威脅著該養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。
大菱鲆紅體病虹彩病毒是一種魚類虹彩病毒，是我國養(yǎng)殖大菱鲆最主要的病毒性病原。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所的史成銀等人在國際上率先發(fā)現(xiàn)了該病毒，并開展了該病毒的特征、精細(xì)結(jié)構(gòu)、致病性、分類鑒定、基因克隆和檢測技術(shù)的研究，證明該病毒是一種新的魚類虹彩病毒(Shi etal.，2004)。大菱鲆紅體病虹彩病毒近年來在我國養(yǎng)殖大菱鲆中迅速流行，導(dǎo)致患病大菱鲆大量死亡，損失巨大。鑒于TRBIV對我國大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成的巨大威脅，采用新方法新技術(shù)快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測TRBIV，加強(qiáng)病毒的檢測和魚體的檢疫，從而積極預(yù)防病毒的感染，對我國大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。
在感染大菱鲆的虹彩病毒方面，丹麥的Bloch等人曾于1993年報(bào)道過虹彩病毒引起丹麥大菱鲆魚苗大量死亡的病例(Bloch et al.，1993)。但Bloch等人報(bào)道的大菱鲆虹彩病毒與我國大菱鲆紅體病虹彩病毒在病毒大小、靶組織、易感魚的大小、所致疾病的外觀表現(xiàn)等各方面都有顯著差異，因此這是兩種不同的感染大菱鲆的虹彩病毒。此外，Bloch等未純化出丹麥大菱鲆虹彩病毒，在檢測技術(shù)方面也僅僅通過電鏡對該病毒進(jìn)行了觀察，未能建立起病毒的快速檢測技術(shù)(Bloch et al.，1993)。
由于大菱鲆紅體病虹彩病毒是一種新發(fā)現(xiàn)的魚類虹彩病毒，目前對該病毒的檢測手段還十分有限，文獻(xiàn)中公開報(bào)道的僅有中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所的史成銀等人應(yīng)用組織病理學(xué)方法和電子顯微鏡技術(shù)來檢測該病毒(Shi et al.，2004)，以及中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所的陳松林等人采用接種培養(yǎng)的牙鲆胚胎細(xì)胞的方法來分離和鑒定該病毒(Chen et al.，2004)。在這些方法中，傳統(tǒng)的組織病理學(xué)方法只能對大菱鲆的病理狀態(tài)做出初步判斷，不能直接檢測到大菱鲆紅體病虹彩病毒的存在與否，特異性差。電子顯微鏡觀察法雖然可以直接觀察到病毒粒子的存在，但操作復(fù)雜、樣品處理時(shí)間過長、不能用于大菱鲆紅體病虹彩病毒的快速診斷及大量樣品的檢測。細(xì)胞培養(yǎng)方法可靠性雖較高，但檢測靈敏度低，操作繁瑣，一般需要一周左右的時(shí)間才能得到病毒檢測結(jié)果。因此，上述病毒檢測方法都有明顯的缺點(diǎn)，不適合于快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測大菱鲆紅體病虹彩病毒。
聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，簡稱PCR)技術(shù)是一種現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，可以在體外快速、大量擴(kuò)增病毒特異性DNA片段，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可以克服上述檢測方法的缺點(diǎn)，已成功地用于多種病毒的檢測。文獻(xiàn)中已有應(yīng)用PCR擴(kuò)增來檢測虹彩病毒科病毒的報(bào)道，如中山大學(xué)的鄧敏等人曾通過PCR擴(kuò)增病毒核苷酸還原酶小亞單位(RNRS)來檢測鱖魚虹彩病毒，臺(tái)灣國立中山大學(xué)的Chao等人曾通過PCR擴(kuò)增來檢測臺(tái)灣石斑魚虹彩病毒(鄧敏等，2000；Chao et al.，2002)。上述鱖魚虹彩病毒和臺(tái)灣石斑魚虹彩病毒與大菱鲆紅體病虹彩病毒同屬虹彩病毒科，但屬于不同的病毒種，其基因組之間有較大的差異，因此已報(bào)道的PCR檢測技術(shù)并不能用于大菱鲆紅體病虹彩病毒的檢測。迄今為止，未見有應(yīng)用PCR擴(kuò)增來檢測大菱鲆紅體病虹彩病毒的報(bào)道。
參考文獻(xiàn)1、鄧敏，何建國，左濤，翁少萍，曾慷，呂玲，周松裕，龍綮新，2000。鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)PCR檢測方法的建立及虹彩病毒新證據(jù)。病毒學(xué)報(bào)，16365-369。
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測方法，快速、靈敏、簡便、準(zhǔn)確地對大菱鲆紅體病虹彩病毒(TRBIV)進(jìn)行檢測，該方法的檢測靈敏度高，效果好，可以替代電子顯微鏡和細(xì)胞培養(yǎng)檢測法。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的發(fā)明人在對TRBIV及其它魚類虹彩病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，TRBIV的主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列與其它虹彩病毒的相應(yīng)序列有明顯的差異，根據(jù)TRBIV的該段核苷酸序列，可以設(shè)計(jì)出相應(yīng)的PCR引物，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測TRBIV的分子生物學(xué)方法。
本發(fā)明提供大菱鲆紅體病虹彩病毒一種聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法，具體包括三部分1、TRBIV特異性的核苷酸序列；2、TRBIV的PCR檢測引物；3、TRBIV的PCR檢測方法。
本發(fā)明三部分的內(nèi)容是1.TRBIV特異性的核苷酸序列本發(fā)明提供的TRBIV特異性核苷酸序列來源于TRBIV的主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列，為全長1581個(gè)核苷酸的線性雙鏈DNA序列(如圖1和序列表第1號(hào)序列所示)。該TRBIV特異性核苷酸序列的第58個(gè)核苷酸至第1419個(gè)核苷酸編碼一個(gè)含453個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，即TRBIV的主要衣殼蛋白(如序列表第2號(hào)序列所示)。
該TRBIV特異性核苷酸序列可以使用兩個(gè)長度分別為18和19個(gè)核苷酸的線性單鏈DNA(如序列表第3號(hào)序列和序列表第4號(hào)序列所示)作為寡聚核苷酸引物(以下分別簡稱為iridoF和iridoR)，通過同源分子克隆的方法得到(如實(shí)施例3所示)，或者按已知的該序列的核苷酸組成和排列，在商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀上按常規(guī)方法合成而得到。
2.TRBIV的PCR檢測引物本發(fā)明用于TRBIV PCR檢測的引物是兩個(gè)長度分別為18和20個(gè)核苷酸的線性單鏈DNA(如序列表第5號(hào)序列和序列表第6號(hào)序列所示，以下分別簡稱為MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR)，它們分別與TRBIV主要衣殼蛋白基因及其附近的1581bp的核苷酸片段的304bp-321bp和1084bp-1065bp處的核苷酸序列相同或互補(bǔ)，其核苷酸序列分別為MCP-TRBIVF5’CGTGTTAAGATCCCCTCC 3’和MCP-TRBIVR5’TCTCGTAAATGAGTGACACC 3’。它們是在上述的TRBIV主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列基礎(chǔ)上，通過Omiga 2.0軟件(Oxford Molecular Ltd.)設(shè)計(jì)出來的(如實(shí)施例4所示)。
