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豬β防御素2噴干粉,飼料添加劑,預(yù)混料及配合料的制作方法

文檔序號(hào):208863閱讀:501來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):豬β防御素2噴干粉,飼料添加劑,預(yù)混料及配合料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于動(dòng)物飼料領(lǐng)域,具體涉及一種豬β防御素2噴干粉及含有其的飼料添加劑,預(yù)混料及配合料。
背景技術(shù)
近年來(lái),抗生素在畜產(chǎn)品中大量使用,其殘留可能使動(dòng)物病原菌產(chǎn)生耐藥性,耐藥基因可通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、易位等方式在細(xì)菌之問(wèn)傳播,也可能通過(guò)食物鏈等途徑擴(kuò)散耐藥基因,使細(xì)菌的耐藥基因在人群中細(xì)菌、動(dòng)物群中細(xì)菌和生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌間互相傳遞,由此導(dǎo)致致病菌的耐藥性增加而引起人類(lèi)和動(dòng)物感染性疾病的治療失敗,對(duì)人類(lèi)的健康產(chǎn)生危害。某些抗生素走進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)后最終以原型或代謝物形式主要經(jīng)糞便排泄到外界環(huán) 境,造成環(huán)境污染,當(dāng)這些物質(zhì)超過(guò)環(huán)境自?xún)裟芰r(shí),就會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境中的微生物產(chǎn)生影響,增加環(huán)境中的耐菌株。抑制或殺滅了有益菌,破壞了腸道內(nèi)的菌群平衡。由微生物生產(chǎn)的抗菌類(lèi)小肽物質(zhì)是通過(guò)作用于細(xì)菌細(xì)胞膜而起作用的,作為添加劑屬無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、無(wú)致細(xì)菌耐藥性的一類(lèi)環(huán)保型飼料添加劑。但作為蛋白小肽,要使抗菌肽能夠真正在養(yǎng)殖生產(chǎn)中大量應(yīng)用,必須解決產(chǎn)量、活性、穩(wěn)定性、功能性、成本、生產(chǎn)工藝方法等多方面問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題,本發(fā)明提供一種抑菌肽噴干粉及含有其的飼料添加劑,預(yù)混料及配合料。首先,本發(fā)明提供一種豬β防御素2噴干粉的制備方法,其為發(fā)酵攜帶豬β防御素2基因的酵母基因工程菌株,取上清液進(jìn)行超濾,超濾液依次添加保護(hù)劑、壁材和載體,噴霧干燥。本發(fā)明中,對(duì)酵母基因工程菌的菌株并沒(méi)有特別的限定,只要攜帶有豬β防御素2基因,并能正常表達(dá)出豬β防御素2的酵母菌株都可以用于本發(fā)明。其中,超濾截留分子量為3KDa 10KDa的超濾液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述保護(hù)劑包括質(zhì)量體積百分比3 8%的脫脂奶粉、質(zhì)量體積百分比O. 5^2. 5%的谷氨酸鈉以及質(zhì)量體積百分比O. Γ2. 0%的乳糖、海藻糖、蔗糖中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述壁材選自明膠、阿拉伯膠、瓜爾豆膠、海藻酸鈉中的一種或多種,添加量為質(zhì)量體積百分比5 10%。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述載體選自石粉以及玉米淀粉、麥芽糊精、玉米芯粉、麥麩粉中的一種或兩種,添加量為質(zhì)量體積百分比20-25%。其中,噴霧干燥的條件為進(jìn)風(fēng)溫度16(Tl80°C,進(jìn)料速度l(T30ml/min,出風(fēng)溫度65 85。。。
進(jìn)一步的,本發(fā)明提供有所述的制備的豬β防御素2噴干粉。更進(jìn)一步的,本發(fā)明還提供含有所述所述噴干粉的飼料添加劑,優(yōu)選的該飼料添加劑為豬用,更優(yōu)選的,為仔豬用。更進(jìn)一步的,本發(fā)明還提供含有所述飼料添加劑的預(yù)混料,優(yōu)選的,該預(yù)混料為豬用,更優(yōu)選的,為仔豬用。更進(jìn)一步的,本發(fā)明還提供含有所述預(yù)混料的配合料,優(yōu)選的,該配合料為豬用,更優(yōu)選的,為仔豬用。本發(fā)明提供的具有抑菌活性的畢赤酵母表達(dá)的豬β防御素2噴干粉,采用噴霧干燥法與微膠囊成囊技術(shù)結(jié)合,使豬β防御素2的活性得以最大程度保存,而且,經(jīng)過(guò)體外模擬人工胃液而不被破壞,釋放出來(lái)的豬β防御素2具有良好的活性,能顯著提高仔豬的采食量,促進(jìn)飼料利用率,提高仔豬的生長(zhǎng)速度和日增重,大幅度降低腹瀉率,使豬只的生產(chǎn)·性能得到很大的提高。本發(fā)明提供的豬防御素2噴干粉的制備方法簡(jiǎn)單,所需設(shè)備簡(jiǎn)單,成本低,適宜大規(guī)模生產(chǎn)。


