專利名稱:促進(jìn)白芨種子萌發(fā)的一株真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域,具體說(shuō)涉及促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)的三株真菌菌 株,能夠與蘭科植物種子伴播,用于育苗盤或花盆或苗床的育苗或大田的栽培。
背景技術(shù):
蘭科植物中有很多傳統(tǒng)名貴中藥,比如石斛,白芨等。根據(jù)《中國(guó)藥典》2005版的 記載,石斛具有益胃生津、滋陰清熱的功效,還能利咽明目,調(diào)節(jié)人體免疫功能。白芨以塊莖 入藥,具有收斂止血、消腫生肌等功效,主治咳血吐血,外傷出血,瘡瘍腫毒,皮膚皸裂,肺結(jié) 核咳血、潰瘍病出血,同時(shí)還能治療尿血、便血等癥。藥用石斛的記載始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,是“九大仙草”之首。可作 藥用的蘭科石斛屬植物有30多種,目前國(guó)內(nèi)鐵皮石斛、金釵石斛、束花石斛,齒瓣石斛、鼓 槌石斛等一些名貴的藥用石斛資源奇缺,其中鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall, ex Lindl)的自然資源已瀕臨枯竭,該植物已被列入國(guó)家保護(hù)植物名錄,而其昂貴的價(jià)格更加 劇了對(duì)其資源的毀滅性破壞。石斛屬植物的自然繁殖率低,生長(zhǎng)緩慢,這也是導(dǎo)致其資源瀕 危的一個(gè)重要因素。白芨目前基本上依靠采集野生藥材經(jīng)加工后供藥用。由于需求量的增加,導(dǎo)致藥 農(nóng)對(duì)野生資源大量采挖,野生資源在不斷減少,產(chǎn)量在不斷下降,價(jià)格卻一直在不斷增長(zhǎng), 目前已經(jīng)處于瀕危狀態(tài)。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)瀕危物種的保護(hù)和應(yīng)用的雙重目的,在拯救和保護(hù)珍稀瀕危物種的同 時(shí),還要對(duì)物種所在的整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行研究,以利于資源的可持續(xù)利用。蘭科藥用植物種 子的田間萌發(fā)一直是一個(gè)難題,尤其是石斛種子的田間萌發(fā)國(guó)內(nèi)外尚無(wú)人研究。研究石斛 屬種子的萌發(fā)以及真菌在種子萌發(fā)過(guò)程中所起的作用,是石斛屬植物資源保護(hù)的一個(gè)重要 內(nèi)容。關(guān)于石斛屬植物的栽培技術(shù)研究目前已有一些報(bào)道,利用組織培養(yǎng)的方法已經(jīng)能 夠獲得栽培用的幼苗,并在云南省和浙江省等地有小規(guī)模的栽培。但是在實(shí)際應(yīng)用中,使用 組培快繁獲得的無(wú)菌苗進(jìn)行栽培時(shí),練苗和移栽兩個(gè)環(huán)節(jié)不僅從技術(shù)上,也從生產(chǎn)成本上 限制了該方法的推廣應(yīng)用。在這方面技術(shù)未獲得突破之前,石斛屬植物還難以實(shí)現(xiàn)大面積 的栽培生產(chǎn)。關(guān)于白芨的栽培技術(shù)目前僅有散見(jiàn)的報(bào)道,但是都缺乏系統(tǒng)的研究,而且沒(méi)有大 面積栽培基地出現(xiàn),傳統(tǒng)的依靠野生植株無(wú)性繁殖的方法進(jìn)行栽培目前還有很多問(wèn)題需要 解決。野生變家種需要一段較長(zhǎng)的馴化過(guò)程,但是目前還未見(jiàn)有此方面的報(bào)道。使用組織培 養(yǎng)的方法解決瀕危植物的繁殖和種質(zhì)保存問(wèn)題是一條有效的途徑,目前,已經(jīng)有一些單位 開展了種子,莖尖及側(cè)芽,假鱗莖的組織培養(yǎng)和快速繁殖研究,能夠在一段時(shí)間內(nèi)獲得無(wú)菌 苗,但是練苗和移栽是一個(gè)限制其應(yīng)用的難題,目前還沒(méi)有有效的練苗移栽方法,這方面技 術(shù)獲得突破后,才可能得到實(shí)際的應(yīng)用。另外,白芨作為一種常用的中藥,其發(fā)生療效的作 用基礎(chǔ)往往是復(fù)合化學(xué)成分的共同作用,而無(wú)菌苗在繁殖中由于激素或其他因素作用,可能導(dǎo)致內(nèi)部成分發(fā)生變異,這種變異在培養(yǎng)中往往不易辨認(rèn),因此無(wú)菌苗栽培得到的植株, 其成分含量有無(wú)變化,能否代替藥材使用,也是有待研究的課題。蘭科植物的種子被稱為“灰塵種子”,具有以下特點(diǎn)種子細(xì)小,種子量巨大,每個(gè) 蒴果內(nèi)有幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)粒種子,在自然界很難萌發(fā),只有依靠適合的真菌為其提供營(yíng)養(yǎng)才 能夠萌發(fā)。