專(zhuān)利名稱：新的鏈霉菌菌株及其相關(guān)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的東方鏈霉菌(Streptomyces orientalis)及產(chǎn)黑鏈霉菌(Streptomyces melanogenes)菌株，及其用途。
有許多種昆蟲(chóng)會(huì)造成農(nóng)業(yè)上重大經(jīng)濟(jì)損失，并在植物之間散播病害，粉虱為全世界最?lèi)好颜玫霓r(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一。例如1981年時(shí)，煙草粉虱(Bemisia tabaci)(Gennadius)造成美國(guó)棉花、葫蘆及萵苣1億美元損失。1986年時(shí)，粉虱成為佛羅里達(dá)州的問(wèn)題，煙草粉虱使佛州價(jià)值800至1000萬(wàn)美元的圣誕紅受到約2百萬(wàn)美元的損失。
現(xiàn)在已知粉虱啃食500種以上不同的植物。例如番薯、番茄、豆類(lèi)、棉花、胡蘿卜、樹(shù)薯、南瓜類(lèi)、萵苣、辣椒、茄子、西瓜、及小黃瓜為這種害蟲(chóng)的公知宿主。亦已知煙草粉風(fēng)會(huì)傳播70種以上蟲(chóng)病毒與微生物引起的病害。
1991年時(shí)，臺(tái)灣首次出現(xiàn)銀葉粉虱(B.argentifolii Bellows及Perring)。1995年時(shí)，銀葉粉虱造成臺(tái)灣1000公頃的農(nóng)業(yè)損失。
粉虱很難利用公知的殺蟲(chóng)劑施藥法控制。有許多因素造成殺蟲(chóng)劑防治工作上的漏洞。只有少數(shù)幾種殺蟲(chóng)劑商品可有效控制粉虱。然而，這些殺蟲(chóng)劑必須一周徹底施用數(shù)次才有效。此外，粉虱的大部份生命期都留在葉子背面；因此，種植者必須調(diào)整他們的操作法才可提高除蟲(chóng)劑的覆蓋范圍。植物之間隙必須足使化學(xué)噴灑劑可滲入樹(shù)頂并到達(dá)植物所有表面。
此外，無(wú)效率的使用化學(xué)除蟲(chóng)劑耗費(fèi)成本，并有其他顯著缺點(diǎn)，如環(huán)境污染，且對(duì)農(nóng)民及消費(fèi)者有潛在健康危害。
因此需要更安全且更有效的防治粉虱方法。雖然生物性防治劑已研究有年，但目前仍無(wú)生物性防治劑商品可以成功防治粉虱。
USP 4,942,030及USP 5,413,784揭示利用真菌玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)及白僵菌(Beauveria bassiana)防治煙草粉虱。
鏈霉菌屬已廣泛用于制造抗生素，然而迄今仍未鑒定出具有對(duì)抗粉虱的生物性殺蟲(chóng)活性的鏈霉菌屬。
現(xiàn)已驚人地發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬新菌株，稱為東方鏈霉菌Y31014及產(chǎn)黑鏈霉菌Y31042-1，這些菌株具有對(duì)抗粉虱的活性。
因此，本發(fā)明一方面提供新菌株?yáng)|方鏈霉菌Y31014及產(chǎn)黑鏈霉菌Y31042-1。
本發(fā)明第二方面提供含該新菌株的生物性殺蟲(chóng)劑組合物。
本發(fā)明另一方面，提供經(jīng)由害蟲(chóng)與新菌株接觸來(lái)防治害蟲(chóng)的方法。
微生物之鑒定與特性分析新的Y31014及Y31042-1菌株是自臺(tái)灣省苗栗地區(qū)的土壤樣本中分離。這些微生物經(jīng)過(guò)臺(tái)灣省新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所鑒定，分別為東方鏈霉菌及產(chǎn)黑鏈霉菌。其方法與結(jié)果如下采用國(guó)際鏈霉菌計(jì)劃(International Streptomyces Project)(ISP)為分析鏈霉菌屬特性所建議的方法分析分類(lèi)學(xué)與形態(tài)學(xué)特性。
