短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀制劑的制備方法，屬于飼料添加劑【技術(shù)領(lǐng)域】，所述的制備方法包括以下步驟：分別將所述的短小芽孢桿菌和所述的蛭弧菌進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)，然后將二者混合。其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：本發(fā)明的制備方法工藝簡(jiǎn)單、高效，制得的粉狀制劑可以有效、廣泛地清除弧菌引起的疾病。
CCTCC NO: M2013240
20130602
【專利說(shuō)明】短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀制劑的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及飼料添加劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，是短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀制 劑的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 弧菌屬于弧菌科弧菌屬，是一類革蘭氏陰性、具極生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢的短桿 狀細(xì)菌，其中有的弧菌有一定的彎曲，欠柔軟，有的彎曲不明顯?；【呛Ｑ蠹?xì)菌的優(yōu)勢(shì)類 群之一，廣泛分布于世界各地各類河口、內(nèi)灣、沿岸、水體養(yǎng)殖區(qū)和外海的水體及沉積物中， 各種海洋生物體表或體內(nèi)也常生存著高密度海洋弧菌，在海洋環(huán)境中占據(jù)著重要的生態(tài)地 位，具有多種多樣的生理、生態(tài)功能，在海洋微食物環(huán)中扮演重要角色，對(duì)海洋的營(yíng)養(yǎng)物的 循環(huán)起著非常重要的作用。但同時(shí)，弧菌又是水生動(dòng)物中的一類重要的病原菌。
[0003] 隨著高密度海水養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展,對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的污染日益加劇。水產(chǎn)品的病害已 成為海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題。弧菌病是由弧菌屬細(xì)菌引起的一類細(xì)菌性疾病，該病在 全球范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，其爆發(fā)性流行不僅給海水養(yǎng)殖魚類、貝類及甲殼類等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的養(yǎng) 殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還導(dǎo)致野生的海水魚類、貝類及甲殼類的大量死亡?；【∈亲?嚴(yán)重的疾病之一，其死亡率甚至高達(dá)100%。
[0004] 為了控制病害，通常過(guò)度使用抗生素類藥物，這不僅造成養(yǎng)殖產(chǎn)品的藥物殘留，而 且還提高了病原細(xì)菌的耐藥性，引起抗性基因的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致生態(tài)失調(diào)。2005年，歐盟已禁止 在動(dòng)物養(yǎng)殖中使用一切非治療性抗生素。因此，尋找抗生素的替代藥物、探索新的防治方式 已經(jīng)迫在眉睫。
[0005] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101781627A公開了一種海水蛭弧菌微生態(tài)制劑的制備與應(yīng)用， 涉及一種海水微生態(tài)制劑，需要提供適合于海水養(yǎng)殖用的蛭弧菌制劑的制備方法。該發(fā) 明由以下步驟組成：制備宿主菌懸液；蛭弧菌的分離、純化；蛭弧菌增殖培養(yǎng)，其特征是將 施氏假單胞菌接斜面活化后，在試管中加入生理鹽水制得菌懸液，然后用營(yíng)養(yǎng)肉湯增殖培 養(yǎng)，在所得菌液中加入絮凝劑，搖勻后靜置沉淀，加入生理鹽水得到10 12cfu/mL的宿主菌 懸液；用雙層瓊脂平板法對(duì)采集的海水和底泥樣品進(jìn)行蛭弧菌的分離和純化，將含有宿主 菌懸液和采集樣品的培養(yǎng)基混勻后倒入下層海水瓊脂上培養(yǎng)，將宿主菌和分離得到的蛭 弧菌加入到滅菌天然海水中培養(yǎng)至蛭弧菌濃度為IO 8?109pfu/mL，備用。中國(guó)專利文獻(xiàn) CN102217655A公開了一種粉狀噬菌蛭弧菌制劑及其制備方法，以沸石粉作為賦形載體，利 用噴霧干燥技術(shù)制備粉狀噬菌蛭弧菌制劑。