找到能促進(jìn)蘭科藥用植物種子萌發(fā)的真菌,并利用互作技術(shù)使種子能夠在自然 條件下萌發(fā),是實(shí)現(xiàn)蘭科藥用植物田間栽培的有效方法。目前,國(guó)內(nèi)外有關(guān)促進(jìn)蘭科藥用植物種子萌發(fā)真菌的研究報(bào)道很少,還沒(méi)有發(fā)現(xiàn) 能促進(jìn)種子萌發(fā)優(yōu)良真菌。近幾年,我們使用新的真菌分離技術(shù),分離到了對(duì)蘭科藥用植物 種子萌發(fā)有促進(jìn)作用的真菌。與種子的無(wú)菌萌發(fā)和組織培養(yǎng)相比,種子與真菌的共生萌發(fā) 能解決蘭科藥用植物種子的田間應(yīng)用難題,從而減少生產(chǎn)環(huán)節(jié),降低生產(chǎn)成本,具有巨大的 應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能夠促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)的三株真菌菌株。為解決蘭科植 物某些種的瀕?,F(xiàn)狀提供一條新的途徑。本發(fā)明采用的3株真菌經(jīng)鑒定分別為絲核菌屬真菌BsglKRhizoctonia sp.),保藏編號(hào) CGMCC No. 2450,膠膜菌屬真菌 Bsgl4 (Tulasnella sp.),保藏編號(hào) CGMCC No. 2451,這2株真菌于2008年4月14日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心保藏,小菇屬真菌MF24 (Mycena sp.),保藏編號(hào)CGMCC No. 1350,該菌株于2005年4月20 日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏,保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū) 大屯路甲3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。3株真菌的保藏和存活證明見(jiàn)附件。三株真菌的培養(yǎng)特性分別為Bsgll 在PDA培養(yǎng)基上,菌落圓形,初期菌落白色,后期正面和背面都為淺黃色, 氣生菌絲不發(fā)達(dá),25°C生長(zhǎng)一周的菌落直徑為8. 8厘米,常規(guī)培養(yǎng)基上不產(chǎn)生孢子。Bsgl4 在PDA培養(yǎng)基上,初期和后期的菌落都為白色,菌落圓形,氣生菌絲不發(fā) 達(dá),25°C生長(zhǎng)一周的菌落直徑為6. 8厘米,常規(guī)培養(yǎng)基上不產(chǎn)生孢子。MF24:在PDA培養(yǎng)基上,初期和后期的菌落都為白色,菌落圓形,氣生菌絲較發(fā)達(dá), 25°C生長(zhǎng)一周的菌落直徑為5. 5厘米,常規(guī)培養(yǎng)基上不產(chǎn)生孢子。本發(fā)明所述三株真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)核糖體DNA的序列如序列表所示。本發(fā)明所述三株真菌具有與蘭科植物種子互作使種子共生萌發(fā)的作用,蘭科植物 種類可以為鐵皮石斛,兜唇石斛,黑毛石斛,束花石斛,齒瓣石斛,白芨。本發(fā)明所述三株真菌可以用于蘭科植物種子共生萌發(fā)的研究,也可以與蘭科植物 種子伴播,用于育苗盤或花盆或苗床的育苗或大田的栽培。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所述的真菌菌株具有與部分蘭科植物種子互作而使其共生萌發(fā)的生理活 性,有助于解決蘭科植物種子在田間難于萌發(fā)的問(wèn)題,能夠?yàn)樘m科植物資源的保護(hù)和可持 續(xù)利用以及繁殖和栽培提供一個(gè)有力的工具,具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1萌發(fā)真菌的分離在白芨和石斛的適宜生長(zhǎng)環(huán)境中播種種子,獲得種子、原球莖和幼苗,經(jīng)過(guò)對(duì)萌發(fā) 材料表面消毒后分離篩選得到萌發(fā)真菌。實(shí)施例2Bsgl4對(duì)鐵皮石斛種子的萌發(fā)效果把鐵皮石斛種子播種到已經(jīng)長(zhǎng)滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉和鋸末上,以滅菌 的麥麩、樹葉和鋸末上播種種子為對(duì)照,在培養(yǎng)室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為23-27°C,每日光照 12小時(shí),光照強(qiáng)度為1200Lx,兩個(gè)月時(shí)調(diào)查種子萌發(fā)情況,結(jié)果為接種Bsgl4真菌處理的 鐵皮石斛種子萌發(fā)率為67. 