專利名稱:通過(guò)器官發(fā)生和體細(xì)胞克隆變異使大豆屬物種進(jìn)行整株植物的再生的制作方法
本發(fā)明涉及從大豆和其他大豆屬(Glycine或G.)物種的體外組織培養(yǎng)物再生成整株植物的器官發(fā)生方法，以及在所說(shuō)物種中誘發(fā)體細(xì)胞克隆變異。
探求從組織培養(yǎng)物中獲得大豆及其親屬再生的方法歷來(lái)已久。大豆與煙草和矮牽牛這類容易再生的物種不同，以往對(duì)于將其從組織培養(yǎng)物再生成整株植物的大量嘗試均未成功。組織培養(yǎng)物是十分理想的，它可以使所需的性狀經(jīng)由體細(xì)胞克隆變異引入大豆或能以此結(jié)籽的物種(如G.Soja)內(nèi)。它們對(duì)遺傳工程師也將有所稗益，可使細(xì)胞經(jīng)土壤桿菌感染或采用其他手段而使之在培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)化，由此產(chǎn)生含有外來(lái)DNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后該轉(zhuǎn)化細(xì)胞被再生成能結(jié)籽和表達(dá)外來(lái)基因的整株植物。
文獻(xiàn)“D.A.Evans，et al(eds.)(1983)in Handbook of Plant Cell Culture，vol.l，at pp.178-179，”中討論了通常用于植物體外繁殖體增殖的三種可能途徑(a)增強(qiáng)腋芽釋放;(b)通過(guò)器官發(fā)生而產(chǎn)生不定枝;和(3)體細(xì)胞胚的發(fā)生。
從分生組織、嫩芽端或萌芽的培養(yǎng)物中進(jìn)行腋芽再育而作為一種再生手段，它涉及使用業(yè)已在體內(nèi)分化的初發(fā)枝。因此為得到整株植物，僅需使其伸長(zhǎng)和進(jìn)行根的分化。另一方面，體外器官發(fā)生和胚發(fā)生涉及發(fā)育變化通常形成愈傷組織，其后再組合形成小植株。這對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)均不易達(dá)到。埃文斯等人(上述文獻(xiàn)178頁(yè))討論了以往對(duì)大豆所用的器官發(fā)生法的失敗原因，指出“液芽再育的誘發(fā)似乎在許多情況下均可適用，例如香石竹和大豆，而器官發(fā)生法和胚發(fā)生法對(duì)此均告失敗”。
在178至179頁(yè)中，他們繼續(xù)陳述“雖然借助于器官發(fā)生和胚發(fā)生，小植株的增殖速率是驚人的，但經(jīng)若干次傳代培養(yǎng)后，它們的再生能力往往迅速降低，以至最終其形態(tài)適應(yīng)能力完全喪失。另一方面，腋芽再育的初始增殖速率相當(dāng)慢。然而，在最初的一些傳代培養(yǎng)期間，增殖速率增加，并最終將在其后的傳代培養(yǎng)循環(huán)期間達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)?！币虼?，這些作者推薦不同于器官發(fā)生和胚發(fā)生的腋芽再育法來(lái)用于大批生產(chǎn)。
“M.S.Wright，et al.，(1986)in“Plant Regeneration by organogenesis in Glycine max”，Plant Cell Reports，5150-154”中描述了芽再育的方法。該法包括使Glycine max(L.)種子在含有無(wú)機(jī)鹽(其濃度為推薦值的一半)和5μMBA(芐基腺嘌呤，也稱作BAP，即芐氨基瞟呤，CAS注冊(cè)號(hào)為1214-39-7)的MS培養(yǎng)基(Murashige，T.and Skoog，F(xiàn).(1962)Physiol.Plant.15473)上進(jìn)行發(fā)芽。從發(fā)芽的幼苗上切去子葉節(jié)，并除去不是節(jié)的組織。將上述節(jié)組織的切片在發(fā)芽培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，然后移入相同的培養(yǎng)基中，但該培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度僅為推薦值的1/4，而BA濃度仍為5μM。接著將節(jié)切細(xì)并移入另外的培養(yǎng)基中，最后移入包含土壤的培養(yǎng)基中，以使整株植物成熟。這一方法可看作是分生組織繁殖法，未經(jīng)過(guò)反分化細(xì)胞的階段。上述文獻(xiàn)指示，大豆子葉節(jié)的特定表面區(qū)能被誘發(fā)而成為分生組織和出枝，并且在培養(yǎng)期間自始至終存在BA可使前期再生組織的枝形態(tài)的發(fā)生得以維持。
有關(guān)從組織培養(yǎng)物中再生含有G.max(大豆)和G.soja的大豆亞屬Soja的方法，研究成功者廖廖無(wú)幾，不過(guò)在諸如G.canescens和G.clandestina之類的野生型親屬中已取得很大成功。[D.F.Hildebrand，et al.，(1986)，in a review article，“Soybean[Glycine max(L.)Merr.]，”Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol.2Crops I(Y.P.S.Bajaj，ed.)283-308，(Table 4)]中概述了近年來(lái)有關(guān)大豆屬體外再生的工作，并在293頁(yè)上引用了以下討論的題為“分生組織培養(yǎng)”的參改文獻(xiàn)。
“K.K.Kartha，et al.(1981)“Plant Regenerat-ion from meristems of grain legumessoybean，cowpea，peanut，chickpea and bean，”Can.J.Bot 591671-1679”中描述了在含有1μM NAA和0.05-0.1μM BA的培養(yǎng)基上，從大豆枝頂端分生組織中進(jìn)行植物的再生。再生得到整株植物。在較高的BA濃度下形成愈傷組織，但未獲得整株植物的再生。
“T.Kameya，et al.(1981)，“Plant Regeneration from Hypocotyl Sections of Glycine Species，”Plant Sci.Lett.21289-294”揭示了使用G.Canescens和G.tomentella幼苗的胚軸切片在加有不同濃度NAA和BA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以再生成正常植物。在包括G.max和G.soja在內(nèi)的8個(gè)試驗(yàn)物種中，僅觀察到G.canescens的胚軸切片有較高的嫩芽再生頻率，所用BA濃度為1-5mg/l(5-25μM)。
“T.Y.Cheng，et al.(1980)，“Plant Regenerat-ion from Soybean Cotyledcnary Node Segments in Culture，”Plant Sci.Lett.1991-99報(bào)道了用幼苗的調(diào)整子葉節(jié)片刺激培養(yǎng)物中大豆復(fù)枝芽的生成。所用的培養(yǎng)基含有0.25μM植物生長(zhǎng)素IBA(吲哚丁酸)和5-50μM BAP。該法并不涉及愈傷組織的生成，而是使用分離塊。若BAP濃度大于10μM，則會(huì)抑制主枝和根的生長(zhǎng)，以及抑制子葉節(jié)區(qū)枝芽的生成。上述文獻(xiàn)并未明確報(bào)道是否能再生得到可獨(dú)立地在土壤中生長(zhǎng)的整株植物。
