一種節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，包括以下步驟：(1)以節(jié)瓜種子滅菌后接種于基本培養(yǎng)基中形成無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗莖尖，轉(zhuǎn)接入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復(fù)繼代培養(yǎng)，擴(kuò)大繁殖，建立節(jié)瓜無(wú)性繁殖系；(2)用鐮刀菌酸作為離體脅迫劑與所述節(jié)瓜不定芽分化培養(yǎng)基配制篩選培養(yǎng)基，對(duì)已建立的節(jié)瓜無(wú)性繁殖系進(jìn)行抗性離體篩選，獲得具有對(duì)鐮刀菌酸抗性的無(wú)性繁殖系；(3)將具有抗性的無(wú)性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，形成再生植株，即為抗性變異體。本發(fā)明不僅篩選出的變異體抗性強(qiáng)，而且選擇效率高，選擇效果好。
【專利說(shuō)明】
一種節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 節(jié)瓜是華南地區(qū)有優(yōu)勢(shì)的特色蔬菜，節(jié)瓜枯萎病是節(jié)瓜的主要病害之一，給節(jié)瓜 生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。由于枯萎病菌在土壤中存活時(shí)間可達(dá)3年以上，通過(guò)輪作等栽培措施 難以從根本上消除病害的影響。選育節(jié)瓜抗枯萎病品種是解決節(jié)瓜枯萎病危害問(wèn)題的根本 途徑。由于節(jié)瓜遺傳資源比較狹窄，目前節(jié)瓜種質(zhì)資源中抗枯萎病材料較為缺乏，已成為節(jié) 瓜抗枯萎病育種的瓶頸。
[0003] 節(jié)瓜枯萎病是由鐮刀菌屬病菌引起的真菌性病害。鐮刀菌侵入植物體內(nèi)，可以分 泌毒素鐮刀菌酸，對(duì)寄主植物產(chǎn)生毒害，使后者枯萎，直至死亡。常規(guī)的抗枯萎病材料篩選 的方法是田間自然篩選或苗期人工接種篩選。田間自然篩選在病害自然發(fā)生時(shí)，在田間感 病群體中選擇發(fā)病輕或未發(fā)病的個(gè)體進(jìn)行繁殖，以獲得抗病材料；這種方法的缺點(diǎn)是依賴 于病害的自然發(fā)生，病害輕的年份無(wú)法開(kāi)展工作；苗期人工接種篩選是在苗期將人工培養(yǎng) 的病菌接種到植株上，待群體發(fā)病時(shí)，從中選取未發(fā)病或發(fā)病輕的個(gè)體進(jìn)行培育，繁殖，進(jìn) 而獲得抗病植株；這種方法可以克服對(duì)病害自然發(fā)生的依賴，但仍會(huì)受季節(jié)限制，必須在適 宜發(fā)病的季節(jié)進(jìn)行接種鑒定，選擇效率相對(duì)較低，同時(shí)如果群體較小，或群體中變異較少， 也難以達(dá)到預(yù)期的選擇效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種選擇效率高，選擇效果好的節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離 體篩選方法。
[0005] 本發(fā)明的目的可通過(guò)以下的技術(shù)步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0006] (1)以節(jié)瓜種子滅菌后接種于1/2MS基本培養(yǎng)基中形成無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗莖尖， 轉(zhuǎn)接入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復(fù) 繼代培養(yǎng)，擴(kuò)大繁殖，建立節(jié)瓜無(wú)性繁殖系；
[0007] (2)用鐮刀菌酸作為離體脅迫劑與所述節(jié)瓜不定芽分化培養(yǎng)基配制篩選培養(yǎng)基， 對(duì)已建立的節(jié)瓜無(wú)性繁殖系進(jìn)行抗性離體篩選，獲得具有對(duì)鐮刀菌酸抗性的無(wú)性繁殖系；
[0008] (3)將具有抗性的無(wú)性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，形成再生 植株，即為抗性變異體。
[0009] 本發(fā)明步驟（1)中的不定芽分化培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤至 4~6mg/L，吲噪乙酸至0. 1~0. 2mg/L配制而成，無(wú)菌苗莖尖在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng) 18~22天，培養(yǎng)條件為室溫23°C~27°C，每日光照10~14小時(shí)。