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN103907596A公開了一種蛭弧 菌顆粒劑，由植物油、質(zhì)量濃度為5% -10%的瓊脂和蛭弧菌含量為101(l-10nCFU/mL的菌 液按照體積比為3 :50 :100的比例混合，然后加入質(zhì)量濃度為2%的羧甲基纖維素鈉并混 合均勻，將混合液滴入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的CaCl2溶液中固化12h，再將蛭弧菌固化顆粒 于-20°C條件下冷凍干燥24h制得的顆粒劑。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101356927公開了一種蛭弧 菌在消除海產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病性弧菌的應(yīng)用，在污染了致病性弧菌的海產(chǎn)品和/或 養(yǎng)殖水體中加入蛭弧菌濃縮液，使蛭弧菌的濃度至少達(dá)到10 2pfu/ml。海產(chǎn)品食用前、運(yùn)輸 過(guò)程以及養(yǎng)殖水體中應(yīng)用該法時(shí)，蛭弧菌濃度范圍分別為IO4?1012pfu/ml、IO 3?IO11Pfu/ ml、102 ?106pfu/ml。
[0006] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN103525723A公開了一種具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢 桿菌，其保藏編號(hào)為CCTCC M 2013240。該發(fā)明還提供這種短小芽孢桿菌的應(yīng)用以及以這種 短小芽孢桿菌或其發(fā)酵液為活性成分的微生物制劑。該發(fā)明以紫色桿菌為篩選模型，利用 "T"型劃線法和濾紙片法篩選出一株能夠抑制紫色桿菌紫色色素產(chǎn)生的菌株F3-1，試驗(yàn)結(jié) 果表明菌株F3-1能夠抑制紫色桿菌的QS信號(hào)分子，具有抑制細(xì)菌群體感應(yīng)的作用，可用于 制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的微生物制劑。
[0007] 但是關(guān)于本發(fā)明的短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀制劑的制備方法目前還未見(jiàn)報(bào) 道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀 制劑的制備方法。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀 制劑的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟：分別將具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短 小芽孢桿菌和蛭弧菌進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)，然后將二者混合。
[0010] 所述的具有群體感應(yīng)抑制作用的短小芽孢桿菌為保藏編號(hào)為CCTCC M2013240的 短小芽孢桿菌。
[0011] 所述的蛭弧菌為噬菌蛭弧菌、斯托普蛭弧菌和斯塔爾蛭弧菌中的一種或多種。
[0012] 所述的制備方法包括以下步驟：短小芽抱桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng) 12h，調(diào)整菌濃度至5 X10nCfu/ml，按重量比菌液：載體為1:1的配比加入載體玉米芯粉， 60°C烘干24h制成活菌數(shù)> 5X 108cfu/g短小芽孢桿菌菌粉；將蛭弧菌菌種接種于IOOml于 1/10NB培養(yǎng)基中，加入100L濃度為I. 0 X 106cfu/ml大腸桿菌菌懸液，于35°C溫度下IOOr/ min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48h，檢測(cè)菌落總數(shù)，調(diào)蛭弧菌菌液濃度為I. OX 10ncfu/ml備用，花生 油、質(zhì)量濃度為5%的瓊脂和蛭弧菌含量為I. 0 X 10ncfu/ml的菌液按照體積比為3:50:100 的比例放入攪拌容器中，然后加入質(zhì)量濃度為2 %的羧甲基纖維素納，25 °C恒溫?cái)嚢?30min，使之混合均勻，將混合液滴入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的CaCl2溶液中固化12h，再將蛭弧 菌固化顆粒于_20°C條件下冷凍干燥24h，制得顆粒劑，蛭弧菌顆粒的含量> I. 0 X IO11Cfu/ g ;將短小芽孢桿菌菌粉與蛭弧菌顆粒按照質(zhì)量比為20:1的比例混合。