“H.Saka，et al.(1980)，“Stimulation of Multiple Shoot Formation of Soybean Stem Nodes in Culture，”Plant Sci.Lett.19193-201”同樣描述了用含有植物生長(zhǎng)素IBA和5-50μM BAP的培養(yǎng)基，在G.max的莖節(jié)或頂端生成枝芽。文內(nèi)還報(bào)道了愈傷組織的形成，它影響枝芽的生成。但上述文獻(xiàn)既未報(bào)道在愈傷組織中出現(xiàn)新的分生組織，也未報(bào)道整株植物的再生。
上述參考文獻(xiàn)無(wú)一對(duì)能產(chǎn)生新分生組織中心的組織培養(yǎng)物可被維持的器官發(fā)生的再生方法進(jìn)行描述。
除了在希爾達(dá)布雷恩(Hildebrand)等人的綜述性文章中所引用的上述參考文獻(xiàn)外，下述參考文獻(xiàn)對(duì)目前技術(shù)發(fā)展水平作了闡述。
“J.M.Widholm，et al.(1983)，“Shoot Regener-ation from Glycine canescens Tissue Cultures，”Plant Cell Reports 2;19-20”報(bào)道了利用一些培養(yǎng)基，其中包括含有NAA和5mg/l(25μM)BAP的培養(yǎng)基，而使G.canescens子葉和胚根的愈傷組織誘發(fā)出芽。但未再生成整株植物，根的形成極少。
“W.D.Beversdorf，et al.，in”Degrees of Differentiation Obtained in Tissue Cultures of Glycine Species，”(1977)Crop Sci.17307-311”中報(bào)道了已獲得稱為“生長(zhǎng)中心”的類似分生組織細(xì)胞的密集小結(jié)節(jié)。
貝費(fèi)斯道夫(Beversdorf)等人用含有2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)和/或NAA(α-萘乙酸)，及0.5mg/l激動(dòng)素(6-呋喃基氨基嘌呤)的誘發(fā)培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)G.max及G.soja的胚軸切片，獲得了“生長(zhǎng)中心”，但并未進(jìn)一步發(fā)育成小植株。
“C.A.Newell，et al.(1985)“Protoplast culture and plant regeneration in Glycine canescens，”Plant Cell Tissue Organ Culture 4145-149”中描述了幼苗胚軸組織中取出的原生質(zhì)體再生成為整株G.canescens植物。在所報(bào)道的一些實(shí)驗(yàn)中，嫩芽誘發(fā)培養(yǎng)基含有0.4mg/l(2μM)BA和0.1或1.0mg/l的NAA。
以上參考文獻(xiàn)均未描述在含有高濃度BAP或其他細(xì)胞激動(dòng)素的培養(yǎng)基中對(duì)包括G.max胚在內(nèi)的未成熟胚進(jìn)行培養(yǎng)，而獲得整株植物的器官發(fā)生的再生。
本文發(fā)明人的最近工作如下由厄錫B.巴威爾(Usha B.Barwale)的題為“篩選大豆栽培品種的植物再生能力，并從未分化組織再生大豆植物”的碩士論文已于1986年3月16日列入伊利諾斯大學(xué)圖書館的圖書目錄中。這篇論文確定了用于本發(fā)明的器官發(fā)生培養(yǎng)基和在培養(yǎng)基中植物的發(fā)育。
“U.B.Barwale，et al.(1986)in“Screening of Glycine max and Glycine Soja Genotypes for Multiple Shoot Formation at the Cotyledonary Node，”Theor.Appl.Genet.72423-428”中描述了在含有1或5μM BAP的B5培養(yǎng)基中178基因型種子的發(fā)芽現(xiàn)象，并計(jì)算出子葉節(jié)上所生成的枝的數(shù)目。
“H.R.Kerns，et al，(1986)，“Correlation of Cotyledonary node shoot proliferation and Somatic embryoid development in suspension cultures of soybean(Glycine max L.Merr.)”，Plant Cell Reports 5140-143”中揭示了用不含有細(xì)胞激動(dòng)素的懸浮培養(yǎng)基、在胚軸中所取出的組織，以及從發(fā)芽種子的子葉組織上誘發(fā)胚的現(xiàn)象。胚的生成似乎與前面研究中的子葉節(jié)上所生成的嫩芽數(shù)相對(duì)應(yīng)。但文獻(xiàn)中并未對(duì)胚是能否再生成整株植物進(jìn)行報(bào)道。
“U.B.Barwale，et al.(1986)，“Plant regenerat-ion from callus cultures of several soybean genotypes viaembryogenesis and organogenesis，”Planta 167473-481”報(bào)道了作為本專利申請(qǐng)依據(jù)的大量工作。
最近共同轉(zhuǎn)讓的有關(guān)不同的大豆屬再生方法的專利申請(qǐng)?jiān)?986年8月4日向美國(guó)專利局提出申請(qǐng)，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?93，256(申請(qǐng)人為Glem B.Collins等人)。該申請(qǐng)描述了通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生而再生G.max和其他大豆屬物種的方法，方法中涉及到未成熟胚上切下的子葉組織進(jìn)行培養(yǎng)。此申請(qǐng)對(duì)于在含有高濃度細(xì)胞激動(dòng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)整個(gè)胚，以獲得器官發(fā)生的再生并未予以揭示，也未請(qǐng)求取得保護(hù)。
本發(fā)明提供了一種高效的大豆屬物種(包括Glycine max，即大豆)的器官發(fā)生的再生方法，該法系通過(guò)充分地反分化培養(yǎng)，并經(jīng)體細(xì)胞克隆變異，而發(fā)育成具有所需性狀的植物。這一方法對(duì)所試驗(yàn)的全部大豆基因型均為有效。大豆是已知的最難再生的大豆屬物種。本發(fā)明的器官發(fā)生法也適用于轉(zhuǎn)化和細(xì)胞選擇，以得到所需性狀;以及懸浮培養(yǎng)和原生質(zhì)體的產(chǎn)生。該法較之以前的體細(xì)胞胚發(fā)生的再生方法明顯地有效得多。