本發(fā)明的上述PCR引物，可按照已知的該序列的核苷酸組成和排列，通過常規(guī)的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀進(jìn)行合成)。
本發(fā)明的上述PCR引物(MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR)，能對TRBIV特異性擴(kuò)增，但不能對大菱鲆組織DNA進(jìn)行擴(kuò)增，也不能擴(kuò)增淋巴囊腫病毒(虹彩病毒科的一個(gè)成員，不同于TRBIV)的DNA。所以，利用上述PCR引物，通過PCR方法可以快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測TRBIV。
3.TRBIV的PCR檢測方法本發(fā)明所提供的TRBIV檢測方法，包括從待測樣品中制備PCR模板，再在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體系中以上述PCR引物(MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行電泳檢測，如果出現(xiàn)特異性目標(biāo)條帶(780bp長的DNA片段)，則該樣品的TRBIV檢測結(jié)果為陽性。具體包括以下步驟(1)PCR檢測反應(yīng)模板的制備取待測樣品適量，采用羅氏診斷公司(Roche Diagnostics Ltd.)商品化的“高純度PCR模板制備試劑盒”(High Pure PCR Template Preparation Kit)進(jìn)行組織核酸的提取和純化，作為PCR檢測反應(yīng)的模板，詳細(xì)操作參見實(shí)施例1或該試劑盒使用說明書。
(2)PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序取上述制備的PCR反應(yīng)模板，連同TRBIV的PCR檢測引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR，在PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。該P(yáng)CR反應(yīng)體系包括模板DNA溶液1-2μl，Taq DNA聚合酶1U，四種dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR各10pmol，最后反應(yīng)體系的總體積為20μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；然后94℃2分鐘，59℃1分鐘，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72℃7分鐘，1個(gè)循環(huán)。
(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測和結(jié)果判斷上述PCR反應(yīng)程序結(jié)束后，在反應(yīng)管中加入2μl 10×上樣緩沖液(EDTA 50mM，60％甘油，0.1％二甲苯腈藍(lán)FF，0.1％溴酚藍(lán))，混勻。取少量擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5μg/ml溴化乙啶的1％瓊脂糖凝膠上電泳，觀察目的片段的擴(kuò)增情況。待測樣品經(jīng)PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳后，若在780bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶，則為TRBIV陽性，說明該樣品攜帶大菱鲆紅體病虹彩病毒；否則檢測結(jié)果為陰性。
以上TRBIV的PCR檢測方法，從制備反應(yīng)模板開始，經(jīng)過配制反應(yīng)體系、擴(kuò)增目標(biāo)核酸等步驟，直至電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物從而獲得檢測結(jié)果，整個(gè)檢測過程僅需4-8個(gè)小時(shí)，十分便捷、快速。
本發(fā)明所提供的TRBIV檢測方法的靈敏度，可以通過如下方法進(jìn)行測定取感染了TRBIV的大菱鲆脾組織樣品，勻漿后作梯度稀釋，然后使用羅氏診斷公司的高純度PCR模板制備試劑盒制備PCR反應(yīng)模板(如實(shí)施例1所示)，再采用引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(如實(shí)施例6所示)。測定結(jié)果表明，本發(fā)明提供的PCR檢測方法可以從低至10-7g的病魚脾組織中檢測到TRBIV的存在，具有極高的靈敏度(如圖5所示)。
本發(fā)明所提供的TRBIV檢測方法具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)簡便快速。利用已有技術(shù)檢測TRBIV，通常需要數(shù)天至數(shù)周的時(shí)間，而本方法可以在一天的時(shí)間內(nèi)，得到TRBIV的檢測結(jié)果，并且可以對數(shù)十個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行檢測。
(2)樣品用量少，僅需數(shù)十毫克樣品即可完成檢測，不影響樣品的完整性。
(3)準(zhǔn)確，靈敏度高，對低至10-7g樣品中的TRBIV亦可檢出。
(4)不使用有毒試劑。
本發(fā)明具有如下有益效果利用本發(fā)明提供的TRBIV特異性核苷酸序列及依據(jù)該序列設(shè)計(jì)的PCR引物，通過本發(fā)明提供的PCR方法，經(jīng)簡單操作，即可對樣品中的TRBIV進(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢定。應(yīng)用上述方法已完成近100個(gè)大菱鲆樣品和TRBIV樣品的檢測，結(jié)果準(zhǔn)確，且可在一天之內(nèi)得到檢測結(jié)果，靈敏度達(dá)10-7g魚體組織，并可以同時(shí)檢測多個(gè)樣品。
通過電鏡檢查，可以在病魚樣品的超薄切片中觀察到大菱鲆紅體病虹彩病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)(如圖2所示)。對比檢測發(fā)現(xiàn)與電鏡檢查方法相比，電鏡檢查觀察到病毒的陽性樣品，PCR檢測結(jié)果均為陽性，符合率為100％；而PCR檢測結(jié)果為陽性的樣品，有時(shí)電鏡檢查未觀察到病毒，說明電鏡檢查法存在漏檢；未發(fā)現(xiàn)電鏡檢查結(jié)果為陽性，而PCR檢測結(jié)果為陰性的樣品，說明該P(yáng)CR方法可靠性高。以上對比檢測結(jié)果見表1。
因此，PCR法用于TRBIV的檢測具有重要的實(shí)際意義，它可以快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測TRBIV，可以加強(qiáng)病毒的檢測和魚體的檢疫，從而積極預(yù)防病毒的感染。此外，該方法還可應(yīng)用于TRBIV的臨床診斷，實(shí)驗(yàn)室診斷及流行病學(xué)調(diào)查。
表1 TRBIV的PCR檢測及電鏡檢查結(jié)果對比



圖1大菱鲆紅體病虹彩病毒主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列結(jié)構(gòu)示意圖，其中帶下劃線的黑體部分(304bp-321bp和1084bp-1065bp)分別為本發(fā)明中用于檢測大菱鲆紅體病虹彩病毒的PCR引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR(互補(bǔ)序列)。
圖2超薄切片中大菱鲆紅體病虹彩病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)的電鏡觀察。
圖3從大菱鲆組織中純化的大菱鲆紅體病虹彩病毒的電鏡負(fù)染觀察。
圖4本發(fā)明PCR檢測的特異性測試，即實(shí)施例5的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖，其中1為寶生物工程(大連)有限公司的DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為未感染TRBIV的健康大菱鲆脾臟組織，3為感染了TRBIV的大菱鲆脾臟組織，4為感染了TRBIV的大菱鲆腎臟組織，5為淋巴囊腫病毒DNA。右側(cè)箭頭所指為PCR擴(kuò)增目標(biāo)條帶。