3%,不接真菌處理的鐵皮石斛種子萌發(fā)率為0. 0%。實(shí)施例3Bsgl4對(duì)鐵皮石斛種子的萌發(fā)效果把鐵皮石斛種子播種到已經(jīng)長(zhǎng)滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉和鋸末上,以滅菌 的麥麩、樹葉和鋸末上播種種子為對(duì)照,在溫室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為15-26°C,自然光照,每 目光照時(shí)間為8-10小時(shí),兩個(gè)月時(shí)調(diào)查種子萌發(fā)情況,結(jié)果為接種Bsgl4真菌處理的鐵皮 石斛種子萌發(fā)率為65. 1 %,不接真菌處理的鐵皮石斛種子萌發(fā)率為0. 0 %。實(shí)施例4Bsgl4對(duì)鐵皮石斛種子的萌發(fā)效果把真菌菌絲接種到麥麩、樹皮和鋸末上,待長(zhǎng)滿菌絲后,把以上接菌材料撒到大 田,在這些菌材上播種種子,然后覆蓋一層枯枝落葉,保持濕度;以不接種真菌,其他條件相 同的處理為對(duì)照,三個(gè)月時(shí)調(diào)查種子萌發(fā)情況,結(jié)果為接種Bsgl4真菌處理的鐵皮石斛種 子萌發(fā)率為56. 9%,不接真菌處理的鐵皮石斛種子萌發(fā)率為0. 0%。實(shí)施例5Bsgl4對(duì)白芨種子的萌發(fā)效果把白芨種子播種到已經(jīng)長(zhǎng)滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、土壤和鋸末上,以滅菌的麥 麩、土壤和鋸末上播種為對(duì)照,在溫室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為15-26°C,自然光照,每日光照時(shí) 間為8-10小時(shí),三個(gè)月時(shí)調(diào)查萌發(fā)率,結(jié)果為接種Bsgl4真菌處理的白芨種子萌發(fā)率為 61. 2%,不接真菌處理的白芨種子萌發(fā)率為0. 0%。實(shí)施例6Bsgll對(duì)白芨種子的萌發(fā)效果把白芨種子播種到已經(jīng)長(zhǎng)滿Bsgll真菌菌絲的麥麩、土壤和鋸末上,以滅菌的麥 麩、土壤和鋸末上播種為對(duì)照,在溫室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為15-26°C,自然光照,每日光照時(shí) 間為8-10小時(shí),三個(gè)月時(shí)調(diào)查萌發(fā)率,結(jié)果為接種Bsgl4真菌處理的白芨種子萌發(fā)率為 45.2%,不接真菌處理的白芨種子萌發(fā)率為0.0%。實(shí)施例7MF24對(duì)白芨種子的萌發(fā)效果把白芨種子播種到已經(jīng)長(zhǎng)滿MF24真菌菌絲的麥麩、土壤和鋸末上,以滅菌的麥 麩、土壤和鋸末上播種為對(duì)照,在溫室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為15-26°C,自然光照,每日光照時(shí)
5率,結(jié)果為接種Mf24真菌處理的白芨種子萌發(fā)率為 36. 9%,不接真菌處理的白芨種子萌發(fā)率為0. 0%。實(shí)施例8Bsgl4對(duì)束花石斛種子的萌發(fā)效果把束花石斛種子播種到已經(jīng)長(zhǎng)滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉或鋸末上,以滅菌 的麥麩、樹葉或鋸末上播種為對(duì)照,在溫室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為15-26°C,自然光照,每日光 照時(shí)間為8-10小時(shí),兩個(gè)月時(shí)調(diào)查種子萌發(fā)情況,結(jié)果為接種Bsgl4真菌處理的束花石斛 種子萌發(fā)率為73. 2%,不接真菌處理的束花石斛種子萌發(fā)率為0. 0%。實(shí)施例9Bsgl4對(duì)齒瓣石斛種子的萌發(fā)效果把齒瓣石斛種子播種到已經(jīng)長(zhǎng)滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉或鋸末上,以滅菌 的麥麩、樹葉或鋸末上播種為對(duì)照,在溫室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為15-26°C,自然光照,每日光 照時(shí)間為8-10小時(shí),兩個(gè)月時(shí)調(diào)查種子萌發(fā)情況,結(jié)果為接種Bsgl4真菌處理的齒瓣石斛 種子萌發(fā)率為65. 1 %,不接真菌處理的齒瓣石斛種子萌發(fā)率為0. 