[0013] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0014] 1、本發(fā)明的制備方法工藝簡(jiǎn)單、高效，可以制得粉狀制劑。
[0015] 2、本發(fā)明制備的具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀制 齊U，可以廣譜、有效地清除弧菌引起的疾病，添加到對(duì)蝦飼料中不僅可以抑制對(duì)蝦腸道病原 弧菌的生長(zhǎng)、減少對(duì)蝦弧菌病的發(fā)生，還能促進(jìn)對(duì)蝦生長(zhǎng)、降低養(yǎng)殖成本，值得在水產(chǎn)養(yǎng)殖 中廣泛應(yīng)用。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0017] 具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌，其釋放出來(lái)的蛋白酶可以淬滅群體 感應(yīng)信號(hào)分子，進(jìn)而使致病菌調(diào)控毒力因子表達(dá)的機(jī)能喪失或者減弱，那么致病菌就是一 頭沒(méi)有獠牙的狼，而宿主有足夠的時(shí)間把它圍困進(jìn)而依靠自身免疫消除抗原。
[0018] 將具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌組合在一起使用，將二者 的作用共同發(fā)揮出來(lái)，可以更好地清除弧菌引起的疾病。
[0019] 本發(fā)明實(shí)施例優(yōu)選的具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌為保藏編號(hào)為 CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌。保藏編號(hào)為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌的分類 命名：短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物中心，地址：中國(guó)湖 北省武漢市武漢大學(xué)，保藏日期：2013年06月02日，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2013240。
[0020] 本發(fā)明實(shí)施例優(yōu)選的蛭弧菌為噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus)。
[0021] 實(shí)施例1液體制劑
[0022] 本發(fā)明的液體制劑可以通過(guò)將短小芽孢桿菌和蛭弧菌分別進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，然 后將二者的濃縮液混合，即得到本發(fā)明的液體制劑。本實(shí)施例制備的液體制劑用于實(shí)施例 3、實(shí)施例4、實(shí)施例5的試驗(yàn)。本實(shí)施例具體的制備方法如下：
[0023] 將短小芽抱桿菌菌株按斜面、液體種子、液體發(fā)酵的順序培養(yǎng)，斜面和種子培養(yǎng)基 為常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基配方（W/V):豆餅粉3%，淀粉1. 5%， 玉米漿 1%，葡萄糖 0.5%，（NH4) 2S040. 1 %，NH4Cl 0· 1 %，KH2PO4O. 05 %，NaH2PO4O. 5 %， MgSO4O. 05%，MnSO4O. 05 %，發(fā)酵培養(yǎng)條件為28-37 °C，通風(fēng)培養(yǎng)36-48h，活菌數(shù)彡IO9Cfu/ ml 〇
[0024] 蛭弧菌與副溶血弧菌濃縮液混合后加入到含有DNB培養(yǎng)基的三角錐瓶中，恒溫?fù)u 床250rpm，28°C培養(yǎng)24h。培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)5000rpm、4°C離心20min，取上清液，再16000rpm、4°C 條件下離心20min,棄上清液,加入適量DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌沉淀物,制成濃度 彡10ncfu/ml的蛭弧菌濃縮液。
[0025] 將短小芽孢桿菌的濃縮液和蛭弧菌的濃縮液按照體積比為10:1的比例進(jìn)行混 合，即得到本發(fā)明的具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體制劑。
[0026] 實(shí)施例2粉狀制劑