圖5本發(fā)明PCR檢測的靈敏度測試，即實(shí)施例6的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖，其中1為10-3g未感染TRBIV的健康大菱鲆脾臟組織，2為寶生物工程(大連)有限公司的DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，3-8分別為10-4G、10-5g、10-6g、10-7g、10-8g、10-9g感染了TRBIV的大菱鲆脾組織。右側(cè)箭頭所指為PCR擴(kuò)增目標(biāo)條帶。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明是在如下科學(xué)發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成的從2001年開始，在我國養(yǎng)殖大菱鲆中流行一種可導(dǎo)致養(yǎng)殖魚大量死亡的大菱鲆紅體病。通過對該病的流行病學(xué)、組織和細(xì)胞病理學(xué)、病原人工感染和細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)、病毒的純化和分子生物學(xué)分類鑒定等研究，本發(fā)明人在國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)該病的病原是一種新的魚類虹彩病毒，并將其命名為“大菱鲆紅體病虹彩病毒”(TRBIV)。在克隆并測序了TRBIV的兩個(gè)重要基因之后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在病毒主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列中，TRBIV具有與其它虹彩病毒顯著不同的組成和排列，因此可作為TRBIV特征性核苷酸序列，用于TRBIV的鑒定和檢測。本發(fā)明人根據(jù)該特征性核苷酸序列，設(shè)計(jì)制備了TRBIV的PCR引物，建立了TRBIV的PCR檢測方法，并在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。該方法可以快速檢測樣品中的TRBIV，且具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確性。
為了建立TRBIV的PCR檢測方法，首先需要獲得TRBIV特異性的核苷酸序列。這通常包括TRBIV的分離純化、TRBIV的主要衣殼蛋白基因及其附近核苷酸的克隆和測序、TRBIV特異性核苷酸序列的鑒定等內(nèi)容。
本發(fā)明采用超速離心的方法來分離TRBIV，即收集感染了TRBIV的大菱鲆脾臟和腎臟組織，加入磷酸緩沖液，經(jīng)勻漿、差速離心及20％-60％的蔗糖密度梯度超速離心后，取中間部分，再離心濃縮，可以得到較純的TRBIV制劑，圖3是電鏡下觀測到的純化的病毒照片。
為了獲得TRBIV的主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列，可以采用多種分子克隆技術(shù)。本發(fā)明采用了同源分子克隆技術(shù)來克隆TRBIV的主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列。即首先根據(jù)魚類虹彩病毒主要衣殼蛋白基因附近的核苷酸序列保守區(qū)，以虹彩病毒主要衣殼蛋白基因?yàn)槟繕?biāo)區(qū)，設(shè)計(jì)合成如下PCR引物，它們?yōu)樾蛄斜淼?號(hào)序列和序列表第4號(hào)序列所示的兩個(gè)寡聚核苷酸序列(iridoF和iridoR)。應(yīng)用PCR引物iridoF和iridoR對純化的TRBIV DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1600bp左右的目標(biāo)DNA片段。通過凝膠電泳分離、純化并回收該片段后，再與pUCm-T克隆載體(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)混合，在連接酶作用下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑反應(yīng)和酶切反應(yīng)對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選和鑒定，挑取含TRBIV DNA片段(約1600bp)的白色克隆在含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)上培養(yǎng)過夜，使用ABI PRISM TM377型DNA測序儀測序，得到1581bp的TRBIV核苷酸序列。圖1是該核苷酸序列的結(jié)構(gòu)示意圖。
為了鑒定該核苷酸序列是TRBIV的特異性序列，將該TRBIV核苷酸序列輸入到公共數(shù)據(jù)庫GenBank中，運(yùn)用BlastN程序進(jìn)行核苷酸序列的搜索和比對，發(fā)現(xiàn)該序列是TRBIV主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列，而且該序列與所有已公開DNA序列都不相同，因此該序列是TRBIV特異性的核苷酸序列。序列表第2號(hào)序列所示的即為該基因編碼的TRBIV主要衣殼蛋白的氨基酸序列。
該TRBIV特異性的核苷酸序列也可以按已知的該序列的核苷酸組成和排列，在商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀上按常規(guī)方法合成而得到。
在獲得了TRBIV主要衣殼蛋白及其附近的核苷酸序列之后，就可以根據(jù)該TRBIV特異性的核苷酸序列，以TRBIV主要衣殼蛋白基因?yàn)槟繕?biāo)區(qū)，設(shè)計(jì)并制備TRBIV的PCR檢測引物。通?？梢允褂贸Ｓ玫纳镄畔⒎治鲕浖闯Ｒ?guī)方法來設(shè)計(jì)PCR引物，如Omiga 2.0和Primer Primier 5.0軟件。較佳地，可使用Omiga 2.0軟件。引物MCP-TRBIVF(5’CGTGTTAAGATCCCCTCC 3’)和MCP-TRBIVR(5’TCTCGTAAATGAGTGACACC 3’)即是使用Omiga 2.0軟件設(shè)計(jì)出來的TRBIV的PCR檢測引物，它們是序列表第5號(hào)序列和序列表第6號(hào)序列所示的兩個(gè)寡聚核苷酸序列，分別位于TRBIV主要衣殼蛋白基因及其附近核苷酸序列的304bp-321bp和1084bp-1065bp處。
該TRBIV的PCR檢測引物(MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR)可以按本發(fā)明的實(shí)施例4所述的方法得到，也可以按已知的該引物的核苷酸組成和排列通過常規(guī)的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀進(jìn)行合成)。
在制備了TRBIV的PCR檢測引物之后，就可以開展TRBIV的PCR檢測。該P(yáng)CR檢測方法通常包括反應(yīng)模板的制備、PCR反應(yīng)體系、PCR反應(yīng)程序、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測和結(jié)果判斷等內(nèi)容。
為了成功地進(jìn)行TRBIV的PCR檢測，反應(yīng)模板的制備即樣品組織DNA的提取和純化很關(guān)鍵。通常要求制備的反應(yīng)模板純度高，不含阻礙PCR反應(yīng)的抑制物。在本發(fā)明的實(shí)施例1中，采用羅氏診斷公司(Roche Diagnostics Ltd.)商品化的“高純度PCR模板制備試劑盒”(High Pure PCR TemplatePreparation Kit)進(jìn)行組織核酸的提取和純化，作為PCR檢測反應(yīng)的模板，更詳細(xì)的操作可以參見該試劑盒說明書。純化的樣品組織DNA可凍存于-20℃冰箱中，在數(shù)月內(nèi)使用。
