專利名稱：一種紅皮云杉離體快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)的方法，尤其是紅皮云杉離體快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
紅皮云杉(Picea koraiensis Nakai)又名紅皮臭,是松科云杉屬常綠喬木,樹(shù)冠尖塔形，大枝斜伸或平展，小枝上有明顯的木針狀葉枕；芽長(zhǎng)圓錐形，葉錐形，先端尖，多輻射伸展，橫切面菱形，四面有氣孔線。球果卵狀圓柱形或圓柱狀矩圓形，熟后綠黃的褐或褐色；種鱗薄木質(zhì)，三角倒卵形，種子上端有膜質(zhì)長(zhǎng)翅。分布于東北小興安嶺、吉林山區(qū)海拔1400-1800米地帶，朝鮮及烏蘇里地區(qū)亦產(chǎn)。較耐蔭，淺根性。適應(yīng)性較強(qiáng)，在分布區(qū)內(nèi)除沼澤化地帶及干燥的陽(yáng)坡、山脊外，在不同立地條件下均能生長(zhǎng)。該樹(shù)種姿態(tài)優(yōu)美，具觀賞特性和園林布景。目前，紅皮云杉繁殖主要通過(guò)種子、扦插以及組培繁殖，然而由于種子繁殖變異率較高，扦插繁殖主要以3 6年生苗的插穗為材料生產(chǎn)扦插苗，培育周期長(zhǎng)， 另外，因?yàn)閺拿總€(gè)幼樹(shù)可采集的插穗的數(shù)量有限，扦插繁殖的繁殖率也低，對(duì)于組培繁殖， CN101228848公開(kāi)了一種紅皮云杉體細(xì)胞胚誘導(dǎo)植株再生的方法，其主要通過(guò)取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的紅皮云杉合子胚接種于改良RJW培養(yǎng)基中，獲得胚性愈傷組織后經(jīng)反復(fù)培養(yǎng)，在獲得體細(xì)胞胚之后再接種到RJW培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至根和莖的形成，即得到紅皮云杉再生植株，然而其對(duì)操作要求高，培育周期長(zhǎng)，影響了繁殖效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決紅皮云杉繁殖周期長(zhǎng)、操作要求高、繁殖率低的問(wèn)題，而提供的一種紅皮云杉離體快速繁殖的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種紅皮云杉離體快速繁殖的方法，該方法包括如下步驟1、外植體誘導(dǎo)材料消毒的方法在生長(zhǎng)季節(jié)選取生長(zhǎng)旺盛紅皮云杉的3 4厘米長(zhǎng)的頂芽或帶側(cè)芽的莖段為外植體，將嫩芽依次在75%的酒精、O. 15%的 HgCl2,1. 5%的次氯酸鈉溶液中進(jìn)行消毒滅菌處理，其時(shí)間依次是消毒20-40秒，滅菌10-30 分鐘，再消毒10-20分鐘，最后用無(wú)菌水漂洗至少2次；2、不定芽誘導(dǎo)和繼代增殖將經(jīng)過(guò)消毒滅菌后的上述嫩芽在無(wú)菌工作環(huán)境中接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中3/4MS培養(yǎng)基、6-BA O. 0-2. 0mg/L、0. 3-1. Omg/L 玉米素 ZT、鹿糖 30_40g/L、活性炭 lmg/L、瓊脂 7_8g/L ;培養(yǎng)條件為:控制PH為6. 5，溫度20-250C，13-15小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度1200-1800LX，經(jīng)10-20 天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)芽分化；將誘導(dǎo)出的不定芽切割后再繼代培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)基中在相同的條件下增殖，20-30天為I個(gè)繼代增殖周期，每I個(gè)繼代增殖周期由I個(gè)芽可增殖形成 3 4個(gè)芽；3、叢生芽誘導(dǎo)將繼代培養(yǎng)得到的不定芽接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)1/21^培養(yǎng)基、赤霉素0.01-0. lmg/L、萘乙酸O. 01-0. lmg/L、蔗糖30_40g/L、活性炭 lmg/L、瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為控制PH為6. 5，溫度18-22°C，11-12小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度1000-1500LX，經(jīng)10-15天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)叢生芽；4、生根培養(yǎng)將叢生芽誘導(dǎo)得到的不定芽接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)1/2MS培養(yǎng)基、吲哚丁酸O. 1-1. Omg/L、萘乙酸O. 01-0. lmg/L、蔗糖30-40g/L、活性炭lmg/L、瓊脂7_8g/L ;培養(yǎng)條件為控制PH為 6. 5，溫度18-20°C，16-18小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度1400-1600LX，經(jīng)20-25天培養(yǎng)便可生出根毛，生根率可達(dá)90-95%，每個(gè)分化芽有根4 5條；5、試管苗移栽當(dāng)不定根長(zhǎng)至I. O厘米時(shí)，打開(kāi)瓶口的封口膜，在光照培養(yǎng)室內(nèi)煉苗3-4天，然后用鑷子把試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入裝有基質(zhì)的容器內(nèi)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在