[0010] 本發(fā)明步驟（2)中的篩選培養(yǎng)基是在所述不定芽分化培養(yǎng)基中加入經(jīng)過(guò)濾滅菌 的鐮刀菌酸溶液，使之最終鐮刀菌酸濃度為75~100mg/L。
[0011] 本發(fā)明步驟（2)中的具體篩選過(guò)程為將繼代1~2次的節(jié)瓜不定芽接種至篩選培 養(yǎng)基中，在25±2°C，每日光照10~14小時(shí)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，15~18天后將尚存活的不 定芽轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，由此不定芽分化增殖所獲得的無(wú)性繁殖系具 有對(duì)鐮刀菌酸的抗性。
[0012] 本發(fā)明步驟（3)中的生根培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基加入吲哚乙酸至0. 3~0. 8mg/ L而成。
[0013] 選用廣東地方品種"黑毛節(jié)瓜"無(wú)菌苗增殖的不定芽，以鐮刀菌酸濃度為75mg/ L~100mg/L篩選培養(yǎng)基篩選的變異體經(jīng)3代恢復(fù)和增殖，回接到含鐮刀菌酸濃度為50~ 100mg/L的篩選培養(yǎng)基上再次篩選，以同源的未經(jīng)篩選的細(xì)胞系為對(duì)照。表1結(jié)果表明，變 異體對(duì)鐮刀菌酸（FA)的抗性明顯增強(qiáng)。
[0014] 表1經(jīng)篩選的細(xì)胞系對(duì)FA抗性的提高
[0015]
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 1、田間自然篩選方法應(yīng)用的前提是田間必須有節(jié)瓜枯萎病發(fā)生，同時(shí)發(fā)病群體的 大小、病害發(fā)生的嚴(yán)重程度均會(huì)影響選擇效果；抗枯萎病變異體離體篩選在離體外加脅迫 的條件下進(jìn)行篩選，脅迫壓力可以人工控制，不受自然氣候條件及病害是否發(fā)生的限制，并 且可以連續(xù)進(jìn)行脅迫，可以更快地篩選出具有強(qiáng)抗性的材料。
[0018] 2、與苗期人工接種篩選方法相比，抗枯萎病變異體離體篩選在無(wú)菌條件下進(jìn)行培 養(yǎng)，不僅可以節(jié)省土地，還可以避免因人工接種不慎而導(dǎo)致病菌污染環(huán)境。
[0019] 3、田間自然篩選方法與苗期人工接種篩選方法受季節(jié)和溫度影響，每年通常只能 在適宜節(jié)瓜生長(zhǎng)的季節(jié)進(jìn)行篩選；而抗枯萎病變異體離體篩選在人工控制光溫條件下進(jìn) 行，不受季節(jié)和氣候的限制，篩選工作可以連續(xù)進(jìn)行，顯著提高了選擇效率。
[0020] 4、田間自然篩選方法與苗期人工接種篩選方法均是在植株個(gè)體水平進(jìn)行抗性篩 選，而抗枯萎病變異體離體篩選方法是在組織和細(xì)胞水平進(jìn)行抗性篩選，選擇群體大，且與 種子形成的群體相比無(wú)性繁殖系群體的變異幅度較大，因而目標(biāo)性狀出現(xiàn)的幾率較大，可 以獲得更好的選擇效果。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例一
[0022] (1)將MS基本培養(yǎng)基中的各組分的濃度減半配制得到1/2MS培養(yǎng)基；以節(jié)瓜種子 滅菌后接種于1/2MS培養(yǎng)基中形成無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗莖尖；
[0023] (2)在MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤至5mg/L，吲哚乙酸至0· lmg/L配制成 不定芽分化培養(yǎng)基，將步驟（1)中切取的無(wú)菌苗莖尖轉(zhuǎn)接入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢 生不定芽，無(wú)菌苗莖尖在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，培養(yǎng)條件為室溫25°C，每目光照 12小時(shí)；此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復(fù)繼代培養(yǎng)，擴(kuò)大繁殖，建立節(jié)瓜無(wú)性繁 殖系；