在本發(fā)明中，可供使用的制備反應(yīng)模板的方法或試劑盒可以是任何純化樣品組織DNA的方法或試劑盒，它們包括(但并不限于)羅氏診斷公司的高純度PCR模板制備試劑盒，多種國產(chǎn)或進(jìn)口的DNA純化試劑盒和常規(guī)的酚/氯仿抽提法制備組織DNA方法。較佳地，是羅氏診斷公司的高純度PCR模板制備試劑盒。
上述用于純化樣品組織DNA的試劑盒可以購買得到。
本發(fā)明采用如下的反應(yīng)體系進(jìn)行TRBIV的PCR檢測在獲得了純化的樣品組織核酸溶液之后，取1-2μl上述溶液，在冰浴上操作，加入到如下PCR反應(yīng)混合液中Taq DNA聚合酶1U，四種dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR各10pmol，最后反應(yīng)體系的總體積為20μl(詳見本發(fā)明的實(shí)施例5)。
在進(jìn)行TRBIV的PCR檢測時(shí)，可以在一定范圍內(nèi)調(diào)整反應(yīng)體系的總體積，例如可以將反應(yīng)體系的總體積調(diào)整為10-40μl，但應(yīng)保持上述反應(yīng)體系中各組分的濃度不變。通常20μl的反應(yīng)體系足以適合常規(guī)的檢測。
本發(fā)明采用如下的擴(kuò)增方法進(jìn)行TRBIV的PCR檢測在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，將以上反應(yīng)混合物離心數(shù)秒，頂部覆蓋液體石蠟，置于PCR儀上，運(yùn)行如下反應(yīng)程序94℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；然后94℃2分鐘，59℃1分鐘，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72℃7分鐘，1個(gè)循環(huán)(詳見本發(fā)明的實(shí)施例5)。
本發(fā)明采用如下方法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和檢測結(jié)果的判定PCR反應(yīng)程序結(jié)束后，取10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5μg/ml溴化乙啶的1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，觀察目的片段擴(kuò)增情況。待測樣品經(jīng)PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳后，若在780bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶，則為TRBIV陽性，說明所測樣品攜帶大菱鲆紅體病虹彩病毒；否則檢測結(jié)果為陰性(詳見本發(fā)明的實(shí)施例5和圖4所示)。
為了更準(zhǔn)確地檢測TRBIV，可同時(shí)進(jìn)行陽性和陰性對照反應(yīng)。取TRBIV感染的大菱鲆脾臟組織和未感染TRBIV的健康大菱鲆脾臟組織，使用羅氏診斷公司的高純度PCR模板制備試劑盒純化樣品組織DNA，分別作為陽性對照樣品和陰性對照樣品。陽性對照樣品經(jīng)PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳后，應(yīng)在780bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶；陰性對照樣品經(jīng)PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳后，應(yīng)沒有任何DNA條帶出現(xiàn)。
在本發(fā)明的實(shí)施例6中，采用如下的方法測試TRBIV PCR檢測方法的靈敏度首先取感染了TRBIV的大菱鲆脾組織樣品1g置于10ml磷酸緩沖液中充分勻漿，并將勻漿液10倍梯度稀釋；在按實(shí)施例1所述方法分別制備PCR反應(yīng)模板之后，使用引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR，按上述PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行TRBIV的PCR檢測；最后分別取適量擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5μg/ml溴化乙啶的1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，觀察目的片段的擴(kuò)增情況。
圖5是本發(fā)明PCR檢測方法靈敏度測試的結(jié)果，可以清楚地看出采用引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR進(jìn)行TRBIV的PCR檢測，10-4g、10-5g、10-6g、10-7g感染了TRBIV的大菱鲆脾組織樣品都呈明顯的陽性反應(yīng)，即該檢測方法的靈敏度可達(dá)10-7g病魚組織。
下面以實(shí)施例敘述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容實(shí)施例1使用羅氏診斷公司的高純度PCR模板制備試劑盒提取和純化樣品組織DNA采用羅氏診斷公司的高純度PCR模板制備試劑盒(High Pure PCRTemplate Preparation Kit)提取和純化樣品組織DNA的具體操作步驟如下(1)取待測樣品組織25-50mg(如感染了TRBIV的大菱鲆脾組織50mg)，置于1.5ml無菌離心管中，用眼科剪刀剪碎，各加入組織裂解液(TissueLysis Buffer)200μl和20mg/ml的蛋白酶K 40μl，在55℃水浴中消化1h以上，直至組織被完全消化。
(2)加入吸附緩沖液(Binding Buffer)200μl，充分混合，在72℃水浴中保溫10min。
(3)加入異丙醇100μl，充分混合，然后吸去離心管中的不溶物；將高純度過濾管(High Pure Filter Tube)置于收集管(Collection Tube)上，然后將剩余液體轉(zhuǎn)移到高純度過濾管中。
(4)在臺(tái)式高速離心機(jī)上以8000rpm離心1min。
(5)棄去濾出液和收集管，將高純度過濾管置于一個(gè)新的收集管上；向高純度過濾管中加入抑制物去除液(Inhibitor Removal Buffer)500μl，以8000rpm離心1min。
(6)棄去濾出液和收集管，將高純度過濾管置于一個(gè)新的收集管上；向高純度過濾管中加入清洗液(Wash Buffer)500μl，以8000rpm離心1min。
(7)重復(fù)步驟(6)一次。
(8)棄去濾出液，將高純度過濾管再置于同一個(gè)收集管上，以16000rpm離心10s，充分去除殘留的清洗液。
(9)棄去收集管，將高純度過濾管置于一只干凈的1.5ml無菌離心管上。
(10)向高純度過濾管中加入70℃預(yù)熱的洗脫液(Elution Buffer)40μl，以8000rpm離心1min。
(11)濾出液中含有純化出的目的核酸樣品，將離心管置于-20℃?zhèn)溆谩?br> 以上所述組織裂解液、吸附緩沖液、蛋白酶K、高純度過濾管、抑制物去除液、清洗液、洗脫液、收集管均由羅氏診斷公司的高純度PCR模板制備試劑盒提供。
實(shí)施例2大菱鲆紅體病虹彩病毒的分離提純以下離心均在4℃進(jìn)行。取被TRBIV感染的大菱鲆病魚脾臟組織1.7g，用磷酸緩沖液(簡稱PBS，其組成為2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，0.137MNaCl，8.06mM Na2HPO4，pH7.4)洗滌3次，置于玻璃勻漿器中，加入15mlTEN溶液(0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)，在冰上充分研磨。將勻漿液以1500×g離心15min，棄沉淀；取上清液再以5800×g離心30min(HITACHI P50AT2-721角轉(zhuǎn)子)，棄沉淀；取第二次離心得到的上清液，經(jīng)36400×g離心2h，棄上清；將沉淀以TEN溶液完全懸浮，平鋪于預(yù)先制備好的20-60％(w/w)蔗糖濃度梯度上，以HITACHIRPS65T-704水平轉(zhuǎn)子于44000×g超速離心2h。取中間部分，用PBS 10倍稀釋，然后于52600×g離心30min，棄上清，將沉淀溶解在0.3ml PBS中，可以得到較純的病毒制劑。