本發(fā)明涉及在器官發(fā)生培養(yǎng)基上培養(yǎng)未成熟的胚，以形成器官組織培養(yǎng)物。所說(shuō)培養(yǎng)基中含有細(xì)胞激動(dòng)素，其中以BAP為佳，而細(xì)胞激動(dòng)素的濃度應(yīng)足夠高，以防止胚發(fā)芽，并促使器官發(fā)生嫩芽的產(chǎn)生，為此，濃度至少宜為10μM左右，尤以約13μM-14μM范圍內(nèi)的濃度最佳，且最好不大于約15μM。
器官發(fā)生培養(yǎng)基可以是該技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何發(fā)芽培養(yǎng)基，但最好是MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中必須含有微量營(yíng)養(yǎng)物，其濃度應(yīng)足以能促使器官發(fā)生枝的產(chǎn)生，而不是使胚發(fā)芽，最好至少是正常濃度的三倍左右，尤以正常濃度的4至6倍左右為更佳。
未成熟胚的大小約為1.5mm至10mm長(zhǎng)，而用于放入培養(yǎng)基中的最好約為4至6mm長(zhǎng)。
培養(yǎng)物被定期轉(zhuǎn)移到新配制的培養(yǎng)基中，最好約每隔2至3周轉(zhuǎn)移一次，并可使之連續(xù)生長(zhǎng)，以產(chǎn)生體細(xì)胞克隆變異。
體細(xì)胞克隆變異可以自發(fā)地產(chǎn)生，也可通過(guò)在培養(yǎng)物上施加選擇性壓力而產(chǎn)生。本文所述的器官發(fā)生培養(yǎng)物可用來(lái)誘發(fā)體細(xì)胞克隆變異;或者也可使用該技術(shù)領(lǐng)域：
公知的，或文獻(xiàn)中(例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?93，256，或上文提到的“U.B.Barwale，et al.(1986)，Planta”所述的胚發(fā)生培養(yǎng)物。由體細(xì)胞克隆變異而產(chǎn)生的有效突變體系指提供具有下述性狀之表型的突變體，這些性狀是雄性不育、雙生種子、氨基酸的過(guò)度產(chǎn)生、抗病性、耐除草劑、耐逆境條件(例如耐熱和耐冷)、能耐受不利的土壤條件(如有毒金屬的存在)、以及成熟變異(如早熟)。
在組織培養(yǎng)階段、再生體(Ro)階段、Ro代的子代階段(R1)或由自交或回交親本和祖親本植物所產(chǎn)生的其后子代階段均可觀察到變異體表型。最好能在二個(gè)或二個(gè)以上子代中觀察到變異體，以確保穩(wěn)定遺傳率。
為了從愈傷組織培養(yǎng)物再生整株植物，將培養(yǎng)物上再育的芽切碎后，放在該領(lǐng)域中公知的再生培養(yǎng)基上，并使之在光照下(最好是一個(gè)16小時(shí)的光周期)生長(zhǎng)至適合移入生根培養(yǎng)基中的高度(最好約為1cm)。在無(wú)激素的生根培養(yǎng)基(最好是MS培養(yǎng)基)上生長(zhǎng)后，可將植物移入具有土壤的培養(yǎng)基中，使之成熟。
在移入具有土壤的培養(yǎng)基中之前，最好先將植物移入液體培養(yǎng)基中，而該液體培養(yǎng)基宜包括含有特定微量營(yíng)養(yǎng)物的，而濃度約為1/4的Hoagland溶液。通過(guò)使用這種液體培養(yǎng)基，植物的生長(zhǎng)發(fā)育力和結(jié)籽能力大為提高。
俟植物長(zhǎng)至適當(dāng)高度，最好約為3英寸時(shí)，將其移入帶有土壤的培養(yǎng)基中，并宜用含有鎳離子的溶液施肥。
可對(duì)用上述方法從器官發(fā)生的愈傷組織中再生的植物進(jìn)行選擇，以選出變異體或非變異體的表型。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“器官發(fā)生”和“器官發(fā)生培養(yǎng)物”系指在體外從愈傷細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生芽。器官發(fā)生培養(yǎng)物并不像胚發(fā)生培養(yǎng)物那樣在形成嫩芽前產(chǎn)生體細(xì)胞胚，它亦不像腋芽再育或克隆其他類型植物組織的方法那樣涉及在體內(nèi)所形成的組織之繁殖。
大豆屬物種系指包括G.max G.soja，的大豆屬物種，以及諸如G.argyrea，G.canescens，G.clandestina，G.crytoloba，G.falcata，G.latifolia，G.latrobeana，G.tabacina和G.tomentella之類的野生型物種。
體細(xì)胞克隆變異是一種利用在實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)物中植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自發(fā)遺傳變化，以產(chǎn)生所需表型的技術(shù)。在文獻(xiàn)“J.A.Miller(1985)“Somaclonal Variation，”Science News 128120-121”(此處引用，以供參考)中對(duì)體細(xì)胞克隆變異進(jìn)行了有益的討論。
將大豆屬物種的未成熟胚(最好是亞屬soja，尤以Glycine max為更佳)進(jìn)行培養(yǎng)，使之通過(guò)器官發(fā)生而再生成整株植物。未成熟胚的大小范圍約從1.5mm至10mm，最好約從4mm至6mm。所說(shuō)胚必須包括胚軸。業(yè)已證明，若將軸切除，則不會(huì)發(fā)生令人滿意的器官發(fā)生。
將未成熟胚置于培養(yǎng)基上，進(jìn)行平板培養(yǎng)。包括B5，L2和MS培養(yǎng)基(T.Murashige，et al.(1962)，文獻(xiàn)名稱同上)在內(nèi)的一些合適培養(yǎng)基為該技術(shù)領(lǐng)域：
的人們所公知。這些培養(yǎng)基中以MS培養(yǎng)基為佳。重要的是，培養(yǎng)基應(yīng)含有高濃度的細(xì)胞激動(dòng)素。一些細(xì)胞激動(dòng)素已為該技術(shù)領(lǐng)域：
公知，這包括BAP(6-芐氨基嘌呤;也稱作BA，即芐基腺嘌呤)、ADE(腺嘌呤硫酸鹽)、玉米素、激動(dòng)素和2-ip(2-異戊烷基腺嘌呤)。上述細(xì)胞激動(dòng)素中以BAP較佳。而細(xì)胞激動(dòng)素的濃度應(yīng)足以防止胚發(fā)芽，最好不小于約10μM，尤以約13μM至14μM之間為更佳。并且其濃度不應(yīng)太高，以防將胚殺死，最好不高于約15μM。
培養(yǎng)基內(nèi)最好還含有植物生長(zhǎng)素?？梢允褂迷?b>技術(shù)領(lǐng)域：
公知的植物生長(zhǎng)素，例如NAA(α-萘乙酸)，IAA(吲哚-3-乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)(以上植物生長(zhǎng)素均與NAA類同);或2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)、毒莠定(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸)pCPA(對(duì)氯苯氧基乙酸)、2，4，5-T(2，4，5-三氯苯氧基乙酸)和麥草畏(2-甲氧基，3，6-二氯-鄰-茴香酸)(后面提到植物生長(zhǎng)素均與2，4-D類同)。最好使用類似于NAA的植物生長(zhǎng)素，尤以NAA為最佳。植物生長(zhǎng)素的濃度應(yīng)足以刺激生長(zhǎng)，而當(dāng)其為NAA時(shí)，則它的濃度最好應(yīng)在約0.1μM和0.4μM之間，其中尤以0.2μM為最佳。