[0024] (3)在所述不定芽分化培養(yǎng)基中加入經(jīng)過(guò)濾滅菌的鐮刀菌酸溶液（Fusaric Acid， 簡(jiǎn)稱FA)至85mg/L配成篩選培養(yǎng)基，對(duì)步驟（2)中已建立的節(jié)瓜無(wú)性繁殖系進(jìn)行抗性離體 篩選，具體篩選過(guò)程為：將繼代1~2次的節(jié)瓜不定芽接種至篩選培養(yǎng)基中，在25°C，每日 光照12小時(shí)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，16天后將尚存活的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基上進(jìn)行 恢復(fù)培養(yǎng)，由此不定芽分化增殖所獲得的無(wú)性繁殖系具有對(duì)鐮刀菌酸的抗性；
[0025] (4)在MS基本培養(yǎng)基加入吲哚乙酸至0· 6mg/L配成生根培養(yǎng)基，將上述具有抗性 的無(wú)性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，形成再生植株，即為抗性變異體。
[0026] 實(shí)施例二
[0027] (1)將MS基本培養(yǎng)基中的各組分的濃度減半配制得到1/2MS培養(yǎng)基：以節(jié)瓜種子 滅菌后接種于1/2MS培養(yǎng)基中形成無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗莖尖；
[0028] (2)在MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤至4mg/L，吲哚乙酸至0· 2mg/L配制成 不定芽分化培養(yǎng)基，將步驟（1)中切取的無(wú)菌苗莖尖轉(zhuǎn)接入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢 生不定芽，無(wú)菌苗莖尖在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18~22天，培養(yǎng)條件為室溫23°C，每日 光照10小時(shí)；此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復(fù)繼代培養(yǎng)，擴(kuò)大繁殖，建立節(jié)瓜無(wú) 性繁殖系；
[0029] (3)在所述不定芽分化培養(yǎng)基中加入經(jīng)過(guò)濾滅菌的鐮刀菌酸溶液（Fusaric Acid， 簡(jiǎn)稱FA)至75mg/L配成篩選培養(yǎng)基，對(duì)步驟（2)中已建立的節(jié)瓜無(wú)性繁殖系進(jìn)行抗性離體 篩選，具體篩選過(guò)程為：將繼代1~2次的節(jié)瓜不定芽接種至篩選培養(yǎng)基中，在23°C，每日 光照10小時(shí)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，15天后將尚存活的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基上進(jìn)行 恢復(fù)培養(yǎng)，由此不定芽分化增殖所獲得的無(wú)性繁殖系具有對(duì)鐮刀菌酸的抗性；
[0030] (4)在MS基本培養(yǎng)基加入吲哚乙酸至0· 3mg/L配成生根培養(yǎng)基，將上述具有抗性 的無(wú)性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，形成再生植株，即為抗性變異體。
[0031] 實(shí)施三
[0032] (1)將MS基本培養(yǎng)基中的各組分的濃度減半配制得到1/2MS培養(yǎng)基：以節(jié)瓜種子 滅菌后接種于1/2MS培養(yǎng)基中形成無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗莖尖；
[0033] (2)在MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤至6mg/L，吲哚乙酸至0· lmg/L配制成 不定芽分化培養(yǎng)基，將步驟（1)中切取的無(wú)菌苗莖尖轉(zhuǎn)接入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢 生不定芽，無(wú)菌苗莖尖在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)22天，培養(yǎng)條件為室溫27°C，每日光照 14小時(shí)；此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復(fù)繼代培養(yǎng)，擴(kuò)大繁殖，建立節(jié)瓜無(wú)性繁 殖系；
