專利名稱：甜櫻桃PaAP1基因及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甜櫻桃PaAPl基因及其應用。
背景技術(shù)：
開花是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的一個重要轉(zhuǎn)折點，研究表明MASDSbox基因從5個階段參與花發(fā)育過程的調(diào)節(jié)(Gunter et al. , 2000 ；Okada and Shimura, 1994)。其中 API (APETALA1)同源基因在開花誘導和花器官的形成過程中均起著至關(guān)重要的作用[Coen and Meyerowttz, 1991 ；Bowman et al. , 1993 ；Jofuku et al. ,1994]。目前，研究人員已從甜橙、黃金梨、蘋果、枇杷、桃、棗、葡萄、美洲山楊、香脂楊和柳樹和藍桉等十多種木本植物中分離克隆了 APl同源基因全長cDNA。呂晉慧等(2007)將APl同源基因轉(zhuǎn)入地被菊‘玉人面'品種中，能使菊花提早開花。2001年，Pena等將APl和LFY同源基因?qū)敫涕?，得到的轉(zhuǎn)基因柑桔當年開花、果實正常，其種子于當年播種，第二年春天即開花結(jié)果。Nobuhiro 等(2002)把蘋果的MdMADS5基因(API同源基因)導入到擬南芥中，能使轉(zhuǎn)基因擬南芥提早開花。另外，將擬南芥的花分生組織決定基因(例如LFY，APl和FT等)導入歐洲山楊和枳橙，同樣也能使轉(zhuǎn)基因植物提早開花[Weigel and Nilsson, 1995 ；Rottmann et al. , 2000 ； Endo et al. , 2005 ;B01enius et al. ,2006]。甜櫻桃在都市農(nóng)業(yè)發(fā)展中占有重要的地位，因其具有較高的收益而在近年發(fā)展迅速，但是櫻桃樹體高大、進入結(jié)果期較晚，常規(guī)管理需要3-4年才能開花結(jié)果，5-7年才能進入盛果期。選育幼齡期短開花早的甜櫻桃品種一直是重要的育種方向[萬仁先，畢可華主編，現(xiàn)代大櫻桃栽培，1992，中國農(nóng)業(yè)科技出版社]。紅蜜是國內(nèi)自主培育的櫻桃品種，3-4 年就可開花，具有幼齡期短和豐產(chǎn)的特點。從紅蜜中克隆APl的同源基因，預期提供一個具有促進櫻桃或其它植物早開花的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與甜櫻桃幼齡期相關(guān)的基因，以便通過該基因或其衍生物篩選或改良甜櫻桃(甚至其它植物)，獲得幼齡期短開花早的品種。本發(fā)明還涉及所述基因的一些衍生物及一些相關(guān)的應用。具體來講涉及以下內(nèi)容甜櫻桃PaAPl基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 12所示。甜櫻桃PaAPl基因，其編碼的氨基酸的序列如SEQ ID NO : 12所示。由于密碼子簡并性，會涉及多條序列。初始獲得的基因是如SEQ ID N0:11所不的序列。重組了所述的甜櫻桃PaAPl基因的重組載體。轉(zhuǎn)化了所述重組載體的轉(zhuǎn)化體。將所述甜櫻桃PaAPl基因轉(zhuǎn)化擬南芥或甜櫻桃使其早開花的應用。甜櫻桃的轉(zhuǎn)化在品種或砧木都可以。所述蛋白的應用，涉及利用該蛋白篩選早開花的擬南芥或甜櫻桃。
所述的甜櫻桃PaAPl基因的應用，涉及利用該基因篩選早開花的擬南芥或甜櫻桃。所述的甜櫻桃PaAPl基因?qū)M南芥和甜櫻桃的開花期有顯著影響，可以通過該基因或其衍生物篩選或改良甜櫻桃及其砧木(甚至其它植物)，獲得幼齡期短開花早的品種。


圖I為PaAPl編碼區(qū)擴增結(jié)果；圖2為櫻桃PaAPl蛋白屬于MADS蛋白家族的分析；圖3為櫻桃PaAPl蛋白和部分同源蛋白序列的進化樹分析結(jié)果；圖4表示PaAPl基因在不同時期花芽及不同組織中的表達；其中中2、34、27、40、 38、37、42為花芽，分別在6月10日、6月16日、6月29日、7月10日、7月22日、8月4日、 9月9日采取。19、33、41、39、21、17、32、29為葉芽，分別在6月3日、6月16日、6月29日、 7月10日、7月22日、8月4日、8月20日、9月9日采取。HB :花瓣，HE :花萼，leaf =Bf, steam :莖，XR :雄蕊，ZT :柱頭。以上樣品在圖4的橫坐標中按照以上順序排列。圖5表示PaAPl表達載體；
圖6為TO代轉(zhuǎn)基因株系PCR鑒定結(jié)果；其中，泳道I :野生型；泳道2-5 :轉(zhuǎn)基因株系；泳道6 :陰性對照；泳道7-12 :轉(zhuǎn)基因株系；
圖7為轉(zhuǎn)基因株系(右)和野生型(左)的GFP表達情況
圖8為擬南芥轉(zhuǎn)基因株系；
圖9為擬南芥野生型；
圖10為Tl代轉(zhuǎn)基因擬南芥早開花的情況，Tl代轉(zhuǎn)基因擬南芥(左)2片真葉出現(xiàn)花序分離，同時期的野生型(右)8片真葉尚未開花；
圖11為轉(zhuǎn)基因株系Tl代的PaAPl表達分離結(jié)果。
具體實施例方式下面具體說明如SEQ ID NO=Il所示的甜櫻桃PaAPl基因的制得過程及其一些應用。一、如SEQ ID NO 11所示的甜櫻桃PaAPl基因的制得(為了更好地理解本發(fā)明， 文中附帶了一些對該基因的分析)I.材料和方法I. I 材料6月10日、6月16日、6月29日、7月10日、7月22日、8月4日、9月9日采取分別取紅蜜花芽和葉芽。枝條基部飽滿的芽為花芽，枝條上半部的形態(tài)較尖芽為葉芽。4月9 日收集花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊及未展開花的子房和柱頭，立即放在_80°C冰箱保存。I. 2 方法I. 2. IRNA 的提取用艾德萊生物公司的植物RNA提取試劑盒，按照說明書進行RNA的提取，I %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性和濃度。I. 2. 2RT-PCR反應中第一鏈cDNA的合成