器官發(fā)生培養(yǎng)基的其他組分可以包括;(a)硫胺系，其用量最好約在0.5μM至5.9μM之間，尤以5.0μM為更佳;(b)脯氨酸，其濃度最好約在6mM至24mM之間，尤以12mM為更佳。這些組分對(duì)于包括A3127和Williams 82在內(nèi)的大多數(shù)基因型來(lái)說(shuō)并不是必不可少的，但可促進(jìn)某些基因型生長(zhǎng)。
此外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)若將MS微量組分的濃度增加到至少約為正常濃度的3倍，而且最好增加到正常濃度的4至6倍左右。則可提高器官發(fā)生能力。所說(shuō)微量組分是H3BO3、MnSO4、ZnSO4、KI、Na2MoO4、CuSO4和CoCl2。在較低的微量組分濃度時(shí)，亦即約為正常濃度的2倍或更低時(shí)，則發(fā)生胚發(fā)芽，而不是形成器官發(fā)生愈傷組織。微量組分的較佳形式和濃度示于表1b。
最初是將器官發(fā)生培養(yǎng)物在暗處和室溫下培育約4周，直至生成適合轉(zhuǎn)移大小的嫩芽。然后將嫩芽移入該領(lǐng)域內(nèi)公知的再生培養(yǎng)基中，最好是表1a所示的MSR培養(yǎng)基或R5培養(yǎng)基。正如該技術(shù)領(lǐng)域：
的人們所知，存在許多適合芽再育的培養(yǎng)基，但對(duì)細(xì)胞激動(dòng)素的濃度應(yīng)予以考慮，使不致生成脆性的非器官發(fā)生的愈傷組織。當(dāng)所用的細(xì)胞激動(dòng)素是BAP時(shí)，再生培養(yǎng)基的濃度應(yīng)小于約10μM。培養(yǎng)物應(yīng)處于光照下在再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，最好在約為80μM質(zhì)子/平方米·秒的冷白熒火燈下培育16小時(shí)左右，溫度在白天約為室溫(約25℃-28℃)，而在夜里降低溫度，最好約為18℃。
再生培養(yǎng)基不需要如同用于器官發(fā)生培養(yǎng)基那樣的高濃度微量組分或微量營(yíng)養(yǎng)物，最好采用表1a中MSR培養(yǎng)基或R5培養(yǎng)基的配方。
最好每隔2或3周將器官發(fā)生培養(yǎng)物從再生培養(yǎng)基移入新配制的再生培養(yǎng)基中，直至它們達(dá)到1cm左右的高度。此刻即將它們移入該技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的生根培養(yǎng)基中。而生根培養(yǎng)基最好是無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基。
為盡量減少對(duì)植物造成的逆境壓力，生根后可將植物移入溶液培養(yǎng)基，而該培養(yǎng)基中最好含有約為1/4濃度的Hoaqland溶液(Hoagland，D.R.，et al.(1950)“The Waterculture method for growing plants without soil，”California Agric Exp.Sta.Bull.No.347)最好在Hoagland溶液中添加含有KCl，H3BO3，MnSO4，ZnSO4，CuSO4和(NH4)6Mo7O24的微量營(yíng)養(yǎng)物溶液，以改善其性能，而且宜采用實(shí)施例1(見表2)中所示的形式和濃度。溶液培養(yǎng)基最好還含有鐵鹽，特別以Fe330(Sequestrine 330 Fe.Ciba-Geigy)，為佳，而且pH宜為6.5左右。若略去溶液培養(yǎng)生長(zhǎng)階段，則再生后每株植物結(jié)籽的數(shù)量很少超過(guò)5個(gè)，而使用溶液培養(yǎng)基，則每株植物一般至少可結(jié)10顆以上的籽，最多可達(dá)100顆籽。而且經(jīng)溶液培養(yǎng)生長(zhǎng)階段后，在土壤中的存活率也得以提高，約達(dá)80%，而不經(jīng)過(guò)這一步的話，其存活率約為20%。植物需維持在溶液培養(yǎng)基中，直至它們生長(zhǎng)到足夠大，以致可以在不會(huì)發(fā)生損傷的情況下移入土壤，最好直至它們長(zhǎng)到3英寸左右的高度，一般約在7至15天后。
液體培養(yǎng)生長(zhǎng)后，將植物移栽到帶有土壤的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基最好是具有下述配比的混合物∶泥炭蘚∶蛭石∶土壤＝1∶1∶1。最好用含有鎳離子的肥料溶液施在正在土壤中生長(zhǎng)的植物上。較佳的肥料溶液如例1所述(見表3)。
器官發(fā)生組織培養(yǎng)物可被連續(xù)維持，每隔2至3周將其移入新配制的培養(yǎng)基中，由于每一愈傷組織可再被切成約4至6塊，因而每次轉(zhuǎn)移后可再生約10至40株植物。愈傷組織連續(xù)地形成分生組織部位，并長(zhǎng)出芽。從這種愈傷組織物質(zhì)(參見實(shí)施例2)再生得到的植物的突變程度是愈傷組織中高度反分化程度的征兆，事實(shí)上在不同的植物中均觀察到分生組織中心。
從器官發(fā)生培養(yǎng)物再生所得值物中出現(xiàn)的較高變異體表型的發(fā)生率使其適用于誘發(fā)體細(xì)胞克隆變異。為了用器官發(fā)生培養(yǎng)物質(zhì)誘發(fā)體細(xì)胞克隆變異，可向愈傷組織培養(yǎng)物選擇性地施加壓力。例如可以用完全中毒量或亞致死量的諸如鎮(zhèn)草寧、百草枯和阿特拉津之類的除草劑施加到培養(yǎng)物中，以誘發(fā)一種能產(chǎn)生具有抗性的植物的抗性愈傷組織。通過(guò)增加超氧化岐化酶(它的存在可提供對(duì)疾病的抵抗力)之類的酶含量而產(chǎn)生對(duì)百草枯耐受性的突變是極其重要的。能耐受阿特拉津的能力對(duì)于減少除草劑所帶來(lái)的損害是十分重要的，特別對(duì)于直接將這種化合物用于作物上是不可設(shè)想之處更是如此。
還可進(jìn)行熱(例如約40℃)和冷(例如約4℃)處理，以得到耐熱和耐冷的愈傷組織，處理時(shí)間的長(zhǎng)短不一，最好在植物再生前再進(jìn)行試驗(yàn)。
業(yè)已知道在許多緊張條件下脯氨酸的含量會(huì)積聚起來(lái)，而脯氨酸已被證明能提高對(duì)某些逆境的耐受性。因此，例如通過(guò)選擇對(duì)諸如羥基脯氨酸或氮雜-2-環(huán)丁烷羧酸鹽之類的毒性脯氨酸類似物的耐受性，則可選出脯氨酸含量增高的突變。
也可以進(jìn)行氨基酸選擇，以提高種子中氨基酸含量，例如用乙硫氨酸之類的毒性甲硫氨酸類似物選擇，可提高種子中甲硫氨酸的含量;而用5-甲基色氨酸之類的毒性類似物近行選擇，而提高種子中色氨酸的含量。也可用毒性苯基丙氨酸類似物進(jìn)行選擇，以引起與抗蟲害和疾病有關(guān)的多酚類的過(guò)度產(chǎn)生。
其他有用的選擇包括耐毒性土壤條件的選擇，如鎘、銅、鋅和鉛之類毒性重金屬的存在，以及氯化鈉的存在或低pH值。
也可進(jìn)行抗病性(例如褐莖腐病)的選擇，以產(chǎn)生抗性株系，并最好用病原體培養(yǎng)物的濾液進(jìn)行。