1．細(xì)胞壁分析取干細(xì)胞(10毫克)置入含1毫升6N HCl的試管中，于100℃下水解18小時(shí)。水解液過(guò)濾及干燥。干粉溶于0.4毫升蒸餾水中，倒至PTLC板上。采用甲醇-H2O-6N HCl-吡啶作為展開(kāi)溶液。然后在風(fēng)干后施用茚三酮。二氨基庚二酸(DAP)產(chǎn)生黃綠色，而其他氨基酸則產(chǎn)生紫紅色。參見(jiàn)柯馬加塔(Komagata)等人，“細(xì)胞分類(lèi)的脂質(zhì)與細(xì)胞壁分析法”(Lipid and Cell Wall Analysis in BacterialSystematics),Meth.Microbiol.19:161-207(1987)。
2．全細(xì)胞糖分析法取干細(xì)胞(50毫克)置入含1毫升1N H2SO4的試管中，于100℃下水解2小時(shí)。利用飽和Ba(OH)2調(diào)整水解液pH至5.0-5.5的范圍內(nèi)。水解液離心，收集上層懸浮液，并濃縮。濃縮物溶于0.4毫升蒸餾水中，然后點(diǎn)至濾紙上。采用N-甲醇-H2O-吡啶-甲苯作為展開(kāi)溶液。施用苯胺酞酸酯使糖類(lèi)顯色。6碳糖在風(fēng)干后產(chǎn)生褐色，5碳糖則產(chǎn)生粉紅色。參見(jiàn)柯馬加塔等人，“細(xì)菌分類(lèi)學(xué)的脂質(zhì)及細(xì)胞壁分析法”，Meth.Microbiol.19:161.207(1987)。
3．菌株培養(yǎng)特性分析細(xì)胞分別于酵母提取物-麥芽汁瓊脂(ISP#2培養(yǎng)基)、燕麥粉瓊脂(ISP#3培養(yǎng)基)、無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂(ISP#4培養(yǎng)基)及甘油-天冬酰胺瓊脂(ISP#5培養(yǎng)基)中培養(yǎng)14天，以觀察營(yíng)養(yǎng)菌絲質(zhì)量、氣生菌絲質(zhì)量、孢子產(chǎn)量及色素產(chǎn)量。參見(jiàn)希林(Shiring)等人，“鏈霉菌菌種的特性分析方法”，Int.J.Syst.Bacteriol.,16:313-340(1966)。
4．黑色素產(chǎn)生分析法取細(xì)胞于胰蛋白胨-酵母提取物營(yíng)養(yǎng)液(ISP#1培養(yǎng)基)、蛋白胨-酵母提取物瓊脂(ISP#6培養(yǎng)基)及酪氨酸瓊脂(ISP#7培養(yǎng)基)中分別培養(yǎng)7及14天，觀察黑色素生產(chǎn)情形。參見(jiàn)希林等人，“鏈霉菌菌種的特性分析方法”，Int.J.Syst.Bacteriol.,16:313-340(1966)。
5．形態(tài)特征分析自ISP#2、3、4與5培養(yǎng)基連同瓊脂切下細(xì)胞，于烘箱中脫水，于離子涂布機(jī)上涂布黃金。采用掃描式電子顯微鏡(SEM)研究形態(tài)。
6．糖類(lèi)的利用與生理特性分析細(xì)胞于含1％糖(D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖、D-果糖、鼠李糖、棉子糖、I-肌醇、D-甘露糖醇、纖維素、柳醇)的ISP#9培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞7及14天，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)。參見(jiàn)希林等人，“鏈霉菌屬的特性分析方法”，Int.J.Syst.Bacteriol.,16:313-340(1966)。