取一滴純化的病毒溶液置于覆有formvar膜的銅網(wǎng)上，令其吸附3分鐘，然后晾干，再用1％磷鎢酸負(fù)染，最后置于JEM-1200EX型透射電子顯微鏡下觀察、照相。圖3是電鏡下觀測到的純化病毒的照片。
實(shí)施例3TRBIV主要衣殼蛋白基因及其附近核苷酸序列的制備1.含TRBIV DNA的大菱鲆病魚脾組織核酸的提取取感染了TRBIV的大菱鲆病魚脾臟組織50mg，采用羅氏診斷公司的高純度PCR模板制備試劑盒進(jìn)行含病毒DNA的病魚脾組織核酸的提取和純化，具體操作步驟同實(shí)施例1。
2.TRBIV DNA的PCR擴(kuò)增對提取的TRBIV DNA樣品，使用引物iridoF和iridoR進(jìn)行擴(kuò)增。取1個(gè)200μl無菌離心管，在冰浴上操作，加入如下PCR反應(yīng)成分PCR反應(yīng)模板溶液5μl，Taq DNA聚合酶2.5U，四種dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物iridoF和iridoR各50pmol，最后反應(yīng)體系的總體積為100μl。將以上試劑混勻后離心數(shù)秒，頂部覆蓋50μl液體石蠟，置于PCR儀上，按下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；然后94℃2分鐘，57℃1分鐘，72℃1分鐘，35個(gè)循環(huán)；最后72℃7分鐘，1個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增使用英國Thermo Hybaid公司的PCR Express儀進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物在含0.5μg/ml溴化乙啶的1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，置于紫外燈下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。
3.TRBIV PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化和回收PCR擴(kuò)增結(jié)束后，除去礦物油，取80μl TRBIy的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離目標(biāo)片段，用上海華舜凝膠回收試劑盒回收1600bp目標(biāo)片段，具體操作步驟如下(如果沒有特別指示，室溫離心，離心速度為9000×g)(1)割下含DNA的瓊脂糖塊，使它盡可能小，放入1.5ml離心管中稱重。
(2)按每100mg瓊脂糖加入300μl S1液的比例加入S1液，如果瓊脂糖塊重量小于100mg，用雙蒸水補(bǔ)充至100mg，以確保體系總體積不至太小。置50℃水浴10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化，每2分鐘顛倒混勻一次。
(3)加入1/3 S1液體積的異丙醇，混勻。50℃水浴1分鐘，混勻。
(4)將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，靜置2min，離心30s。倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。
(5)在吸附柱中加入500μl W1液，靜置2min，離心15s。倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。
(6)重復(fù)步驟(5)一次。
(7)離心1min。
(8)將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5ml的離心管中，在吸附膜中央加入40μl T1液，50℃水浴保溫5分鐘后，離心3min。離心管中含有回收的目的DNA。
(9)取5μl回收產(chǎn)物電泳定量，計(jì)算回收產(chǎn)物的濃度。
以上所述S1液、吸附柱、收集管、W1液、T1液均由上海華舜凝膠回收試劑盒提供。
4.TRBIV PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的PCR產(chǎn)物克隆試劑盒進(jìn)行，具體操作步驟如下
(1)連接反應(yīng)a.在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的10μl連接反應(yīng)體系中，加入50ng pUCm-T載體、0.2pmol的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(載體∶目標(biāo)片段＝1∶10)、1μl 10×連接緩沖液、1μlPEG4000和1μl的T4 DNA連接酶，其余用水補(bǔ)足。
b.反應(yīng)按以下體系進(jìn)行10×連接緩沖液1μlPEG4000 1μlpUCm-T載體1μl純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 4μl無菌雙蒸水2μlT4 DNA連接酶 1μl總體積10μl注意一般最后加入T4 DNA連接酶。
c.16-23℃連接1h至過夜。
(2)轉(zhuǎn)化a.取100μl E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮。
b.加入5μl連接液，輕輕混勻。冰上放置30min。
c.42℃水浴熱激35s，冰上放置2min。
d.加400μl SOC培養(yǎng)基(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.05％NaCl，2.5mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，20mmol/L葡萄糖，pH7.0)，37℃，200-250rpm震蕩培養(yǎng)1h。
e.室溫下4000rpm離心5min，用微量移液器吸嘴吸掉400μl上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮。
f.將細(xì)菌涂布在預(yù)先用20μl 100mmol/L IPTG和100μl 20mg/mlX-gal涂布的含100μg/ml的氨芐青霉素的SOB平板(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.5％瓊脂，0.05％NaCl，2.5mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，pH7.0)上。
g.平板在37℃正向放置1h以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。
(3)轉(zhuǎn)化子藍(lán)白斑篩選a.當(dāng)外源DNA片段插入到pUCm-T中后，由于外源DNA的存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物β-半乳糖苷酶α片段的活性，因此重組克隆在IPTG/X-gal平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍(lán)色。
b.選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落，用牙簽挑至含100μg/ml氨芐青霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)中，37℃培養(yǎng)過夜。
(4)轉(zhuǎn)化子的酶切鑒定a.將培養(yǎng)過夜的各菌液分別做如下處理取1.5ml菌液置于無菌微量離心管中，4℃暫存供測序之用；取1.0ml菌液置于無菌微量離心管中，加入200μl無菌甘油充分混勻，冷凍于-70℃保種；取1.5ml菌液置于無菌微量離心管中供抽提質(zhì)粒使用。
b.用堿裂解法小規(guī)模制備質(zhì)粒。12000×g離心30s收集菌體，加入100μl冰冷的溶液I(25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，10mmol/L EDTA，50mmol/L葡萄糖)，劇烈震蕩。再加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，快速顛倒離心管5次，置于冰上。再加入150μl用冰預(yù)冷的溶液III(3mol/L乙酸鉀，11.5％冰醋酸)，溫和震蕩使其充分混勻，冰上放置5min，之后12000×g離心5min。將上清轉(zhuǎn)入新的塑料離心管中，加等量酚∶氯仿(1∶1)，震蕩混勻，12000×g離心2min。將上清轉(zhuǎn)入新的塑料離心管中，加2倍體積的乙醇于室溫沉淀DNA，震蕩混合，室溫放置2min。于4℃ 12000×g離心5min，去除上清液，以1ml 70％乙醇于4℃洗滌DNA沉淀，在空氣中干燥10min。最后將沉淀溶解在50μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)中。