可由體細(xì)胞克隆變異誘發(fā)的其他有用性狀包括雄性不育和早熟之類的發(fā)育性狀。
另一方面，正如本文所述，在并未施加特別選擇性壓力的情況下出現(xiàn)許多突變。這些突變包括諸如雄性不育、早熟和雙生種子之類所需性狀。突變誘發(fā)后，應(yīng)確定誘發(fā)表型的穩(wěn)定性。再生植物(Ro代)自交形成R1代。然后這一代自交形成R2代，后者可自交形成R3代。Ro植物不顯示任何所需性狀，其原因是它們大部分是雜合的，所觀察到性狀多半是穩(wěn)性性狀。在R1代觀察到的所需性狀繼續(xù)在R2代出現(xiàn)，最好仍然在R3代上出現(xiàn)，或R2和R1代回交，并觀察到它們的分離型?？赡苄枰渌淖越?、回交或雜交代，以表明所需性狀穩(wěn)定性的所需程度。進(jìn)行該領(lǐng)域中公知的統(tǒng)計(jì)分析，以確定這種穩(wěn)定遺傳。選出顯示穩(wěn)定遺傳的植物，以進(jìn)一步用于育種計(jì)劃。
以下提供的實(shí)施例系用于說(shuō)明的目的，并非用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)例，實(shí)例1通過(guò)器官發(fā)生方法使大豆再生除另外注明外，大豆種子是從位于Urbana的農(nóng)業(yè)大豆種質(zhì)收集中心美國(guó)分部得到的，并在大田里或暖房里生長(zhǎng)。在這個(gè)研究中用的基因型是依靠在子葉節(jié)上多重芽形成測(cè)定而選擇出來(lái)的[Barwale等(1986)，《Theor.Appl，Genet.》supra]。高芽產(chǎn)物(8個(gè)或更多的芽)Ada PI 30.692 PI 79.739Blackhawk PI 31.122 PI 404.155ACarlin P I36.653 Sooty中芽產(chǎn)物(6～8個(gè)芽)Adams J-88 PI 53.650ACapitol J-103 WayneCentury J-105 WellsEarlyana Mitchell Wisconsin BlackHabaro PI 153.292Henry PI 227.327不經(jīng)多重芽測(cè)定試驗(yàn)的系列白樺籽(Berch)和橡籽(Oak) J-122 SimpsonCN290 LN80-16017 SparksCN210 PI86.063 Williams79
33D Pixie Williams82Harsoy Sherman[所有的J系列是從Jacques種子公司(美國(guó)Wisconsin，prescott)得到的;A3127是從Asgrow種子公司(美國(guó)Michigan Kalamazoo)得到的;白樺籽(Birch)和橡籽(Qak)是從依利諾斯(Illinois)種子基地(美國(guó)Illinois Tolono)得到的，33D是從J.Harper博士(Urbana，Illinois大學(xué))得到的。]大小范圍為0.5～10mm的胚胎從豆莢里切下來(lái)，豆莢已經(jīng)用具有一滴Tween80(聚山梨糖醇酐單油酸乙烯酯《營(yíng)養(yǎng)生物化學(xué)》美國(guó)俄玄俄州(Cleveland)的商用漂白粉制備的0.78%的Na OCl進(jìn)行表面滅菌25～30分鐘，并用足量滅菌過(guò)的去離子蒸餾水沖洗二次，每次至少?zèng)_洗5分鐘。通過(guò)剝?nèi)シN子衣將胚胎移出，種臍鄰近的卵泡被割去，這樣，保證了一個(gè)完整的胚胎。這些胚胎被置于器官發(fā)生(OR)培養(yǎng)基(表1a)，并在暗處，25±2℃培養(yǎng)4星期。當(dāng)使用EB培養(yǎng)基時(shí)，體細(xì)胞的胚胎形成優(yōu)先于出芽。在OR培養(yǎng)基中形成的芽轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基MSR和R5(表1a)，白天在25℃下(光為冷白熒光燈的光，美國(guó)馬塞，F(xiàn)all River，Sylvania;約80μM光子m-2s-1光照16小時(shí))，夜間為18℃。器官發(fā)生的培養(yǎng)物每2或3星期轉(zhuǎn)移一次，并且在MSR和R5培養(yǎng)基上，改變白天和夜間的溫度以維持16小時(shí)的光周期。當(dāng)芽長(zhǎng)到約1cm高后，它們被轉(zhuǎn)移到含有無(wú)激素的MS培養(yǎng)基[Murashige和Skoog(1962)supra]的試管中長(zhǎng)根。植物長(zhǎng)根后通常轉(zhuǎn)移至暖房里，放于1升體積的以鋁箔覆蓋的罐頭中，罐頭中裝有強(qiáng)度為0.25的Hoagland 1號(hào)溶液[Hoagland，D·R.，等(1950)supra]，并連續(xù)通氣。在蓋上開兩個(gè)直徑約1cm的孔，植物在這樣的罐頭中的海綿上生長(zhǎng)，植物的根部浸沒在液體中。
Hoagland溶液通過(guò)在每升Hoagland溶液中加入4ml如表2所述的次要營(yíng)養(yǎng)元素溶液和2ml濃度為9.5g/l的Fe330溶液加以改進(jìn)。所述溶液的pH為6.5。
表1a用于這些實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基組分，都用6g/l的Bact0-瓊脂a固化培養(yǎng)基 組份OR MS主要鹽+4x濃度的次要元素b+維生素B5c+13.3μMBApd+0.2μMNAAd+5.0μM硫胺素+12mM脯氨酸dEB MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+43.0μMNAA+5.0μM硫胺素+0.03μM菸酸eMSR MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1.7μMBAP+0.2μMIBAdR5 MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+9.8μMIBA+5.0nMBAP+5μMGAd3a.美國(guó)米奇，Detroit，Difco實(shí)驗(yàn)室b.MS主要和次要鹽，根據(jù)Murashige和Skoog(1962)，supra中所述的方法制備的。見表1b。
c.維生素B5，根據(jù)Gambog，OL等(1968)的“大豆根細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求”一文的方法的改進(jìn)而制備的，該文刊登于《細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)》第50卷151～158。見表1c。
d.Sigma化學(xué)公司，美國(guó)，MD.Louis街。不是對(duì)所有的基因型都必需的。
e.ICN營(yíng)養(yǎng)生物化學(xué)，美國(guó)俄亥俄州，cleveland。
表1bMS基礎(chǔ)培養(yǎng)基的次要元素原料(每升培養(yǎng)基用40ml的原料)