1、提供紅皮云杉離體組培快繁的成套技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了紅皮云杉的規(guī)模化生產(chǎn)；
2、本申請(qǐng)采用新芽或莖段作為外植體，對(duì)操作要求低，一般的技術(shù)人員都可以操作；
3、進(jìn)行不同培養(yǎng)階段的激素調(diào)節(jié)，采取激素混用和輪用，結(jié)合有效的滅菌技術(shù)，達(dá)到提聞增殖率和減少變異的目的。4、縮短了繁殖周期，在保證了成活率的基礎(chǔ)上，提高了繁殖效率，增加了經(jīng)濟(jì)效
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具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一該具體實(shí)施方式
包括如下步驟1、外植體誘導(dǎo)材料消毒的方法在生長(zhǎng)季節(jié)選取生長(zhǎng)旺盛紅皮云杉的3 4厘米長(zhǎng)的頂芽或帶側(cè)芽的莖段為外植體，將嫩芽依次在75%的酒精、O. 15%的HgCl2U. 5%的次氯酸鈉溶液中進(jìn)行消毒滅菌處理，其時(shí)間依次是消毒20-40秒，滅菌10分鐘，再消毒10-20分鐘，最后用無(wú)菌水漂洗至少2次；2、不定芽誘導(dǎo)和繼代增殖將經(jīng)過(guò)消毒滅菌后的上述嫩芽在無(wú)菌工作環(huán)境中接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中3/4MS培養(yǎng)基、6-BA 2. Omg/LU. Omg/L玉米素ZT、蔗糖30_40g/L、活性炭lmg/L、瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為:控制PH為6. 5，溫度20-25°C，13小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度1800LX, 經(jīng)20天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)芽分化；將誘導(dǎo)出的不定芽切割后再繼代培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)基中在相同的條件下增殖，22天為I個(gè)繼代增殖周期，每I個(gè)繼代增殖周期由I個(gè)芽可增殖形成3 4個(gè)芽；3、叢生芽誘導(dǎo)將繼代培養(yǎng)得到的不定芽接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)1/2MS培養(yǎng)基、赤霉素0.01mg/L、萘乙酸O. lmg/L、蔗糖30_40g/L、活性炭Img/ L、瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為:控制PH為6. 5，溫度18-22°C，11-12小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度 1000LX，經(jīng)15天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)叢生芽；4、生根培養(yǎng)將叢生芽誘導(dǎo)得到的不定芽接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)1/2MS培養(yǎng)基、吲哚丁酸I. Omg/L、萘乙酸0. lmg/L、蔗糖30-40g/L、活性炭lmg/L、瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為控制PH為6. 5，溫度18_20°C，16-18 小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度1400-1600LX，經(jīng)25天培養(yǎng)便可生出根毛，生根率可達(dá)90%，每個(gè)分化芽有根4 5條；5、試管苗移栽當(dāng)不定根長(zhǎng)至I. O厘米時(shí)，打開(kāi)瓶口的封口膜，在光照培養(yǎng)室內(nèi)煉苗3-4天，然后用鑷子把試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入裝有基質(zhì)的容器內(nèi)，基質(zhì)由體積比珍珠巖23% :蛭石30% :腐殖土 47組成。
具體實(shí)施方式
二 該具體實(shí)施方式
包括如下步驟1、外植體誘導(dǎo)材料消毒的方法在生長(zhǎng)季節(jié)選取生長(zhǎng)旺盛紅皮云杉的3 4厘米長(zhǎng)的頂芽或帶側(cè)芽的莖段為外植體，將嫩芽依次在75%的酒精、0. 15%的HgCl2U. 5%的次氯酸鈉溶液中進(jìn)行消毒滅菌處理，其時(shí)間依次是消毒20-40秒，滅菌15分鐘，再消毒10-20分鐘，最后用無(wú)菌水漂洗至少2次；2、不定芽誘導(dǎo)和繼代增殖將經(jīng)過(guò)消毒滅菌后的上述嫩芽在無(wú)菌工作環(huán)境中接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中3/4MS培養(yǎng)基、6-BA 2. Omg/L,O. 6mg/L玉米素ZT、蔗糖30_40g/L、活性炭lmg/L、瓊脂 7-8g/L ;培養(yǎng)條件為:控制PH為6. 5，溫度20-250C，14小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度1500LX，經(jīng) 10天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)芽分化；將誘導(dǎo)出的不定芽切割后再繼代培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)基中在相同的條件下增殖，25天為I個(gè)繼代增殖周期，每I個(gè)繼代增殖周期由I個(gè)芽可增殖形成3 4個(gè)芽；3、叢生芽誘導(dǎo)將繼代培養(yǎng)得到的不定芽接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)1/2MS培養(yǎng)基、赤霉素O. 05mg/L、萘乙酸O. 05mg/L、蔗糖30_40g/L、活性炭Img/ L、瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為:控制PH為6. 