[0027] 本發(fā)明的粉狀制劑可以通過(guò)將短小芽孢桿菌和蛭弧菌分別進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，然 后將二者的粉狀固體混合；也可以通過(guò)將短小芽孢桿菌和蛭弧菌分別進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)， 然后將二者混合，再進(jìn)行干燥制得粉狀制劑。本實(shí)施例制備的粉狀制劑用于實(shí)施例4、實(shí)施 例5的試驗(yàn)。本實(shí)施例具體的制備方法如下：
[0028] 短小芽抱桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)12h，調(diào)整菌濃度至5 X IO11Cfu/ ml,按重量比菌液：載體為1 :1的配比加入載體玉米芯粉,60 °C烘干24h制成活菌數(shù) 彡5X 108cfu/g短小芽孢桿菌菌粉。
[0029] 將蛭弧菌菌種接種于IOOml于1/10NB培養(yǎng)基中，加入100L濃度為I. OX IO6Cfu/ ml大腸桿菌菌懸液，于35°C溫度下lOOr/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48h，檢測(cè)菌落總數(shù)，調(diào)蛭 弧菌菌液濃度為1.0 X l〇ncfu/ml備用?；ㄉ汀①|(zhì)量濃度為5%的瓊脂和蛭弧菌含量為 I. OX 10ncfu/ml的菌液按照體積比為3:50:100的比例放入攪拌容器中，然后加入質(zhì)量濃 度為2%的羧甲基纖維素納，25°C恒溫?cái)嚢?0min，使之混合均勻，將混合液滴入到質(zhì)量分 數(shù)為10 %的CaCl2溶液中固化12h，再將蛭弧菌固化顆粒于-20°C條件下冷凍干燥24h，制 得顆粒劑。蛭弧菌顆粒的含量彡l.〇Xl〇ncfu/g。
[0030] 將短小芽孢桿菌菌粉與蛭弧菌顆粒按照質(zhì)量比為20:1的比例混合，即得到本發(fā) 明的具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀制劑。
[0031] 實(shí)施例3抑制弧菌譜分析
[0032] 采用平板濾紙片擴(kuò)散法對(duì)實(shí)施例1制得的液體制劑進(jìn)行抑制弧菌譜分析。根據(jù)抑 菌圈的大小判定抑菌能力的強(qiáng)弱，抑菌譜分析結(jié)果見(jiàn)表1 :
[0033] 表1組合物的抑制弧菌活性分析
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種短小芽孢桿菌和蛭弧菌的粉狀制劑的制備方法，其特征在于，所述的制備方法 包括以下步驟：分別將具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢桿菌和蛭弧菌進(jìn)行固體發(fā)酵 培養(yǎng)，然后將二者混合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的具有群體感應(yīng)抑制作用的短 小芽孢桿菌為保藏編號(hào)為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的蛭弧菌為噬菌蛭弧菌、斯托普 蛭弧菌和斯塔爾蛭弧菌中的一種或多種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括以下步驟：短 小芽抱桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)12h，調(diào)整菌濃度至5X10ncfu/ml，按重量 比菌液：載體為1:1的配比加入載體玉米芯粉，60°C烘干24h制成活菌數(shù)彡5X108cfu/ g短小芽孢桿菌菌粉；將蛭弧菌菌種接種于l〇〇ml于1/10NB培養(yǎng)基中，加入100L濃度為 1. OX 106cfu/ml大腸桿菌菌懸液，于35°C溫度下100r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48h，檢測(cè)菌落 總數(shù)，調(diào)蛭弧菌菌液濃度為1. 0 X 10ncfu/ml備用，花生油、質(zhì)量濃度為5%的瓊脂和蛭弧菌 含量為1.0X10nCfu/ml的菌液按照體積比為3:50:100的比例放入攪拌容器中，然后加入 質(zhì)量濃度為2 %的羧甲基纖維素納，25°C恒溫?cái)嚢?0min，使之混合均勻，將混合液滴入到 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的CaC12溶液中固化12h，再將蛭弧菌固化顆粒于-20°C條件下冷凍干燥 24h，制得顆粒劑，蛭弧菌顆粒的含量> 1. OX 10ncfu/g ;將短小芽孢桿菌菌粉與蛭弧菌顆 粒按照質(zhì)量比為20:1的比例混合。
【文檔編號(hào)】A23K1/16GK104431521SQ201410751288
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】宋增福, 許維素 申請(qǐng)人:蘇州埃瑞特生物技術(shù)有限公司