原液濃度 在MS培養(yǎng)基中(g/l) (g/l)H3BO30.6200 .02MnSO4.H2O 1.5640 .06(or MnSO44H2O) (2.230)ZnSO4.7H2O 0.8600 .03KI 0.0830 .003Na2MoO4.2H2O 0.0250 .001CuSO4.5H2O 0.0025 .0001(or CuSO4) (0.0016)CoCl26H2O 0.0025 .0001表1c∶原液∶維生素B5(每立升培養(yǎng)基中用10ml原液)mg/100ml菸酸 10硫胺素鹽酸鹽 100鹽酸吡哆醇 10肌醇 1克表2次要營(yíng)養(yǎng)素原料-Hoaglandsq/lKCl 3.728H3BO31.546MnSO4.7H2O 0.846ZnSO4.7H2O 0.575CuSO4.5H2O 0.125(NH4)6Mo7O24.4H2O 0.0184
通常，不用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在MS培養(yǎng)基中長(zhǎng)根后，綠色植物被轉(zhuǎn)移至暖房中，當(dāng)這種直接轉(zhuǎn)移至土壤混合物時(shí)，植物存活率是很低的，并且這些植物保持小的個(gè)體。約5顆種子以上，植物方可稀少地產(chǎn)生;但是當(dāng)植物首先在如上所述的Hoagland溶液中生長(zhǎng)，然后再轉(zhuǎn)移至土壤混合物時(shí)，植物的繼續(xù)生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)會(huì)有很大的提高并且個(gè)體接近正常，除了幾種只結(jié)2粒至3粒子的小植物。當(dāng)在肥沃的暖房或大田里生長(zhǎng)，得到的所有綠色植物可產(chǎn)10-100粒子，且從它們的籽實(shí)子(R1)生長(zhǎng)的植物可正常地發(fā)育。
8天后，上述植物被轉(zhuǎn)移至1∶1∶1(泥炭蘚∶蛭石∶土，體積比)的混合物里或大田里。植物用一種特殊肥料溶液施肥，該特殊肥料溶液由7.5g/l Peters20∶10∶20肥料(Peter肥料廠產(chǎn)品，W.R Grace CO.of Fogelsville，賓夕法尼亞州)制成。根據(jù)D.L.Eskew等(1983)“鎳用于豆和可能所有較高等植物的一種基本微量營(yíng)養(yǎng)素”《Science》222621～623，鎳已被發(fā)現(xiàn)是一種用于豆類的基本微量元素。據(jù)此，如表3所示的微量元素原液被制備并加入至肥料溶液中，該肥料溶液也含有1mm Mg SO4和10ppm Fe EDTA。微量營(yíng)養(yǎng)素原液以7.5ml/l的量加入20∶10∶20肥料中。然后，將溶液稀釋為1∶10～1∶20，50～100ml的量被用于以1天1次的頻率施用到每一植物。
組織學(xué)的研究中，器官發(fā)生的愈傷組織通過(guò)浸沒于福馬林∶冰醋酸∶酒精(FAA，2∶1∶10+6份水，體積比)中24小時(shí)而固定。接著用叔丁醇脫水，材料在熱空氣爐55℃下被浸入或植入商用原生質(zhì)(Monoject Scientific，美國(guó)Missouri，Lounis)中。要切片部分被切下(厚度為10μm)，切出的帶狀物放到使用Haupt溶液(Johansen，D.A.(1940)，《植物微技術(shù)》，Mc Graw-Hill出版，紐約，倫敦523)的載玻片上。然后，用二甲苯?jīng)_洗載玻片除去原生質(zhì)，再在溶解于50%酒精中的Safranin0號(hào)12小時(shí)，以及在溶解于95%酒精中的顯色綠(fast green)(sigma化學(xué)公司，美國(guó)密蘇里州，路易斯街)中20～50秒以連續(xù)染色。
表3微量元素肥料6.25μM H3BO338.65mg/l1.0μM Mn5O4.H2O 169.02.0μM Zn5O4.7H2O 5750.5μM Cu5O4.5H2O 1230.5μM (NH4)2MoO4980.01μM CoSO4.H2O 1.780.2μM NiSO4.6H2O 52.6Add 5 ml/l conc.H2SO4用于這種研究的54種大豆基因型包括高芽產(chǎn)物和低芽產(chǎn)物，產(chǎn)物是用多重芽形成測(cè)定法定義的，測(cè)定法則是由使用大豆種質(zhì)(Barwale等，(1986)，《Theor.Appl Genet》supra)的籽苗來(lái)進(jìn)行的。在這個(gè)測(cè)定中，芽是以子葉結(jié)數(shù)計(jì)算的?；蛐偷倪x擇包括各種集合中可見的形式，其中包括種子顏色，花朵顏色，成熟時(shí)間，種子來(lái)源和對(duì)疾病的敏感以及抵抗力。
所有的培養(yǎng)從處于不同發(fā)展階段的，長(zhǎng)度為0.5～10mm的未成熟的胚胎開始。
器官發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)物是從生長(zhǎng)在OR培養(yǎng)基上的未成熟大豆胚胎得到的，OR培養(yǎng)基具有高濃度(13.3μm)的6-苯甲氨嘌呤(BAP)，0.2μMNAA，其濃度是標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基(表5)中的次要元素的4～5倍。臨界因子是BAP濃度，作為低濃度(3.3和6.6μM)，就產(chǎn)生低數(shù)量的器官發(fā)生培養(yǎng)物(表6)。次要元素的水平減少也會(huì)減少響應(yīng)。當(dāng)每一次要元素在較高的濃度下進(jìn)行個(gè)別試驗(yàn)，而其他元素維持在正常水平(1X)時(shí)，只有較低水平的鉬酸鹽或鐵似乎減少了響應(yīng)。因此，看上去無(wú)特別的次要元素能清楚地控制這種響應(yīng)。但是，最好的器官發(fā)生愈傷組織生長(zhǎng)物只有當(dāng)所有的次要因素都以高濃度存在時(shí)才能得到。初步實(shí)驗(yàn)表明5～6mm長(zhǎng)的胚胎給出了最大器官發(fā)生能力的培養(yǎng)物，在一些基因型，包括CV Williams 82中，可高達(dá)100%(表4)表4胚胎大小對(duì)于從未成熟大豆胚胎的愈傷組織培養(yǎng)器官發(fā)生的影響。在培養(yǎng)開始4星期后進(jìn)行觀察，使用CV.Williams 82，在OR培養(yǎng)基上，具有每次處理的40個(gè)胚胎。
大小(mm) 器官發(fā)生(%)1.5 02.0 03.0 214.0 535.0-6.0 1006.0-7.0 108.0或更大 -a在形成器官發(fā)生的培養(yǎng)物的平板上未成熟胚胎的百分?jǐn)?shù)。
表5較高濃度的MS次要元素對(duì)于從未成熟大豆胚胎在愈傷組織培養(yǎng)物中的器官發(fā)生所產(chǎn)生的影響，在培養(yǎng)開始4星期后進(jìn)行觀察，使用CV·Williams 82，在具13.3μMBAP的MS培養(yǎng)基上具有每次處理的40個(gè)胚胎。次要元素是H3BO3，MnSO4，KI，Na2MoO4·2H2O，CuSO4·5HO和COCl2·6H2O。
次要元素的相對(duì)濃度器官發(fā)生(%)a1 80b2 75b3 604 545 62a形成器官發(fā)生培養(yǎng)物的板上未成熟胚胎的百分?jǐn)?shù)。
b胚胎發(fā)芽?jī)?yōu)先于器官發(fā)生愈傷組織形成。
表6BAP濃度對(duì)于在從未成熟大豆胚胎的愈傷組織培養(yǎng)物中器官發(fā)生的影響。在培養(yǎng)開始4星期后觀察，使用CV·Williams 82，在具4倍次要元素濃度的MS培養(yǎng)基上具有每次處理的40個(gè)胚胎。