5，溫度18-22°C，11-12小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度 1300LX，經(jīng)10天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)叢生芽；4、生根培養(yǎng)將叢生芽誘導(dǎo)得到的不定芽接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)1/2MS培養(yǎng)基、吲哚丁酸O. 5mg/L、萘乙酸O. 05mg/L、蔗糖30-40g/L、活性炭lmg/L、瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為:控制PH為6. 5，溫度18-20°C，16-18 小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度1400-1600LX，經(jīng)20天培養(yǎng)便可生出根毛，生根率可達(dá)93%，每個(gè)分化芽有根4 5條；5、試管苗移栽當(dāng)不定根長(zhǎng)至I. O厘米時(shí)，打開(kāi)瓶口的封口膜，在光照培養(yǎng)室內(nèi)煉苗3-4天，然后用鑷子把試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入裝有基質(zhì)的容器內(nèi)，所述基質(zhì)由體積比珍珠巖30% :蛭石20% :腐殖土 50%組成。
具體實(shí)施方式
三該具體實(shí)施方式
包括如下步驟1、外植體誘導(dǎo)材料消毒的方法在生長(zhǎng)季節(jié)選取生長(zhǎng)旺盛紅皮云杉的3 4厘米長(zhǎng)的頂芽或帶側(cè)芽的莖段為外植體， 將嫩芽依次在75%的酒精、O. 15%的HgCl2U. 5%的次氯酸鈉溶液中進(jìn)行消毒滅菌處理，其時(shí)間依次是消毒20-40秒，滅菌30分鐘，再消毒10-20分鐘，最后用無(wú)菌水漂洗至少2次；
2、不定芽誘導(dǎo)和繼代增殖將經(jīng)過(guò)消毒滅菌后的上述嫩芽在無(wú)菌工作環(huán)境中接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中3/4MS培養(yǎng)基、6-BA 2. Omg/L,O. 3mg/L玉米素ZT、蔗糖30_40g/L、活性炭lmg/ L、瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為控制PH為6. 5，溫度20_25°C，15小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度 1200LX，經(jīng)15天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)芽分化；將誘導(dǎo)出的不定芽切割后再繼代培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)基中在相同的條件下增殖，30天為I個(gè)繼代增殖周期，每I個(gè)繼代增殖周期由I個(gè)芽可增殖形成3 4個(gè)芽；3、叢生芽誘導(dǎo)將繼代培養(yǎng)得到的不定芽接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)1/2MS培養(yǎng)基、赤霉素O. lmg/L、萘乙酸O. 01mg/L、蔗糖30_40g/L、活性炭lmg/L、瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為控制PH為6. 5，溫度18-22 °C，11-12小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度1500LX，經(jīng)12天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)叢生芽；4、生根培養(yǎng)將叢生芽誘導(dǎo)得到的不定芽接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)1/2MS培養(yǎng)基、吲哚丁酸O. lmg/L、萘乙酸O. 01mg/L、蔗糖30-40g/L、活性炭lmg/L、瓊脂7_8g/L ;培養(yǎng)條件為控制PH為6. 5，溫度 18-200C，16-18小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度1400-1600LX，經(jīng)23天培養(yǎng)便可生出根毛，生根率可達(dá)95 %，每個(gè)分化芽有根4 5條；5、試管苗移栽當(dāng)不定根長(zhǎng)至I. O厘米時(shí)，打開(kāi)瓶口的封口膜，在光照培養(yǎng)室內(nèi)煉苗3-4天，然后用鑷子把試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入裝有基質(zhì)的容器內(nèi)，所述基質(zhì)由體積比珍珠巖23-30% :蛭石20-30% :腐殖土 47-55% 組成。本實(shí)施方式中，紅皮云杉頂芽或帶側(cè)芽的莖段經(jīng)10-20天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)芽分化，20-30天為I個(gè)繼代增殖周期，經(jīng)10-15天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)叢生芽，經(jīng)20-25天培養(yǎng)便可生出根毛，生根率最高達(dá)到了 95%，整個(gè)繁殖周期最短達(dá)到了 40天，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)縮短了繁殖周期，提高了繁殖效率，增加了經(jīng)濟(jì)效益。