圖I所示為超濾液、噴干粉抑菌活性比較。圖2所示為超濾液、噴干粉耐胃酸試驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明,但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I具有抑菌活性的畢赤酵母蛋白多肽豬β防御素2的制備I、畢赤酵母發(fā)酵液的制備I)平板培養(yǎng)復(fù)壯將攜帶豬β防御素2基因的畢赤酵母(根據(jù)解民等,重組豬β防御素2在畢赤酵母中的表達(dá)及其鑒定,2010,中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),20 (8),1028-1031公開(kāi)的方法進(jìn)行制備)菌種接種于YPD平板培養(yǎng)基上,于28°C培養(yǎng)48h,使畢赤酵母復(fù)壯,并形成單菌落,挑取單菌落于接種培養(yǎng)基上,28°C培養(yǎng)48h ;2) —級(jí)種子的制備將步驟I)培養(yǎng)的畢赤酵母菌種轉(zhuǎn)接裝有300mlYPD液態(tài)培養(yǎng)基2L搖瓶里,28°C搖床培養(yǎng)48h,至對(duì)數(shù)后期,得一級(jí)種子;3) 二級(jí)種子的制備將步驟2)制備的一級(jí)種子轉(zhuǎn)接到裝有80LYPD種子培養(yǎng)基的100L種子罐中,溫度28°C,轉(zhuǎn)速400rpm,培養(yǎng)24h,得二級(jí)種子液。4)畢赤酵母發(fā)酵液的制備將步驟3)制備的二級(jí)種子液按照5%的接種量接種到
O.5 O. 8m3發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,溫度31。。,轉(zhuǎn)速400rpm,罐壓O. 05Mpa,通風(fēng)比:I :0. 6,培養(yǎng)48h,收集發(fā)酵液。發(fā)酵畢赤酵母時(shí)用的發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成葡萄糖18g/L,蛋白胨20g/L,牛肉膏3g/L,酵母浸粉8/L,pH為7. 2。2、畢赤酵母蛋白多肽豬β防御素2的制備I)上清液制備將I中得到的發(fā)酵液經(jīng)離心機(jī)3000rpm離心20min,去除菌體收集上清,再次5000rpm離心15min,去除菌體收集上清液,待用。2)超濾選擇3. 5KD超濾膜,4000rpm,離心40min,收集超濾液。
3)保護(hù)劑的添加將脫脂奶粉、谷氨酸鈉、乳糖按照10:1:1的比例進(jìn)行預(yù)先混合,以超濾液的8%進(jìn)行添加,充分混合。4)壁材制備及添加將自來(lái)水升溫至40°C 50°C,邊開(kāi)攪拌邊慢慢加入明膠,使其完全溶解配成10%的溶液,按超濾液的I. 5%加入配好的明膠溶液攪拌lOmin。5)加入25%的載體,設(shè)置噴霧干燥塔進(jìn)出風(fēng)溫度為165°C /85°C,霧化器轉(zhuǎn)動(dòng)頻率為35Hz,進(jìn)料速度為18ml/min,進(jìn)行噴霧干燥,得到豬β防御素2的噴干粉。實(shí)施例2畢赤酵母蛋白多 肽豬β防御素2耐胃酸試驗(yàn)I、超濾液、噴干粉抑菌活性比較I)解囊稱(chēng)取O. 5g噴干菌粉加入O. 05mol/L檸檬酸鈉解囊液49. 5mL中,于37°C、200rpm振蕩12h, 3000rpm離心,取上清液。2)制作指示平板采用牛津杯定量擴(kuò)散法,以金黃色葡萄球菌為指示菌,將含有指示菌IO7個(gè)/ml培養(yǎng)物Iml與溶化并冷卻至50° C的檢測(cè)培養(yǎng)基25ml混勻,倒入已放置好牛津杯的平皿中,冷凝后用無(wú)菌鑷子取出牛津杯。3)抑菌活性比較取超濾液和噴干粉解囊液各50 μ L加入小孔中,在冰箱中放置過(guò)夜,使之充分?jǐn)U散到培養(yǎng)基中,然后在指示菌最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)24h,觀察并測(cè)定抑菌圈直徑。結(jié)果如圖I所不。圖中右邊為超濾液抑囷圈,直徑為33. 19mm,左邊為嗔干粉解囊后抑菌圈,直徑為28. 54mm,抑菌活性保持在86%以上。2、耐胃酸試驗(yàn)I)解囊液、指示平板的制作均同上;2)稱(chēng)取O. 5g噴干菌粉加入49. 5mL人工胃液中于37°C、200rpm振蕩2h后棄去人工胃液,加入49. 5mL解囊液中于37°C、200rpm振蕩Ih后測(cè)抑菌圈大小。結(jié)果如圖2所示。左邊為噴干粉解囊后抑菌圈,直徑為27. 32_,右邊為經(jīng)過(guò)人工胃液處理之后,直徑為25. 27抑菌活性保持在90%以上。實(shí)施例3畢赤酵母蛋白多肽豬β防御素2對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響試驗(yàn)選21日齡的杜X長(zhǎng)X大三元雜交仔豬120頭,隨機(jī)分布到3個(gè)處理組和I個(gè)空白對(duì)照組,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。在各組日糧中添加實(shí)施例I制備的畢赤酵母蛋白多肽豬β防御素2噴干粉,添加量分別為0.5%、1%和2%。測(cè)定的生長(zhǎng)性能指標(biāo)包括平均日增重(ADG)、日采食量(40 1)、飼料轉(zhuǎn)化效率^/6),并觀察糞便狀態(tài),計(jì)算腹瀉率。結(jié)果如表I所示。表I畢赤酵母蛋白多肽豬β防御素2對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響