BAP(μM) 器官發(fā)生(%)a3.3 116.6 99.9 9013.3 80a形成器官發(fā)生的培養(yǎng)物的平板上未成熟胚胎的百分?jǐn)?shù)。
組織學(xué)的研究證明了這些培養(yǎng)的器官發(fā)生的實(shí)質(zhì)?？梢钥匆妿讉€(gè)芽的分生組織。這些分生組織不是在同樣的平面上都可以看見的，盡管這些平面可有預(yù)存在的分生組織的少量增生。所觀察到的是從分化的組織的分生位置的典型的從頭的啟動(dòng)。
器官發(fā)生培養(yǎng)是在黑暗中開始的。光照將誘發(fā)未成熟合子胚胎的發(fā)芽，因此，所得到的愈傷組織在黑暗里或者直接形成芽，或隨后變?yōu)槠鞴侔l(fā)生。當(dāng)最初的器官發(fā)生(芽啟動(dòng))時(shí)需要黑暗，進(jìn)一步的生長(zhǎng)則需要光。培養(yǎng)物在OR培養(yǎng)基上開始培養(yǎng)4星期后，培養(yǎng)物再置于增生培養(yǎng)基MSR或R5上，并光照，這樣，它們生長(zhǎng)很迅速，每2～3星期就需要轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，越來(lái)越多的芽就產(chǎn)生了。在高的BAP濃度(13.3)μM下，四個(gè)月后，培養(yǎng)物形成易碎的非器官發(fā)生的愈傷組織。一旦芽再生被啟動(dòng)，為了使器官發(fā)生培養(yǎng)物進(jìn)一步增生和維持，在培養(yǎng)基中不再需要高濃度的BAP和次要元素。當(dāng)芽在MSR或R5培養(yǎng)基上長(zhǎng)到約1cm高后，它們可以不經(jīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上以誘發(fā)根的形成，然后，轉(zhuǎn)移到溶液裁培培養(yǎng)基中，再移至暖房生長(zhǎng)和成熟。
器官發(fā)生的培養(yǎng)物在MSR或R5培養(yǎng)基上維持18個(gè)月以上，仍然保持器官發(fā)生的能力，可以重新產(chǎn)生植物。采用這種方法，每次轉(zhuǎn)移可再生10～40株植物，因?yàn)槊總€(gè)愈傷組織可減數(shù)分裂為4～6個(gè)另外的片斷，片斷增生就增加了植物數(shù)量。
采用前面所述的方法，從未成熟大豆胚胎得到高達(dá)100%的通過(guò)器官發(fā)生方法產(chǎn)生的再生植物是可能的。這個(gè)體系對(duì)于所有的基因型試驗(yàn)是成功的，只是在再生的百分?jǐn)?shù)上略有不同。因此，不同的基因型，如成熟種類、種子外衣顏色等的不同，不致于從本質(zhì)角度影響植物再生。在子葉結(jié)上形成的芽的數(shù)量與植物再生能力之間也沒有明顯的聯(lián)系。
實(shí)例2體細(xì)胞克隆變化為了測(cè)定從器官發(fā)生的大豆培養(yǎng)物是否發(fā)生了植物再生以及這些植物的子代顯示的自發(fā)變化，對(duì)R0，R1，R2和R3植物進(jìn)行了質(zhì)量變化的形態(tài)觀察的檢查。
大豆(Glycine max L.Merr.)種子A3127，Adams，Capitol，CN210 Earlyana，P I36.653，P I361.063，P I404.155 A和Williams 82是從地區(qū)大豆種質(zhì)收集中心，伊利諾斯，Urbana，伊利諾斯大學(xué)得到的。胚胎基因和器官發(fā)生培養(yǎng)是從未成熟胚胎開始的，并如例1描述的方法和U.B.Barwale等(1986)《planta》supra描述的方法維持，這里優(yōu)先采用兩種方法的結(jié)合。從這些植物得到的自身種子被植于大田里或發(fā)往Puerto Rico的幼苗室過(guò)冬。R0植物的自身種子繁衍，生出一R1族，每一個(gè)R1植物繁衍出一個(gè)新的R2族。在Puerto Rico生長(zhǎng)的族肉眼觀察不到變化，但是R1、R2和R3族，在伊利諾斯Urbana生長(zhǎng)的，被評(píng)價(jià)為有很大的質(zhì)量變化。每一族的十二顆種子植于1.2米長(zhǎng)的列中(每列間隔空間為0.8米)。對(duì)照種子(植物的自身種子，它不經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)周期)也被植入以進(jìn)行比較。對(duì)特性，例如葉子數(shù);葉子形態(tài);葉綠素不足;植物的高度、花的顏色、不育、多重分枝和出芽、生長(zhǎng)習(xí)性、在整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)中的青春期和成熟期進(jìn)行評(píng)價(jià)。263株R0植物產(chǎn)生263個(gè)R1族，其中153個(gè)R1族已進(jìn)行了一次以上的再生檢查。只有R1族產(chǎn)生多于12顆籽的生長(zhǎng)。單個(gè)R1植物引起了下一個(gè)再生的R2族。使用在Puerto Rico得到的大量種子的所有再生進(jìn)行了所有的評(píng)價(jià)。66個(gè)R2族(5578株R2植物)和548個(gè)R3族(13415株R3植物)進(jìn)行生長(zhǎng)，并在這個(gè)研究中被采用目測(cè)評(píng)價(jià)。
在R1、R2和R3世代中，觀察到不同的表現(xiàn)型，包括葉綠素不足，完全或部分不育，皺折葉子形態(tài)，雙種子，異常葉子形態(tài)，異常葉子數(shù)，矮小生長(zhǎng)習(xí)性和多重出芽。
非致死的葉綠素不足在幾個(gè)A3127族的R2和R3世代中被注意到。這些植物的葉綠素不足，生長(zhǎng)不及對(duì)照植物旺盛，在一個(gè)族的大量種子中，2.7%R2植物和7.1%R3植物用這種特性分開。在R3世代中的分離比率使3∶1模型適合于表示出這種特性世代繁衍的穩(wěn)定遺傳的隱性、單個(gè)的基因特性。1908株對(duì)照植物以外，二株顯示了葉綠素不足(0.1%分離比率)，這就消除了這種表現(xiàn)型可被歸結(jié)為環(huán)境因素的可能性。因?yàn)檫@種特性被穩(wěn)定地遺傳，在這個(gè)表現(xiàn)型上可能引起疾病的可能性是小的。
完全不育在CN210 R2世代上被觀察到。15.6%(表7)的分離比率適合3∶1模型，以可用X平方的數(shù)值測(cè)定。該數(shù)據(jù)表現(xiàn)了從R1到R2世代的不育的穩(wěn)定遺傳。對(duì)照植物不顯示這個(gè)特性。
在R3世代中，可以看到皺折的葉子形態(tài)，35%同族植物用這種表現(xiàn)型分開(表7)。同族的R2種子生長(zhǎng)，在葉子形態(tài)上顯示出很小的變化。
上述特性指示一些可見的變異是穩(wěn)定遺傳的，并且看來(lái)是歸結(jié)于組織培養(yǎng)過(guò)程中的基因變化。在另外三個(gè)例子中，一種表現(xiàn)型只在R1世代中可以被看見(表7)。一些植物發(fā)展了雙種子;但不是所有在這些植物上的種子都是成雙的。異常的葉子形態(tài)和葉子數(shù)被發(fā)現(xiàn)是隨機(jī)發(fā)生的。不是在植物上所有三葉型都顯示這種表現(xiàn)型。顯示這種表現(xiàn)型的小三葉型的最大數(shù)量是3。顯示矮個(gè)生長(zhǎng)習(xí)性的植物被發(fā)現(xiàn)其他的特性是正常的;但是，這些特性的基因不能用分離比率測(cè)定(表7)。可以看見花朵色澤并無(wú)差異。而多重出芽也被發(fā)現(xiàn)是隨機(jī)的。