0 %。實(shí)施例10Bsgl4對(duì)兜唇石斛種子的萌發(fā)效果把兜唇石斛種子播種到已經(jīng)長(zhǎng)滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉或鋸末上,以滅菌 的麥麩、樹葉或鋸末上播種為對(duì)照,在溫室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為15-26°C,自然光照,每日光 照時(shí)間為8-10小時(shí),兩個(gè)月時(shí)調(diào)查種子萌發(fā)情況,結(jié)果為接種Bsgl4真菌處理的兜唇石斛 種子萌發(fā)率為16. 4%,不接真菌處理的兜唇石斛種子萌發(fā)率為0. 0%。實(shí)施例11Bsgl4對(duì)黑毛石斛種子的萌發(fā)效果把黑毛石斛種子播種到已經(jīng)長(zhǎng)滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉或鋸末上,以滅菌 的麥麩、樹葉或鋸末上播種為對(duì)照,在溫室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為15-26°C,自然光照,每日光 照時(shí)間為8-10小時(shí),兩個(gè)月時(shí)調(diào)查種子萌發(fā)情況,結(jié)果為接種Bsgl4真菌處理的黑毛石斛 種子萌發(fā)率為85. 4%,不接真菌處理的黑毛石斛種子萌發(fā)率為0. 0%。比較例1光照對(duì)真菌Bsgl4與鐵皮石斛種子共生萌發(fā)的影響采用菌葉法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),把真菌接種到滅菌的栗樹葉上,待樹葉表面長(zhǎng)滿菌絲后把 鐵皮石斛種子播種到樹葉表面,于25士2°C的環(huán)境中共培養(yǎng)。光照條件設(shè)以下2種處理(1) 光照培養(yǎng)光照強(qiáng)度為1200LX,光周期為12小時(shí)。在此條件下,與真菌Bsgl4共生培養(yǎng)的 處理組記作L,不接真菌的對(duì)照組記作LCK。(2)黑暗培養(yǎng)在此條件下,與真菌Bsgl4共生 培養(yǎng)的處理組記作D,不接真菌的對(duì)照組記作DCK。以上各組均設(shè)4次重復(fù)。從培養(yǎng)的第1 周開始,每周調(diào)查各組種子的萌發(fā)率。結(jié)果見(jiàn)表1。表1.光照對(duì)真菌Bsgl4與鐵皮石斛種子共生萌發(fā)率的影響
6 光照能夠促進(jìn)真菌與鐵皮石斛種子的共生萌發(fā),表現(xiàn)為在種子萌發(fā)初期L處理組 的萌發(fā)率高于D處理組,培養(yǎng)第7周時(shí),L處理組的萌發(fā)率極顯著高于D處理組(P < 0. 01); 黑暗更有利于鐵皮石斛種子的萌發(fā),表現(xiàn)為D處理組的最終萌發(fā)率高于L處理組,培養(yǎng)第10 周時(shí),D處理組的萌發(fā)率顯著的高于L處理組的萌發(fā)率。繼續(xù)培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn),黑暗條件下萌 發(fā)的種子不能形成幼苗,而光照條件下的萌發(fā)的種子在2-3個(gè)月就可以形成幼苗。鐵皮石斛種子不能在無(wú)菌的樹葉上萌發(fā),表明菌葉法中真菌Bsgl4是誘導(dǎo)鐵皮石 斛種子萌發(fā)的唯一因素,說(shuō)明真菌Bsgl4具有促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)的生理功能。比較例2光照對(duì)真菌Bsgl4與白芨種子共生萌發(fā)的影響采用菌葉法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),把滅菌的栗樹葉置于真菌培養(yǎng)基表面,接種真菌,樹葉表面 長(zhǎng)滿菌絲后把白芨種子播種在樹葉表面,于25士2°C的環(huán)境中共培養(yǎng)。光照條件設(shè)以下2 種處理(1)光照培養(yǎng)光照強(qiáng)度為1200Lx,光周期為12小時(shí)。在此條件下,與真菌Bsgl4 共生培養(yǎng)的處理組記作L,不接真菌的對(duì)照組記作LCK。(2)黑暗培養(yǎng)在此條件下,與真菌 Bsgl4共生培養(yǎng)的處理組記作D,不接真菌的對(duì)照組記作DCK。以上各組均設(shè)4次重復(fù)。從 培養(yǎng)的第1周開始,每周調(diào)查各組種子的萌發(fā)率。結(jié)果見(jiàn)表2。表2.光照對(duì)真菌Bsgl4與白芨種子共生萌發(fā)率的影響 光照能夠促進(jìn)真菌與白芨種子的共生萌發(fā),表現(xiàn)為在種子萌發(fā)初期L處理組的萌 發(fā)率高于D處理組,培養(yǎng)第6周時(shí),L處理組的萌發(fā)率顯著高于D處理組(P <0.05);最終 萌發(fā)率仍然是L處理組高于D處理組,培養(yǎng)第8周時(shí),L處理組的萌發(fā)率高于D處理組的萌 發(fā)率。白芨種子不能在無(wú)菌的樹葉上萌發(fā),表明菌葉法中真菌Bsgl4是誘導(dǎo)白芨種子萌 發(fā)的唯一因素,說(shuō)明真菌Bsgl4具有促進(jìn)白芨種子萌發(fā)的生理功能。比較例3
