專利名稱：耐鹽蘆葦?shù)臒o(wú)性繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的無(wú)性繁殖方法，特別是涉及耐鹽蘆葦?shù)囊环N無(wú)性繁殖方法。
背景技術(shù)：
蘆葦(Phragmites communis)屬多年生禾本科植物，具有多種用途其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的粗蛋白含量在禾草中居于上等，是一種優(yōu)良的飼料；葉、莖、花和根可以入藥；成熟后纖維素含量高達(dá)44％，與木材相仿，是我國(guó)重要的造紙?jiān)?；另外，蘆葦在城市污水處理和淡(海)水養(yǎng)殖中可以起到凈化水體的作用，因而在池塘中種植蘆葦可以顯著提高蝦苗的成活率。
蘆葦是典型的無(wú)性系植物，天然種群主要依靠營(yíng)養(yǎng)繁殖補(bǔ)充更新。其耐鹽變異植株的葉綠素含量高于野生植株，生長(zhǎng)量也比野生植株大。因此，快速繁殖耐鹽蘆葦以滿足工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)保需要，具有重要的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種耐鹽蘆葦?shù)臒o(wú)性繁殖方法。
本發(fā)明所提供的耐鹽蘆葦?shù)臒o(wú)性繁殖方法，包括以下步驟1)以帶有芽原基的莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，肌醇和蔗糖；2)將愈傷組織置于胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織；胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；3)將胚性愈傷組織置于體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基上進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化；體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；4)將分化出苗的體細(xì)胞胚置于快繁培養(yǎng)基上進(jìn)行苗的快速繁殖；快繁培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐氨基嘌呤(6-BA)，α-萘乙酸(NAA)和蔗糖；5)將苗置于生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了吲哚丁酸(IBA)，α-萘乙酸和蔗糖。
愈傷組織和胚性愈傷組織誘導(dǎo)條件為在25±2℃下，暗培養(yǎng)26-30天；優(yōu)選的暗培養(yǎng)時(shí)間為28天。
體細(xì)胞胚的分化條件為在25±2℃下，培養(yǎng)40-44天；優(yōu)選的培養(yǎng)時(shí)間為42天。
快速繁殖條件為在25±2℃下，培養(yǎng)26-30天；優(yōu)選的培養(yǎng)時(shí)間為28天。
生根條件為在25±2℃下，培養(yǎng)26-30天；優(yōu)選的培養(yǎng)時(shí)間為28天。
在上述步驟中所用到的培養(yǎng)基添加劑或添加物的濃度為所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.18-2.2mg/L，優(yōu)選為2.0mg/L，肌醇濃度為180-220mg/L，優(yōu)選為200mg/L，蔗糖濃度為4.0±0.5％，優(yōu)選為4.0％；所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.8-1.2mg/L，優(yōu)選為1.0mg/L；所述體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.08-0.12mg/L，優(yōu)選為0.1mg/L；所述快繁培養(yǎng)基的6-芐氨基嘌呤濃度為2.7-3.3mg/L，優(yōu)選為3.0mg/L，α-萘乙酸濃度為0.8-1.2mg/L，優(yōu)選為1.0mg/L，蔗糖濃度為3.0±0.5％，優(yōu)選為3.0％；所述生根培養(yǎng)基的吲哚丁酸濃度為0.4-0.6mg/L，優(yōu)選為0.5mg/L，α-萘乙酸濃度為0.4-0.6mg/L，優(yōu)選為0.5mg/L，蔗糖濃度為2.0±0.5％，優(yōu)選為2.0％。
本發(fā)明建立了一套成熟的通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)的耐鹽蘆葦?shù)臒o(wú)性繁殖方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)1)可保持耐鹽蘆葦?shù)目果}特性；2)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織經(jīng)過(guò)30代的繼代培養(yǎng)，仍具有80±4％的分化能力，因而具有工業(yè)化生產(chǎn)的能力；3)轉(zhuǎn)化率高，愈傷組織的誘導(dǎo)頻率可達(dá)36.7±0.3％，體細(xì)胞胚的分化頻率可達(dá)86.7±0.3％；4)成活率高，可達(dá)85-90％，已用本發(fā)明的方法生產(chǎn)了約20,000株耐鹽蘆葦變異系再生植株，證明其具有商業(yè)生產(chǎn)的可行性。本發(fā)明為耐鹽蘆葦?shù)呐嘤峁┝撕?jiǎn)便可靠的新方法，具有重要的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。


圖1為長(zhǎng)出愈傷組織的莖節(jié)外植體圖2為胚性愈傷組織圖3為球形胚圖4為胚性愈傷組織表面產(chǎn)生的大量體細(xì)胞胚萌發(fā)成幼苗圖5為具有發(fā)達(dá)根系健壯的再生植株圖6為移栽于土壤中的再生植株具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、耐鹽蘆葦?shù)臒o(wú)性繁殖實(shí)驗(yàn)材料耐鹽蘆葦變異系R5002-12(陳可詠、葉和春、陳建林、顧立民、李國(guó)鳳.蘆葦耐鹽變異植株及其細(xì)胞學(xué)鑒定.植物學(xué)報(bào).36(12)930-933，1994.)。切取帶有芽原基的莖段(0.9-1.1cm)作為本實(shí)施例所用的外植體，并對(duì)其進(jìn)行消毒滅菌先用70％酒精浸泡30±2秒，再用10％的次氯酸鈉溶液處理15±2分鐘，最后用無(wú)菌水洗滌3-5次。