[0034] (3)在所述不定芽分化培養(yǎng)基中加入經(jīng)過(guò)濾滅菌的鐮刀菌酸溶液（Fusaric Acid， 簡(jiǎn)稱FA)至100mg/L配成篩選培養(yǎng)基，對(duì)步驟（2)中已建立的節(jié)瓜無(wú)性繁殖系進(jìn)行抗性離 體篩選，具體篩選過(guò)程為：將繼代1~2次的節(jié)瓜不定芽接種至篩選培養(yǎng)基中，在27°C，每 日光照14小時(shí)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，18天后將尚存活的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基上進(jìn) 行恢復(fù)培養(yǎng)，由此不定芽分化增殖所獲得的無(wú)性繁殖系具有對(duì)鐮刀菌酸的抗性；
[0035] (4)在MS基本培養(yǎng)基加入吲哚乙酸至0· 8mg/L配成生根培養(yǎng)基，將上述具有抗性 的無(wú)性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，形成再生植株，即為抗性變異體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 以節(jié)瓜種子滅菌后接種于1/2MS基本培養(yǎng)基中形成無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗莖尖，轉(zhuǎn)接 入不定芽分化培養(yǎng)基使之形成叢生不定芽，此不定芽可以在不定芽分化培養(yǎng)基上反復(fù)繼代 培養(yǎng)，擴(kuò)大繁殖，建立節(jié)瓜無(wú)性繁殖系； (2) 用鐮刀菌酸作為離體脅迫劑與所述節(jié)瓜不定芽分化培養(yǎng)基配制篩選培養(yǎng)基，對(duì)已 建立的節(jié)瓜無(wú)性繁殖系進(jìn)行抗性離體篩選，獲得具有對(duì)鐮刀菌酸抗性的無(wú)性繁殖系： (3) 將具有抗性的無(wú)性繁殖系的不定芽切下，在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，形成再生植 株，即為抗性變異體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，其特征在于步驟（1) 中的不定芽分化培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤至4~6mg/L，吲哚乙酸至 0. 1~0. 2mg/L配制而成，無(wú)菌苗莖尖在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18~22天，培養(yǎng)條件為 室溫23°C~27°C，每日光照10~14小時(shí)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，其特征在于步驟（2) 中的篩選培養(yǎng)基是在所述不定芽分化培養(yǎng)基中加入經(jīng)過(guò)濾滅菌的鐮刀菌酸溶液，使之最終 鐮刀菌酸濃度為75~100mg/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，其特征在于步驟（2) 中的具體篩選過(guò)程為將繼代1~2次的節(jié)瓜不定芽接種至篩選培養(yǎng)基中，在25±2°C，每日 光照10~14小時(shí)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，15~18天后將尚存活的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng) 基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，由此不定芽分化增殖所獲得的無(wú)性繁殖系具有對(duì)鐮刀菌酸的抗性。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的節(jié)瓜抗枯萎病變異體的離體篩選方法，其特征在于步驟（3) 中的生根培養(yǎng)基由MS基本培養(yǎng)基加入吲哚乙酸至0. 3~0. 8mg/L而成。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK106063457SQ201410594699
【公開(kāi)日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2014年10月21日 公開(kāi)號(hào)201410594699.9, CN 106063457 A, CN 106063457A, CN 201410594699, CN-A-106063457, CN106063457 A, CN106063457A, CN201410594699, CN201410594699.9
【發(fā)明人】華生奎, 付燕
【申請(qǐng)人】重慶市涪陵區(qū)生奎蔬菜種植場(chǎng)