權(quán)利要求
1.一種紅皮云杉離體快速繁殖的方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)、外植體誘導(dǎo)材料消毒的方法在生長(zhǎng)季節(jié)選取生長(zhǎng)旺盛紅皮云杉的3 4厘米長(zhǎng)的頂芽或帶側(cè)芽的莖段為外植體，將嫩芽依次在75%的酒精、O. 15%的HgCl2U. 5%的次氯酸鈉溶液中進(jìn)行消毒滅菌處理，其時(shí)間依次是消毒20-40秒，滅菌10-30分鐘，再消毒10-20 分鐘，最后用無(wú)菌水漂洗至少2次；2)、不定芽誘導(dǎo)和繼代增殖將經(jīng)過(guò)消毒滅菌后的上述嫩芽在無(wú)菌工作環(huán)境中接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中3/4MS培養(yǎng)基、6-BA O. 0-2. 0mg/L、0. 3-1. Omg/L玉米素ZT、蔗糖 30-40g/L、活性炭lmg/L、瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為:控制PH為6. 5，溫度20_25°C，13-15小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度1200-1800LX，經(jīng)10-20天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)芽分化；將誘導(dǎo)出的不定芽切割后再繼代培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)基中在相同的條件下增殖，20-30天為I個(gè)繼代增殖周期，每I個(gè)繼代增殖周期由I個(gè)芽可增殖形成3 4個(gè)芽；3)、叢生芽誘導(dǎo)將繼代培養(yǎng)得到的不定芽接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo) 1/2MS 培養(yǎng)基、赤霉素 O. 01-0. lmg/L、萘乙酸 O. 01-0. lmg/L、蔗糖 30_40g/L、活性炭 lmg/L、 瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為控制PH為6. 5，溫度18-220C，11-12小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度 1000-1500LX，經(jīng)10-15天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)叢生芽；4)、生根培養(yǎng)將叢生芽誘導(dǎo)得到的不定芽接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo) 1/2MS 培養(yǎng)基、吲哚丁酸 O. 1-1. Omg/L、萘乙酸 O. 01-0. lmg/L、蔗糖 30_40g/L、活性炭 Img/ L、瓊脂7-8g/L ;培養(yǎng)條件為控制PH為6. 5，溫度18_20°C，16-18小時(shí)的光周期，光照強(qiáng)度 1400-1600LX，經(jīng)20-25天培養(yǎng)便可生出根毛，生根率可達(dá)90-95 %，每個(gè)分化芽有根4 5 條;5)、試管苗移栽當(dāng)不定根長(zhǎng)至I.O厘米時(shí)，打開(kāi)瓶口的封口膜，在光照培養(yǎng)室內(nèi)煉苗 3-4天，然后用鑷子把試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入裝有基質(zhì)的容器內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟2中所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為3/4MS培養(yǎng)基、6-BA 2. 0mg/L>0. 6-1. Omg/L 玉米素 ZT、鹿糖 30_40g/L、活性炭 lmg/L、瓊脂 7_8g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟4中所述生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基、吲哚丁酸O.5mg/L、萘乙酸 O. 05mg/L、鹿糖 30_40g/L、活性炭 lmg/L、瓊脂 7_8g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟5中所述基質(zhì)由體積比珍珠巖23-30%:蛭石 20-30% :腐殖土 47-55% 組成。
全文摘要
一種紅皮云杉離體快速繁殖的方法，該方法包括如下步驟1)外植體誘導(dǎo)材料消毒的方法；2)不定芽誘導(dǎo)和繼代增殖；3)叢生芽誘導(dǎo)；4)生根培養(yǎng)；5)試管苗移栽。利用本方法，經(jīng)10-20天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)芽分化，20-30天為1個(gè)繼代增殖周期，經(jīng)10-15天培養(yǎng)便可得以誘導(dǎo)叢生芽，經(jīng)20-25天培養(yǎng)便可生出根毛，生根率最高達(dá)到了95%，整個(gè)繁殖周期最短達(dá)到了40天，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)縮短了繁殖周期，提高了繁殖效率，增加了經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102577964SQ20121005002
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者王振芳 申請(qǐng)人:常熟市方園紡織器材廠