培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基可參照文獻(xiàn)(Murashige，T.；Skoog，F(xiàn).A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol.Plant 15473-497，1962.)配制。
愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加2.0mg/L 2，4-D，200mg/L肌醇和4.0±0.5％蔗糖的MS基本培養(yǎng)基。
胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加1.0mg/L 2，4-D，200mg/L肌醇和4.0±0.5％蔗糖的MS基本培養(yǎng)基。
體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基添加1.0mg/L 2，4-D的MS半固體基本培養(yǎng)基。
快繁培養(yǎng)基添加3.0mg/L BAP，1.0mg/L NAA和3.0±0.5％蔗糖的MS基本培養(yǎng)基。
生根培養(yǎng)基添加0.5mg/L IBA，0.5mg/L NAA和2±0.5％蔗糖的1/2MS液體基本培養(yǎng)基。
一、愈傷組織及胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代1、愈傷組織的誘導(dǎo)(不同濃度的2，4-D對(duì)愈傷組織形成的影響)將上述經(jīng)消毒的耐鹽蘆葦莖段接種于添加了(0.0，1.0，2.0，4.0mg/L)不同濃度2，4-D，200mg/L肌醇和4.0±0.5％蔗糖的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，在25±2℃下，暗培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)情況。結(jié)果表明莖段在添加了2.0mg/L 2，4-D，200mg/L肌醇和4.0±0.5％蔗糖的MS培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)的頻率最高，可達(dá)到36.7±0.3％，因此將其定為本實(shí)施例所用的優(yōu)選的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，利用該培養(yǎng)基，在25±2℃下，暗培養(yǎng)4周，獲得愈傷組織，長(zhǎng)出愈傷組織的外植體如圖1所示；2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)(不同濃度的2，4-D對(duì)胚性愈傷組織形成的影響)將耐鹽蘆葦?shù)挠鷤M織接種于添加了(0.0，1.0，2.0，4.0mg/L)不同濃度2，4-D的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，在25±2℃下，暗培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)情況。結(jié)果表明愈傷組織在添加了1.0mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，因此將其定為本實(shí)施例所用的優(yōu)選的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，利用該培養(yǎng)基，在25±2℃下，暗培養(yǎng)4周，進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代，產(chǎn)生的胚性愈傷組織如圖2所示。
二、體細(xì)胞胚的分化與快速繁殖1、體細(xì)胞胚分化條件的確定將步驟一誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至添加了(0.0，0.01，0.1，0.5，1.0mg/L)不同濃度2，4-D的MS半固體基本培養(yǎng)基上，在25±2℃、光照條件下，連續(xù)培養(yǎng)4周，觀察統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚的分化率(以見(jiàn)到綠色的體細(xì)胞胚為分化標(biāo)準(zhǔn))。結(jié)果表明胚性愈傷組織在含有較低濃度2，4-D的MS培養(yǎng)基中，有大量體細(xì)胞胚發(fā)生分化，其中胚性愈傷組織在添加了1.0mg/L 2，4-D的MS半固體培養(yǎng)基上體細(xì)胞胚的分化頻率最高，可達(dá)86.7±0.3％，因此將其定為本實(shí)施例所用的優(yōu)選的體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基。
2、體細(xì)胞胚的分化與快速繁殖1)將步驟一誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基上，在25±2℃、光照條件下進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化培養(yǎng)，每次繼代時(shí)小心除去非胚性愈傷組織和壞死組織，僅把依附在胚性愈傷組織表面未成熟的亮綠色的體細(xì)胞胚(圖3)轉(zhuǎn)入新鮮的分化培養(yǎng)基中使其萌發(fā)，6周后體細(xì)胞胚發(fā)育成健壯的幼苗(圖4)；2)把長(zhǎng)度為1.0±0.2cm的幼苗轉(zhuǎn)入快繁培養(yǎng)基上進(jìn)行苗的快速繁殖，在25±2℃、光照條件下，培養(yǎng)4周。
三、根的發(fā)生與移栽1)將由體細(xì)胞胚分化的無(wú)根、少根的幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上，在25±2℃、光照條件下誘導(dǎo)生根，4周后可長(zhǎng)出健壯的根系(圖5)；2)將其成簇(3-5株帶有分枝的再生植株)移栽至盛有經(jīng)高溫滅菌處理過(guò)的土壤和蛭石(混合比例為1∶1)的盆中煉苗(圖6)。先將花盆套上一層塑料薄膜以使再生植株處于一個(gè)相對(duì)較高的濕度環(huán)境中，適應(yīng)幾天后轉(zhuǎn)至溫室中，統(tǒng)計(jì)成活率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明單棵植株的移栽成活率較低，只有按上述方法成簇移栽，成活率才可達(dá)到85-90％，此外，氣候?qū)Τ苫盥室灿休^大影響，移栽的最佳時(shí)間為雨季7-9月間，尤其是高溫、多云的天氣適合再生植株的移栽，成活率可達(dá)85-95％，而冬季(10-12月)移栽的成活率僅為25-30％。在雨季氣候條件下移栽的耐鹽蘆葦生長(zhǎng)迅速，移栽至土壤中2-3個(gè)月，即可生長(zhǎng)40-60cm，同時(shí)長(zhǎng)出側(cè)枝。