結(jié)果示于表1至4。 表2．Y31014的生理特性碳源Y31014D-葡萄糖 +*D-木糖+D-果糖+蔗糖 -L-阿拉伯糖+鼠李糖-棉子糖+D-甘露糖醇+I-肌醇+纖維素-柳醇 +*+陽(yáng)性反應(yīng)，-陰性反應(yīng) 表4．Y31042-1的生理特性碳源 Y31042-1D-葡萄糖+*D-木糖 +D-果糖 +蔗糖-L-阿拉伯+鼠李糖 -棉子糖 +D-甘露糖醇 +I-肌醇 +纖維素 -柳醇-*+陽(yáng)性反應(yīng)，-陰性反應(yīng)細(xì)胞壁氨基酸與全細(xì)胞糖類(lèi)分析法Y31014與Y31042-1二種菌種的細(xì)胞壁氨基酸與全細(xì)胞糖含量分別為L(zhǎng)L-DAP及葡萄糖、核糖。根據(jù)李希瓦烈(Lechevalier)等人“放線菌類(lèi)的化學(xué)分類(lèi)學(xué)”(The Chemotaxonomy ofActinomycetes),A.狄茲(Dieiz)與D.W.泰爾(Thayer)(編輯)的“放射菌類(lèi)分類(lèi)學(xué)”SIM特別公告No.6,USA的說(shuō)明分類(lèi)，這些菌種屬于化學(xué)型IC，歸為鏈霉菌屬。
品種鑒定與菌種的標(biāo)準(zhǔn)分離株比較時(shí)(Actinobase及細(xì)菌分類(lèi)學(xué)國(guó)際期刊(International Journal of systematic Bacteriology))顯示Y31014與東方鏈霉菌最相關(guān)，且Y31042-1與產(chǎn)黑鏈霉菌最相關(guān)。
保藏資料東方鏈霉菌Y31014及產(chǎn)黑鏈霉菌Y31042-1培養(yǎng)物已根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1999年8月20日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209,USA)，保藏號(hào)分別為ATCC PTA-558及PTA-557。
本發(fā)明提供了東方鏈霉菌Y31014及產(chǎn)黑鏈霉菌Y31042-1的生物性純培養(yǎng)物。
現(xiàn)有技術(shù)已知可在不改變其特性下得到微生物突變種。例如突變種可得自化學(xué)或物理性突變劑的處理，如UV光、X-射線、γ-射線及化學(xué)物質(zhì)如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍?，F(xiàn)有技術(shù)亦已知可利用例如篩選母菌株的培養(yǎng)物得到天然變異株。因此，本發(fā)明亦涉及東方鏈霉菌Y31014與產(chǎn)黑鏈霉菌Y31042-1中仍保留該菌株特性的突變株或變異株。
新的東方鏈霉菌Y31014及產(chǎn)黑鏈霉菌Y31042-1單離株為首次已知對(duì)粉虱有高度毒性的鏈霉菌。
東方鏈霉菌Y31014及產(chǎn)黑鏈霉Y31042-1會(huì)附著并隨后滲入昆蟲(chóng)宿主的外皮。滲入目標(biāo)害蟲(chóng)外皮后，茵絲體開(kāi)始進(jìn)入宿主組織，瀕死的昆蟲(chóng)則長(zhǎng)滿了菌絲體。孢子在宿主的外表面產(chǎn)生。這些孢子會(huì)分散并感染新宿主害蟲(chóng)。
東方鏈霉菌Y31014及產(chǎn)黑鏈霉菌Y31042-1作用迅速，在施用3至7天內(nèi)，殺死四齡若蟲(chóng)階段銀葉粉虱的效果達(dá)顯著的100％。當(dāng)培養(yǎng)液稀釋率達(dá)10-3時(shí)，可殺死高至70％的害蟲(chóng)?？墒褂玫臐舛葹槊亢辽d體約7×109至7×106CFU。
根據(jù)施用的目的，發(fā)酵的培養(yǎng)液可直接使用或調(diào)配成適合噴灑、霧化、撒粉、撒播或澆注的組合物使用。例如組合物可調(diào)配成現(xiàn)成可噴灑的溶液、可濕性粉末、懸浮液、高濃縮水性、油性或其他性質(zhì)的懸浮液或勻散液、乳液、油勻散液、糊劑、細(xì)粉或粒劑。當(dāng)施用時(shí)，培養(yǎng)液與本發(fā)明組合物可直接接施用至昆蟲(chóng)、植物葉部或其周?chē)h(huán)境。