項(xiàng)目__對(duì)照組試驗(yàn)組0.5% 試驗(yàn)組1% 試驗(yàn)組2%
曰增重(g/d) 264.52±4.27a 274.76士 6.13a 294.05±5.84b 271.14 士 6.9 Ia
ADG_____
「 ^ 釆食量(g/d) 479.29±9.83a 475.83土 8.20a 530.95士 7.03b 474.82士 9.42aL0045J
ADFI_____
料重比1.81±0.01a 1.73±0.02b 1.81±0.02a 1.75±0.02bc
(F/G)_____
腹筠率 % 4.40士0.006a 3.93±0.003ac 2.38士0.006b 2.95AQ.QQ2bc 注同行數(shù)據(jù)無(wú)肩標(biāo)或肩標(biāo)字母相同者為差異不顯著(p>0. 05),不同小寫(xiě)字母者差異顯著(ρ〈0· 05)從表I中數(shù)據(jù)可以看出,畢赤酵母蛋白多肽的豬β防御素2添加可以改善斷奶仔豬的生產(chǎn)性能。整個(gè)試驗(yàn)期,1%試驗(yàn)組的日增重和采食量顯著高于對(duì)照組(ρ〈0. 05),料重比顯著低于對(duì)照組(Ρ〈0. 05)。對(duì)于腹瀉率,試驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組。由此可見(jiàn),在仔豬階段,日糧中添加一定劑量 的畢赤酵母蛋白多肽豬β防御素2能顯著提高仔豬的采食量,促進(jìn)飼料利用率,提高仔豬的生長(zhǎng)速度和日增重,使豬只的生產(chǎn)性能得到很大的提高。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾,這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種豬β防御素2噴干粉的制備方法,其特征在于,發(fā)酵攜帶豬β防御素2基因的酵母基因工程菌株,取上清液進(jìn)行超濾,超濾液依次添加保護(hù)劑、壁材和載體,進(jìn)行噴霧干燥。
2.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,超濾截留分子量為3KDa 10KDa的超濾液。
3.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述保護(hù)劑包括質(zhì)量體積百分比3 8%的脫脂奶粉、質(zhì)量體積百分比O. 5^2. 5%的谷氨酸鈉以及質(zhì)量體積百分比O. Γ2. 0%的乳糖、海藻糖、蔗糖中的一種或多種。
4.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述壁材選自明膠、阿拉伯膠、瓜爾豆膠、海藻酸鈉中的一種或多種,添加量為質(zhì)量體積百分比5 10%。
5.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述載體選自石粉以及玉米淀粉、麥芽糊精、玉米芯粉、麥麩粉中的一種或兩種,添加量為質(zhì)量體積百分比20-25%。
6.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,噴霧干燥的條件為進(jìn)風(fēng)溫度16(T18(TC,進(jìn)料速度l(T30ml/min,出風(fēng)溫度65 85°C。
7.權(quán)利要求Γ6任一項(xiàng)所述的方法制備的豬β防御素2噴干粉。
8.含有權(quán)利要求7所述噴干粉的飼料添加劑。
9.含有權(quán)利要求8所述飼料添加劑的預(yù)混料。
10.含有權(quán)利要求9所述預(yù)混料的配合料。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物飼料領(lǐng)域,具體涉及一種豬β防御素2噴干粉及含有其的飼料添加劑,預(yù)混料及配合料。本發(fā)明的豬β防御素2噴干粉由以下方法制備發(fā)酵攜帶豬β防御素2基因的酵母基因工程菌株,取上清液進(jìn)行超濾,超濾液依次添加保護(hù)劑、壁材和載體,進(jìn)行噴霧干燥。本發(fā)明提供的具有抑菌活性的畢赤酵母表達(dá)的豬β防御素2噴干粉,采用噴霧干燥法與成囊技術(shù)結(jié)合,使豬β防御素2的活性得以最大程度保存,而且,經(jīng)過(guò)體外模擬人工胃液而不被破壞,釋放出來(lái)的豬β防御素2具有良好的活性。
文檔編號(hào)A23K1/18GK102907583SQ20121041917
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月27日
發(fā)明者吳雅琨, 彭子欣, 陳慧鑫, 馮秋月, 謝飛, 王安如 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 漳州大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司, 湖南大北農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司
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