權(quán)利要求
1.一種耐鹽蘆葦?shù)臒o(wú)性繁殖方法，包括以下步驟1)以帶有芽原基的莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧乙酸，肌醇和蔗糖；2)將愈傷組織置于胚性愈傷組織培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織；胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；3)將胚性愈傷組織置于體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基上進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化；體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；4)將分化出苗的體細(xì)胞胚置于快繁培養(yǎng)基上進(jìn)行苗的快速繁殖；快繁培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐氨基嘌呤，α-萘乙酸和蔗糖；5)將苗置于生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了吲哚丁酸，α-萘乙酸和蔗糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)性繁殖方法，其特征在于所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.18-2.2mg/L，肌醇濃度為180-220mg/L，蔗糖濃度為4.0±0.5％；所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.8-1.2mg/L；所述體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.08-0.12mg/L；所述快繁培養(yǎng)基的6-芐氨基嘌呤濃度為2.7-3.3mg/L，α-萘乙酸濃度為0.8-1.2mg/L，蔗糖濃度為3.0±0.5％；所述生根培養(yǎng)基的吲哚丁酸濃度為0.4-0.6mg/L，α-萘乙酸濃度為0.4-0.6mg/L，蔗糖濃度為2.0±0.5％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無(wú)性繁殖方法，其特征在于所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為2.0mg/L，肌醇濃度為200mg/L，蔗糖濃度為4.0％；所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為1.0mg/L；所述體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.1mg/L；所述快繁培養(yǎng)基的6-芐氨基嘌呤濃度為3.0mg/L，α-萘乙酸濃度為1.0mg/L，蔗糖濃度為3.0％；所述生根培養(yǎng)基的吲哚丁酸濃度為0.5mg/L，α-萘乙酸濃度為0.5mg/L，蔗糖濃度為2.0％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的無(wú)性繁殖方法，其特征在于所述愈傷組織和胚性愈傷組織誘導(dǎo)條件為在25±2℃下，暗培養(yǎng)26-30天；體細(xì)胞胚的分化條件為在25±2℃下，培養(yǎng)40-44天；快速繁殖條件為在25±2℃下，培養(yǎng)26-30天；生根條件為在25±2℃下，培養(yǎng)26-30天。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無(wú)性繁殖方法，其特征在于所述愈傷組織和胚性愈傷組織誘導(dǎo)條件為在25±2℃下，暗培養(yǎng)28天；體細(xì)胞胚的分化條件為在25±2℃下，培養(yǎng)42天；快速繁殖條件為在25±2℃下，培養(yǎng)28天；生根條件為在25±2℃下，培養(yǎng)28天。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種耐鹽蘆葦?shù)臒o(wú)性繁殖方法。所述無(wú)性繁殖方法，包括以下步驟1)以帶有芽原基的莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織；2)將愈傷組織置于胚性愈傷組織培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織；3)將胚性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化；4)將分化出苗的體細(xì)胞胚置于快繁培養(yǎng)基上進(jìn)行苗的快速繁殖；5)將苗置于生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1)可保持耐鹽蘆葦?shù)目果}特性；2)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織經(jīng)過(guò)30代的繼代培養(yǎng)，仍具有80±4％的分化能力，因而具有工業(yè)化生產(chǎn)的能力；3)轉(zhuǎn)化率高；4)成活率高，可達(dá)85－90％。本發(fā)明為耐鹽蘆葦?shù)呐嘤峁┝撕?jiǎn)便可靠的新方法，具有重要的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01G7/00GK1788547SQ20041009849
公開(kāi)日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2004年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月13日
發(fā)明者楊映根, 江波, 郭仲琛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所