制備生物性殺蟲(chóng)劑組合物時(shí)，可由生長(zhǎng)培養(yǎng)基排除水份，得到微生物的純培養(yǎng)物。組合物可依已知方式制備，例如以農(nóng)業(yè)上可接受的載體、輔劑或稀釋劑補(bǔ)充活性成份，如不會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)的乳化劑、勻散劑或表面活性劑。
適用于本發(fā)明的載體包括(但不限于)天然或合成礦物磨粉，例如方解石、滑石、硅藻土、蒙脫土、活性白土，等等。為了改善組合物的物理性質(zhì)，可添加高分散性的硅酸鹽或高分散性的吸收性聚合物。
適用于本發(fā)明的乳化劑包括(但不限于)非離子性與陰離子性乳化劑，例如聚氧乙烯脂肪醇醚，烷基磺酸酯、芳基磺酸酯，等等。
適用于本發(fā)明的勻散劑包括(但不限于)木質(zhì)素-亞硫酸鹽廢液及甲基纖維素，等等。
合適的表面活性劑包括(但不限于)揭示于麥肯奇的清潔劑與乳化劑手冊(cè)(McCutcheon’s Detergents and Emul sifiers Annual,MC出版公司,Glen Rock,New Jersey,1988)；及表面活性劑百科全書(shū)(Encyclopedia ofSurfactants),Vol,Ⅰ-Ⅲ(Chemical出版公司，紐約,1980-1981)中的公知表面活性劑。
本發(fā)明的生物性殺蟲(chóng)劑組合物是針對(duì)粉虱Bemisia，因此可用于防治及預(yù)防由例如蚜蟲(chóng)、葉蟬及粉虱所傳播的毒素病。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)液亦可與粉末或顆粒載體組合施用。當(dāng)噴灑施用時(shí)，粉末或顆粒調(diào)配物可直接施用至昆蟲(chóng)，植物葉部或周?chē)h(huán)境。為了制備可混合粉末或顆粒載體的微生物純培養(yǎng)物，可排除生長(zhǎng)培養(yǎng)基的水份，與不抑制微生物生長(zhǎng)的任何其他顆?；蚍勰┎牧辖M合。雖然微生物可與顆粒載體組合施用，但若載體與發(fā)酵的培養(yǎng)液均勻混合時(shí)，可更方便且更均勻施用。本發(fā)明的生物性殺蟲(chóng)劑組合物使施用的混合物包含微生物孢子與菌絲體及載體。孢子與菌絲體二者的存在會(huì)促進(jìn)群集在目標(biāo)昆蟲(chóng)上。
實(shí)施例1菌種Y31014與Y31042-1的篩選先將保存的微生物移至PDA平板上，于30℃下培養(yǎng)7天。自PDA平板上取出十分之一的微生物，接種至含100毫升NGY培養(yǎng)基(NB8克，葡萄糖10克，酵母萃出物5克，水1升)的500毫升圓底燒瓶中。微生物于30℃,200rpm下培養(yǎng)24小時(shí)。取5毫升培養(yǎng)物移至另一個(gè)含100毫升SSM331(玉米淀粉30克，黃豆蛋白30克，糖蜜10克，水1升)培養(yǎng)基的500毫升圓底燒瓶中，培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)物稀釋并準(zhǔn)備用于活性選拔試驗(yàn)。
在載玻片上放置二排四齡若蟲(chóng)階段的銀葉粉虱，每一排含有5只幼蟲(chóng)，間隔1公分。取3微升依上述制備的各稀釋培養(yǎng)物滴在各幼蟲(chóng)上。載玻片置入含1毫升水濾膜的9公分培養(yǎng)皿中。3至7天后，以顯微鏡觀察結(jié)果。
于前3天時(shí)發(fā)現(xiàn)死亡率并不高。7天后，在10-2稀釋率下，經(jīng)Y31014及Y3104-1菌株處理的幼蟲(chóng)死亡率為100％。在受Y31014菌感染死亡的粉虱身體上發(fā)現(xiàn)白色群落。受Y31042-1菌株感染的蟲(chóng)體只發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾個(gè)群落，但整只幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)呈紅褐色。