c.按以下反應(yīng)體系使用限制性內(nèi)切酶Pst I對純化質(zhì)粒進(jìn)行酶切PstI1μl10×H緩沖液 2μl純化的質(zhì)粒 3μl無菌雙蒸水 14μl總體積 20μld.37℃酶切1.5h。
e.酶切反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)管中加入2μl的10×上樣緩沖液(EDTA 50mM，60％甘油，0.1％二甲苯腈藍(lán)FF，0.1％溴酚藍(lán))，中止反應(yīng)。各取10μl反應(yīng)產(chǎn)物在含0.5μg/ml溴化乙啶的1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，置于紫外燈下觀察，挑選出含1600bp左右插入片段的克隆。
(5)插入片段的序列測定和分析將含目的片段的轉(zhuǎn)化菌液提供給上海博亞生物工程有限公司，使用ABIPRISM TM 377型DNA測序儀以M13通用引物和T7啟動(dòng)子引物對PCR產(chǎn)物雙向測序并進(jìn)行序列拼接，得到1581bp的TRBIV核苷酸序列，如圖1和序列表第1號(hào)序列所示。將該TRBIV核苷酸序列輸入到公共數(shù)據(jù)庫GenBank中，運(yùn)用BlastN程序進(jìn)行DNA序列的搜索和比對，發(fā)現(xiàn)該序列是TRBIV主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列，而且該序列與所有已公開核苷酸序列都不相同，是TRBIV特異性的核苷酸序列。
以上所述pUCm-T載體、10×連接緩沖液、PEG4000、T4 DNA連接酶均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的PCR產(chǎn)物克隆試劑盒提供；限制性內(nèi)切酶Pst I、10×H緩沖液購自寶生物工程(大連)有限公司。
實(shí)施例4PCR引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR的制備在獲得TRBIV主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列的基礎(chǔ)上，使用Omiga 2.0軟件分析該序列，得出MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR的核苷酸組成和排列(如圖1所示的帶下劃線的黑體部分，即304bp-321bp和1084bp-1065bp處)是用于TRBIV擴(kuò)增的最佳PCR引物序列。根據(jù)MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR的核苷酸組成和排列，在商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀上進(jìn)行化學(xué)合成，即可獲得如序列表第5號(hào)序列和序列表第6號(hào)序列所示的核苷酸序列。
實(shí)施例5TRBIV的PCR檢測方法1.PCR模板的制備取待測魚體組織樣品各25-50mg，使用羅氏診斷公司的高純度PCR模板制備試劑盒提取和純化樣品DNA(同實(shí)施例1)。
2.PCR反應(yīng)及電泳檢測取4個(gè)200μl無菌離心管，在冰浴上操作，配制如下PCR反應(yīng)體系各樣品DNA溶液1-2μl，Taq DNA聚合酶1U，四種dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR各10pmol，最后反應(yīng)體系的總體積為20μl。將以上試劑混勻后離心數(shù)秒，頂部覆蓋50μl液體石蠟，置于PCR儀上，運(yùn)行如下PCR反應(yīng)程序94℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；然后94℃2分鐘，59℃1分鐘，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72℃7分鐘，1個(gè)循環(huán)。程序結(jié)束后，除去礦物油，各管中加入2μl 10×上樣緩沖液(EDTA 50mM，60％甘油，0.1％二甲苯腈藍(lán)FF，0.1％溴酚藍(lán))，混勻。取10μl混合物點(diǎn)樣于含0.5μg/ml溴化乙啶的1％瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)果如圖4所示。
圖4的結(jié)果清楚地顯示采用引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR進(jìn)行TRBIV的PCR檢測，感染了TRBIV的大菱鲆脾臟和腎臟組織都呈陽性反應(yīng)，而未感染TRBIV的健康大菱鲆脾臟組織和淋巴囊腫病毒(另一種魚類虹彩病毒)均為陰性反應(yīng)，說明該檢測方法具有特異性，可以清晰、準(zhǔn)確、快速地檢測TRBIV。
實(shí)施例6TRBIV PCR檢測的靈敏度測定取感染了TRBIV的大菱鲆脾組織樣品1g，置于干凈的玻璃勻漿器中，加入10ml磷酸緩沖液(2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，0.137M NaCl，8.06mM Na2HPO4，pH7.4)，在碎冰上充分勻漿，再用磷酸緩沖液10倍梯度稀釋。然后取勻漿液和各梯度稀釋液200μl以及未被TRBIV感染的健康大菱鲆脾臟組織25-50mg，使用羅氏診斷公司的高純度PCR模板制備試劑盒分別提取和純化樣品DNA(同實(shí)施例1)。
取7個(gè)200μl無菌離心管，在冰浴上操作，配制如下PCR反應(yīng)體系各樣品DNA溶液2μl，Taq DNA聚合酶1U，四種dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR各10pmol，最后反應(yīng)體系的總體積為20μl。將以上試劑混勻后離心數(shù)秒，頂部覆蓋50μl液體石蠟，置于PCR儀上，運(yùn)行如下PCR反應(yīng)程序94℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；然后94℃2分鐘，59℃1分鐘，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72℃7分鐘，1個(gè)循環(huán)。程序結(jié)束后，除去礦物油，各管中加入2μl上樣液(EDTA 50mM，60％甘油，0.1％二甲苯腈藍(lán)FF，0.1％溴酚藍(lán))，混勻。取10μl混合物點(diǎn)樣于含0.5μg/ml溴化乙啶的1％瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)果如圖5所示。
從圖5的結(jié)果可以清楚地看出采用引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR進(jìn)行TRBIV的PCR檢測，10-4g、10-5g、10-6g、10-7g感染了TRBIV的大菱鲆脾組織樣品都呈明顯的陽性反應(yīng)；而10-3g未感染TRBIV的健康大菱鲆脾臟組織樣品呈陰性反應(yīng)。以上結(jié)果表明該檢測方法可以從低至10-7g的病魚脾組織中檢測到TRBIV的存在，具有極高的靈敏度。
序列表<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所<120>大菱鲆紅體病虹彩病毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測法<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1581<212>DNA<213>大菱鲆紅體病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus)<220>
<221>CDS<222>(58)..(1419)<223>