3株真菌對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響。該實(shí)驗(yàn)與比較例2的試驗(yàn)時(shí)間及所用的種子不同。實(shí)驗(yàn)方法為把白芨種子播種 到已經(jīng)長(zhǎng)滿真菌菌絲的樹葉上,真菌選用三種,分別為BSgl4,BSgll,MF24。以無(wú)菌的樹葉 上播種為對(duì)照,在溫室條件下培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為20-27°C,從培養(yǎng)的第1周開始,每周調(diào)查各 組種子的萌發(fā)情況,結(jié)果見(jiàn)表3。以上每種處理重復(fù)4次。表3. 3株真菌對(duì)白芨種子萌發(fā)率的影響 3種真菌菌株都對(duì)白芨種子有很好的萌發(fā)效果。不加真菌的對(duì)照組種子萌發(fā)率始 終為0%,而加入真菌以后的試驗(yàn)處理組都有很高的萌發(fā)率,萌發(fā)的速度也很快,在第8周 達(dá)到了最大萌發(fā)率。不同真菌菌株與白芨種子互作使白芨種子共生萌發(fā)的效果有些差別,3 株真菌中,Bsgl4促進(jìn)白芨種子萌發(fā)的效果最好,種子的最終萌發(fā)率最高,而且萌發(fā)的速度 較快。
權(quán)利要求
促進(jìn)白芨種子萌發(fā)的一株真菌,它是保藏編號(hào)為CGMCC No.2450的絲核菌屬(Rhizoctonia sp.)真菌Bsg11,它能用于藥用植物白芨的種子共生萌發(fā)研究,或與白芨的種子伴播,用于育苗盤或花盆或苗床的育苗或大田的栽培。
2.如權(quán)利要求1所述的真菌Bsgll,其特征在于它的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)核糖體DNA的序列, 又稱為ITS序列,如下GTTGTCGCTGGCCCTTTCGGGGGCATGTGCACGCCTTCTCTTTCATCCACACACACCTGT 60 GCACTTGTGAGACGGAGGACCTTAATTTGGTCTTCCGTCTACTTAATCACACAAACTCAT 120 TTTAATTAAACTGAATGTAATTGATGTAACGCATCATTAGAACTAAGTTTCAACAACGGA 180 TCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAAAACGCACCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCA 240 AAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGAAGC 300 ATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATTCTCAAAGTAAATCTTTTTGTTAATTCAACTGGTTT 360 ACTTTGGACTTGGAGGTCTTTGCAAATTTCACGTCTGCTCCTCTTAAATGCATTAGCTGG 420 ATCTCAGTATATGCTTGGTTCCACTCGGCGTGATAAGTATCACTCGCTAAGGACACTGTT 480 AAAAAGGTGGCCAGGAAATACAGATGAACCGCTTCTAATAGTCTATTAAGTTAAACAATT 540 AAATTTTAAAATCTGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAA。
全文摘要
本發(fā)明公開了促進(jìn)白芨種子萌發(fā)的一株真菌,它的分類命名是保藏編號(hào)為CGMCC No.2450的絲核菌屬(Rhizoctonia sp.)真菌Bsg11。該菌株對(duì)于解決白芨種子的萌發(fā)問(wèn)題具有重要意義,可以與白芨種子伴播,用于育苗盤或花盆或苗床的育苗或大田的栽培,具有代替組織培養(yǎng)獲得種苗的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01G1/00GK101914457SQ20101026275
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月24日
發(fā)明者房慧勇, 肖培根, 郭順星, 陳曉梅 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所