實(shí)施例2Y31014與Y31042-1菌株的活性研究為了測(cè)定導(dǎo)致粉虱死亡的有效物質(zhì)(群)是否為Y31014及Y31042-1菌株產(chǎn)生的抗生素物質(zhì)，或?yàn)樵撐⑸锉旧硭?，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。
取Y31014及Y31042-1菌培養(yǎng)物于15000 rpm下離心15分鐘，分開(kāi)收集上清液及沉淀塊供進(jìn)一步試驗(yàn)。此外，亦制備Y31041及Y31042-1菌株的經(jīng)滅菌培養(yǎng)物，或以丙酮或乙酸乙酯提取的培養(yǎng)物。將這些樣本依實(shí)例2說(shuō)明的方法施用至粉虱上。結(jié)果示于表5與6。
表5Y31014菌種 死亡率(％)*250× 500×750× 1000×培養(yǎng)液 9060 50 50上清液 5060 50 50沉淀塊 9070 70 70經(jīng)滅菌培養(yǎng)物 0 000丙酮提取物 0 000乙酸乙酯提取物 0 000*稀釋率表6Y31042-1菌種死亡率(％)*100× 250× 500×培養(yǎng)液 6050 40上清液 0 00沉淀塊 7070 10經(jīng)滅菌培養(yǎng)物 0 00丙酮提取物 0 00乙酸乙酯提取物 0 00*稀釋率由表6可見(jiàn)，Y31042-1菌株的生物活性僅出現(xiàn)在培養(yǎng)液及沉淀塊中。根據(jù)表5，生物活性存在于Y31014菌株的上清液中，然而，其活性較低，且在尸體上發(fā)現(xiàn)白色群落。因此認(rèn)為Y31014與Y31042-1菌株培養(yǎng)物的有效物質(zhì)為微生物本身。Y31014菌上清液的生物活性主要是源自無(wú)法利用離心法完全分離的孢子。
權(quán)利要求
1．一種微生物東方鏈霉菌(Streptomyces orientalis)Y31014的生物性純培養(yǎng)物，或其突變株或變異株。
2．如權(quán)利要求1所述的微生物，其保藏號(hào)為ATCC PTA-558。
3．一種微生物產(chǎn)黑鏈霉菌(Streptomyces melanogenes)Y31042-1的生物性純培養(yǎng)物，或其突變株或變異株。
4．如權(quán)利要求3所述的微生物，其保藏號(hào)為ATCC PTA-557。
5．一種生物殺蟲(chóng)劑組合物，其包含有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的生物性純培養(yǎng)物及農(nóng)業(yè)上可接受的載體。
6．一種防治目標(biāo)害蟲(chóng)的方法，其包括施用有效量的至少一種如權(quán)利要求1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的生物性純培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及可有效控制粉虱的東方鏈霉菌(Streptomyces orientalis)Y31014及產(chǎn)黑鏈霉菌(Streptomycesmelanogenes)Y31042－1分離株。本發(fā)明亦涉及新的生物性殺蟲(chóng)劑及其于防治有害生物上的用途。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1318642SQ0010599
公開(kāi)日2001年10月24日 申請(qǐng)日期2000年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月18日
發(fā)明者郭曼娫, 向明, 賴麗秀 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心