<400>1gtgcaggttt ccagaagaaa aacgaggctg gtcatatata aaagtatcac cgtcatc 57atg tct gca atc tta ggt gcg aac gta acc agt ggg ttc atc gac atc105Met Ser Ala Ile Leu Gly Ala Asn Val Thr Ser Gly Phe Ile Asp Ile1 5 10 15tcc gct ttc gat gcg atg gag acc cac ttg tac ggc ggc gac aat gcc153Ser Ala Phe Asp Ala Met Glu Thr His Leu Tyr Gly Gly Asp Asn Ala20 25 30gtg aca tac ttt gcc cgc gag acc gtg cgt agt tcc tgg tac agc aaa201Val Thr Tyr Phe Ala Arg Glu Thr Val Arg Ser Ser Trp Tyr Ser Lys35 40 45cta ccc gtc acc ctg tca aaa cag act ggc cat gcc aat ttc ggc cag249Leu Pro Val Thr Leu Ser Lys Gln Thr Gly His Ala Asn Phe Gly Gln50 55 60gag ttt agt gtg acg gtg gcc agg ggt ggc gac tac ctc att aat gtg297Glu Phe Ser Val Thr Val Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Leu Ile Asn Val65 70 75 80tgg ctg cgt gtt aag atc ccc tcc atc aca tcc agc aag gaa aac agc345Trp Leu Arg Val Lys Ile Pro Ser Ile Thr Ser Ser Lys Glu Asn Ser85 90 95tac att cgc tgg tgt gat aat ctg atg cac aat ctg gtt gag gag gtg393
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65 70 75 80Trp Leu Arg Val Lys Ile Pro Ser Ile Thr Ser Ser Lys Glu Asn Ser85 90 95Tyr Ile Arg Trp Cys Asp Asn Leu Met His Asn Leu Val Glu Glu Val100 105 110Ser Val Ser Phe Asn Asp Leu Val Ala Gln Thr Leu Thr Ser Glu Phe115 120 125Leu Asp Phe Trp Asn Ala Cys Met Met Pro Gly Ser Lys Gln Ser Gly130 135 140Tyr Asn Lys Met Ile Gly Met Arg Ser G1y Leu Val Ser Gly Ile Thr145 150 155 160Asn Gly His Thr Met Pro Ala Thr Tyr Leu Asn Leu Pro Ile Pro Leu165 170 175Phe Phe Thr Arg Asp Thr Gly Leu Ala Leu Pro Thr Val Ser Leu Pro180 185 190Tyr Asn Glu Val Arg Ile His Phe Lys Leu Arg Arg Trp Glu Asp Leu195 200 205Leu Ile Ser Gln Ser Thr Gln Ala Asp Met Ala Ile Ser Thr Val Thr210 215 220Leu Ala Asn Ile Ser Asn Val Ala Pro Ala Leu Thr Asn Val Ser Val225 230 235 240Met Gly Thr Tyr Ala Val Leu Thr Ser Glu Glu Arg Glu Val Val Ala245 250 255Gln Ser Ser Arg Ser Met Leu Ile Glu Gln Cys Gln Val Ala Pro Arg260 265 270Val Pro Val Thr Pro Ala Asp Asn Ser Leu Val His Leu Asp Leu Arg275 280 285Phe Ser His Pro Val Lys Ala Leu Phe Phe Ala Val Lys Asn Val Thr290 295 300His Arg Asn Val Gln Ser Asn Tyr Thr Ala Ala Ser Pro Val Tyr Val305 310 315 320Asn Asn Lys Val Asn Leu Pro Leu Leu Ala Thr Asn Pro Leu Ser Glu325 330 335Val Ser Leu Ile Tyr Glu Asn Thr Pro Arg Leu His Gln Met Gly Val340 345 350Asp Tyr Phe Thr Ser Val Asp Pro Tyr Tyr Phe Ala Pro Ser Met Pro355 360 365Glu Met Asp Gly Val Met Thr Tyr Cys Tyr Thr Leu Asp Met Gly Asn370 375 380Ile Asn Pro Met Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Arg Leu Ser Asn Val Thr385 390 395 400Leu Ser Cys Lys Val Ser Asp Asn Ala Lys Lys Thr Ala Ala Gly Gly405 410 415Gly Thr Asn Gly Ser Gly Tyr Thr Val Ala Gln Lys Phe Glu Leu Val
420 425 430Val Ile Ala Val Asn Hi s Asn Ile Met Lys Ile Ala Asp Gly Ala Ala435 440 445Gly Phe Pro Ile Leu450<210>3<211>18<212>DNA<213>大菱鲆紅體病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus)<400>3gtgcaggttt ccagaaga18<210>4<211>19<212>DNA<213>大菱鲆紅體病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus)<400>4catggtacgt aacgcatag 19<210>5<211>18<212>DNA<213>大菱鲆紅體病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus)<400>5cgtgttaaga tcccctcc18<210>6<211>20<212>DNA<213>大菱鲆紅體病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus)<400>6tctcgtaaat gagtgacacc 20
權(quán)利要求