將總RNA, I μ I oligo (dT) 15primer, I μ I IOmM dNTP,和 dd H2O 按總體積 13 μ I 在冰浴中混勻，65°C加熱變性5min后,冰浴中迅速冷卻lmin。依次加入4μ1 5Xreaction buffer,I μ I RNAsin(Promega), I μ I O.IM DTT,I μ I Superscript IIIrt 逆轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen)，混勻，50°C溫育60min后，70°C 15min滅活，冰上冷卻，產(chǎn)物直接用于RT-PCR。I. 2. 3PaAPl編碼區(qū)引物設(shè)計及全長序列獲得根據(jù)NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)數(shù)據(jù)庫中已釋放的樓花 APl 序列(GQ267074) 設(shè)計全長引物AP1-7F和AP1-7R(表1，也可見序列表SEQ ID NO :1和2)，利用花瓣cDNA 做模板進行PCR。反應體系為在20 μ I反應體系中，模板20ng, IOXreaction buffer
2μ I, I. 5mM Mg2+，dNTP 0. 25mM, Primer 0. 2 μ M, Taq 酶 lu，ddH20 8 μ I。PCR 反應程序為 94°C 2min，35 個循環(huán)(94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 2min) ,72°C IOmin 延伸。PCR 產(chǎn)物在 I %瓊脂糖凝膠電泳分離后，將特異擴增片段回收。I. 2. 4PCR產(chǎn)物的克隆、測序與序列分析將回收PCR產(chǎn)物與pMD-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌液PCR鑒定，將插入片段正確的8個陽性克隆提取質(zhì)粒，用Beckman CEQ8000測序儀測序。將測得的序列用DNAMAN， DNAstar，MEGA4等軟件分析，與已注冊的其它植物APl基因進行同源性比較。I. 2. 5熒光實時定量表達分析1.2. 5. I引物設(shè)計和驗證根據(jù)克隆得到的PaAPl,和NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)數(shù)據(jù)庫中已釋放的樓桃 ACTIN(FJ560908)序列設(shè)計引物 APl-F-QU APl-R-Ql、ACT-F-Ql、ACT-R-Ql (表 1，也可見序列表SEQ ID NO :3-6)，用于PaAPl熒光實時定量表達分析。利用紅蜜6月16花芽cDNA 為模板檢測引物的特異性和最適退火溫度。結(jié)果顯示陰性對照的C(t)值接近于40，而且 API-F-QI/API-R-QI和ACT-F-QI/ACT-R-QI只有單峰沒有雜峰出現(xiàn)，說明可以用于熒光實時定量表達分析，API-F-QI/API-R-QI最適退火延伸溫度是55°C。I. 2. 5. 2反應體系、程序及分析IOul 反應體系中包括 IOng cDNA, 5ul Ssofast Evagreen suppermix (伯樂公司)，200nM引物。反應程序為94°C 5min，40個循環(huán)(94°C 5sec，55/57°C 5sec)，溶解曲線 65°C -95°C 5sec(+0. 5°C / 循環(huán))。分析在 CFX96Real_Time system(伯樂)儀器上進行。 每個反應設(shè)三個重復，每個引物設(shè)三個不加模板的陰性對照。當陰性對照檢測不到擴增產(chǎn)物而且樣品三個重復的C(t)之間的標準差小于O. 5時數(shù)據(jù)可用，用Bio-Rad CFX Manager 軟件進行數(shù)據(jù)分析及出柱狀圖。表I引物序列
權(quán)利要求
1.甜櫻桃PaAPl基因編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0:12所示。
2.甜櫻桃PaAPl基因，其特征在于，其編碼的氨基酸的序列如SEQID N0:12所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甜櫻桃PaAPl基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO: 11所示。
4.重組了權(quán)利要求2或3所述的甜櫻桃PaAPl基因的重組載體。
5.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求4所述的重組載體的轉(zhuǎn)化體。
6.權(quán)利要求2或3所述的甜櫻桃PaAPl基因的應用，其特征在于，將所述甜櫻桃PaAPl 基因轉(zhuǎn)化擬南芥或甜櫻桃，使其早開花。
7.權(quán)利要求I所述的蛋白的應用，其特征在于，利用該蛋白篩選早開花的擬南芥或甜櫻桃。
8.權(quán)利要求2或3所述的甜櫻桃PaAPl基因的應用，其特征在于，利用該基因篩選早開花的擬南芥或甜櫻桃。
全文摘要
本發(fā)明涉及如SEQ ID NO11所示的甜櫻桃PaAP1基因及其在提早花期方面的用途。所述的甜櫻桃PaAP1基因?qū)M南芥和甜櫻桃的開花期有顯著影響，可以通過該基因或其衍生物篩選或改良甜櫻桃及其砧木(甚至其它植物)，獲得幼齡期短開花早的品種。
文檔編號A01H5/00GK102584969SQ20121000988
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者周宇, 張開春, 張曉明, 王晶, 閆國華 申請人:北京市農(nóng)林科學院