1.一種大菱鲆紅體病虹彩病毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測法，其特征是它的方法包括下列三部分1).提供一段用于鑒別該病毒的特異性核苷酸序列；2).提供一對用于檢測該病毒的PCR引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR；3).提供一種該病毒的PCR檢測方法，包括反應(yīng)模板的制備、PCR反應(yīng)體系、PCR反應(yīng)程序、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測和結(jié)果判斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大菱鲆紅體病虹彩病毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測法，其特征在于所述的用于鑒別該病毒的特異性核苷酸序列，是一段全長為1581個(gè)核苷酸的線性雙鏈DNA序列，該序列是大菱鲆紅體病虹彩病毒的主要衣殼蛋白基因及其附近的核苷酸序列，該序列的第58個(gè)核苷酸至第1419個(gè)核苷酸編碼一個(gè)含453個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，即該病毒的主要衣殼蛋白；該特異性核苷酸序列為GTGCAGGTTT CCAGAAGAAA AACGAGGCTG GTCATATATA AAAGTATCAC CGTCATCATGTCTGCAATCT TAGGTGCGAA CGTAACCAGT GGGTTCATCG ACATCTCCGC TTTCGATGCGATGGAGACCC ACTTGTACGG CGGCGACAAT GCCGTGACAT ACTTTGCCCG CGAGACCGTGCGTAGTTCCT GGTACAGCAA ACTACCCGTC ACCCTGTCAA AACAGACTGG CCATGCCAATTTCGGCCAGG AGTTTAGTGT GACGGTGGCC AGGGGTGGCG ACTACCTCAT TAATGTGTGGCTGCGTGTTA AGATCCCCTC CATCACATCC AGCAAGGAAA ACAGCTACAT TCGCTGGTGTGATAATCTGA TGCACAATCT GGTTGAGGAG GTGTCGGTGT CATTTAACGA CCTGGTGGCACAGACCCTGA CCAGCGAGTT CCTCGACTTT TGGAACGCCT GCATGATGCC CGGCAGCAAACAGTCTGGCT ATAACAAGAT GATTGGCATG CGCAGCGGCC TGGTCTCCGG TATCACCAACGGTCACACTA TGCCTGCTAC CTACCTCAAT TTGCCCATCC CCCTCTTCTT CACCCGCGACACAGGCCTTG CATTGCCCAC CGTGTCTCTG CCGTACAACG AGGTGCGCAT CCACTTCAAGCTGCGGCGCT GGGAGGACCT GCTCATCAGC CAGAGCACCC AGGCCGACAT GGCCATCTCGACCGTCACCC TGGCCAACAT TAGCAATGTA GCACCCGCGT TGACCAACGT TTCCGTGATGGGCACCTACG CTGTGCTGAC AAGTGAGGAG CGCGAGGTGG TGGCCCAGTC TAGCCGTAGCATGCTCATTG AACAGTGCCA GGTGGCGCCT CGTGTGCCCG TCACACCCGC AGACAATTCCTTGGTGCATC TGGACCTCAG GTTCAGTCAT CCCGTCAAGG CCTTGTTCTT TGCAGTAAAGAACGTCACCC ACCGCAACGT GCAAAGCAAT TACACCGCGG CCAGTCCCGT GTATGTCAACAACAAGGTCA ATCTGCCTTT GCTGGCCACC AATCCCCTGT CCGAGGTGTC ACTCATTTACGAGAACACCC CTCGGCTCCA CCAGATGGGA GTAGACTACT TCACATCCGT CGACCCCTACTACTTTGCGC CCAGCATGCC TGAGATGGAC GGTGTTATGA CCTACTGCTA TACCCTGGACATGGGCAATA TCAACCCCAT GGGCTCGACC AACTACGGCC GCCTGTCCAA CGTCACCCTGTCATGTAAGG TGTCGGACAA CGCCAAGAAA ACAGCAGCGG GCGGCGGAAC CAACGGCAGCGGCTACACGG TCGCCCAAAA GTTTGAACTG GTCGTTATTG CAGTCAACCA CAACATCATGAAGATTGCTG ACGGCGCTGC AGGCTTCCCT ATCCTGTAAG CAATGGACTG CCCAGTGTGTCTGGCAGCCA TGTCGGAGCC GTATGTATTA AATTGCGGCC ATAGCGTATG CAAGGCATGCTGTGATAAGC TTGGGCCCAC GTGTTGTGTG TGCCGCACTG TCATCACAAG CAGAGCCACCAACTATGCGT TACGTACCAT G
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大菱鲆紅體病虹彩病毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測法，其特征在于所述的用于檢測該病毒的一對PCR引物，即MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR，是以該病毒的特異性核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的，它們是兩個(gè)長度分別為18和20個(gè)核苷段的線性單鏈DNA，分別與該病毒的主要衣殼蛋白基因及其附近的1581bp的核苷酸片段的304bp-321bp和1084bp-1065bp處的核苷酸序列相同或互補(bǔ)，其核苷酸序列分別為MCP-TRBIVF5’CGTGTTAAGATCCCCTCC 3’和MCP-TRBIVR5’TCTCGTAAATGAGTGACACC 3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大菱鲆紅體病虹彩病毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測法，其特征在于所述的該病毒PCR檢測方法，首先從待測樣品中制備反應(yīng)模板，配制PCR反應(yīng)體系，利用PCR反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增，最后通過電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物來檢測樣品中的該病毒，如果出現(xiàn)780堿基對的特異性目標(biāo)條帶，則該樣品的大菱鲆紅體病虹彩病毒檢測結(jié)果為陽性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的大菱鲆紅體病虹彩病毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測法，其特征在于所述的PCR反應(yīng)體系為模板DNA溶液1-2μl，Taq DNA聚合酶1U，四種dNTP各250μM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，KCl 40mM，MgCl21.5mM，引物MCP-TRBIVF和MCP-TRBIVR各10pmol，最后反應(yīng)體系的總體積為20μl；所述的PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5分鐘，1個(gè)循環(huán)；然后94℃2分鐘，59℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 7分鐘，1個(gè)循環(huán)。
全文摘要
一種大菱鲆紅體病虹彩病毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測法，屬于魚類病毒檢測方法。該方法主要包括以下內(nèi)容1.一段用于鑒別大菱鲆紅體病虹彩病毒的特異性核苷酸序列；2.一對用于檢測大菱鲆紅體病虹彩病毒的PCR引物MCP－TRBIVF和MCP－TRBIVR；3.一種利用引物MCP－TRBIVF和MCP－TRBIVR檢測大菱鲆紅體病虹彩病毒的PCR方法，具體步驟包括反應(yīng)模板的制備、PCR反應(yīng)體系、PCR反應(yīng)程序、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測和結(jié)果判斷。本發(fā)明具有方便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，可對魚苗、成魚和飼料中是否存在大菱鲆紅體病虹彩病毒進(jìn)行檢定，也可以用于大菱鲆紅體病虹彩病毒的流行情況調(diào)查。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1635161SQ200410085399
公開日2005年7月6日 申請日期2004年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月25日
發(fā)明者史成銀, 王印庚, 黃倢, 王清印 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所