對(duì)于雙種子、矮個(gè)生長(zhǎng)習(xí)性、異常葉子形態(tài)、葉子數(shù)和多重出芽(表7)，現(xiàn)有的分離數(shù)據(jù)很難測(cè)定這些特性的遺傳性。在這個(gè)世代(表8)中，除了三株R1變異，沒在這一代中發(fā)現(xiàn)其他的變異體。但是，大量的R2和R3族表示了變異的表現(xiàn)型。
表現(xiàn)型變異的頻率通過(guò)將在R1族中不同質(zhì)量變異的變異表現(xiàn)型的總數(shù)以同一系列的R1族總樣品數(shù)相除來(lái)計(jì)算。這種計(jì)算頻率的方法相似于S.Edallo等(1981)“與體內(nèi)培養(yǎng)有關(guān)的染色體變異和自發(fā)突變頻率以及在玉米中植物的再生”《Maydica》第26卷39～56;和T.B.Rice(1982)“減少在玉米上再生的近親繁殖的遺傳變異的細(xì)胞培養(yǎng)”《第三十七屆谷物和高梁工業(yè)研討年會(huì)記錄》，美國(guó)種子交易協(xié)會(huì)，華盛頓特區(qū)，pp.148～162上所描述的方法。每個(gè)R0植物的頻率范圍為0～4(表9)。A3127和Williams 82的低頻率可能是使人誤解的，因?yàn)橄嗨频谋憩F(xiàn)型是一次計(jì)數(shù)的，盡管它們可能是相似的，但是它們是互不相關(guān)的，有大量R1族是從這兩種表現(xiàn)型中取樣的。相似的表現(xiàn)型不能計(jì)算作為不相關(guān)連的事物，因?yàn)榕咛ピ吹挠涗洸槐槐Ａ?。因此，每株R0植物的初始物不可能被測(cè)定。表10顯示了總數(shù)為263個(gè)R1族中153個(gè)R1族的可能的成熟頻率。余下110個(gè)R1族的R2和R3世代未進(jìn)行研究。
由Williams 82的胚胎培養(yǎng)物和器官發(fā)生培養(yǎng)物得到的植物子代被檢測(cè)。表9顯示了在從所述兩種培養(yǎng)體系得到的族的R1和R2世代中觀察到的變異。一個(gè)R1族和這個(gè)R1族繁衍的12個(gè)R2族在每一培養(yǎng)體系中被檢測(cè)。在兩種體系中觀察到的變異是相似的，在胚芽培養(yǎng)衍生物中都具有較高的葉綠素不足的頻率。另外一些表現(xiàn)型具有相似的分離比率(表9)。三種瓣?duì)畹陌谆∫苍趶呐咛ヅ囵B(yǎng)的R0植物中被觀察到，這些都不能生長(zhǎng)到成熟，并且得不到種子。
表7從不同基因型的器官發(fā)生的愈傷組織培養(yǎng)衍生的R2和R3族中觀察到的不同表現(xiàn)型大豆 變異 變異 植物 分離因型型表現(xiàn)型數(shù) 的總數(shù)比率(%)aA3127 雙種子 2 62 3.2矮個(gè)生長(zhǎng) 2 30 6.6異常葉子形態(tài) 2 26 1.7異常葉子數(shù) 1 29 3.7
皺折葉子 1 20 35.0★葉綠素不足 1 14 7.1★P136.653 多重芽 1 25 4.0CN210 不育 8 51 15.6★對(duì)照A3127 葉綠素不足 2 1908 0.1矮個(gè)生長(zhǎng) 1 1908 0.1CN210 0 140 0.0P136.653 葉綠素不足 1 157 0.6a在表現(xiàn)出特性的每個(gè)R2或R3族中變異表現(xiàn)型的頻率。
＊與大于0.05概率水平的3∶1模型相適應(yīng)的X平方值。
表8在顯示出變異表現(xiàn)型的不同世代中的族的數(shù)目。
植物世代再生 變異表現(xiàn)型 表現(xiàn)出變異性的族數(shù)R0化學(xué)白化體 3Ra1葉綠素不足 1異常葉子形態(tài) 1皺折葉子類型 1Rb2葉綠素不足 11異常葉子形態(tài) 3不同葉子數(shù) 4矮個(gè)生長(zhǎng)習(xí)性 1Rc3葉綠素不足 29異常葉子形態(tài) 28不同葉子數(shù) 21矮個(gè)生長(zhǎng)習(xí)性 4
皺折葉子類型a200個(gè)R1族用于檢驗(yàn)變異表現(xiàn)型。
b66個(gè)R2族用于檢驗(yàn)變異表現(xiàn)型。
c548個(gè)R3族用于檢驗(yàn)變異表現(xiàn)型。
表9以Williams 82的胚胎培養(yǎng)和器官發(fā)生的愈傷組織培養(yǎng)中衍生的R1和R2上觀察到的變異表現(xiàn)型世代變異表現(xiàn)型總數(shù)變異數(shù)分離比率(%)a胚胎發(fā)生R2葉綠素不足 21 6 28.5異常葉子形態(tài) 26 1 3.8器官發(fā)生R2葉綠素不足 25 1 4.0異常葉子形態(tài) 31 1 3.2異常葉子數(shù) 30 1 3.3a.在每個(gè)表達(dá)這種特性的R2族中，變異表現(xiàn)型的頻率表10從用于研究體細(xì)胞克隆變異a的9種大豆基因型檢測(cè)到的在R1族中可見變異的頻率大豆基因型 R1族b的數(shù)目每個(gè)R0植物成熟基因型的頻率A3127 16 0.11Adams 3 1.33Capitol 1 4.00CN210 4 1.00Earlyana 1 1.00P136.653 15 0.53P1361.063 1 2.00P1404.155A 5 1.60Williams 82 47 0.11a從一種基因型的幾種胚胎再生的植物，培養(yǎng)時(shí)間比再生推前60～350天。
b得到12顆種子以上的再生植物的數(shù)量。
c在一給出的系列中，在所有R1族中觀察到的成熟表現(xiàn)型的總數(shù)除以R1族的總數(shù);在二個(gè)或更多的同一基因型的R1族中相同的成熟表現(xiàn)型作為一單獨(dú)的成熟事件計(jì)數(shù)。
實(shí)例3疾病抵抗力如實(shí)例1中描述的器官發(fā)生和胚胎愈傷組織生長(zhǎng)于phialophor gregate，一種引起褐色莖腐爛的致病菌培養(yǎng)濾液中，在1∶4(v/v-濾液培養(yǎng)基)的濃度下，如下7種基因型被用于試驗(yàn)BSR-201，Century，PZ.437，833，Corsoy，A3127，Williams-82和P I84946-2?；蛐虰SR-201，PZ·437，833和PZ84946-2對(duì)于褐色莖腐爛具有抵抗力[Sebastian，S·A·等(1985)《J.Hered.》第76卷194頁(yè);Sebastian，S·A·等(1985)《Crop.Sci.》第25卷753頁(yè);Gray，L·E·等(1985)《世界大豆研討會(huì)記錄Ⅲ》，科羅拉多州，Bouldrt，Westview Press 598～601頁(yè)]。當(dāng)從敏感基因型的相同類型的愈傷組積被濾液殺死后，從抗體基因型中得到的易碎的器官發(fā)生和胚胎愈傷組織對(duì)于濾液是不敏感的。敏感基因型的培養(yǎng)物在1∶4(v/v)(濃度)的培養(yǎng)濾液存在下生長(zhǎng)，該濾液是亞致死的，30～40天以后，改善了生長(zhǎng)特性的培養(yǎng)物被選擇出來(lái)，用于再生有疾病抵抗力的可繁殖的植物。
實(shí)例4對(duì)除草劑的抵抗力如實(shí)例1中描述的基因型A3127和Williams 82的器官發(fā)生的愈傷組織分別在毒和亞致死水平的鎮(zhèn)草寧(非選擇性除草劑)、對(duì)草快和莠去津存在下生長(zhǎng)。所使用的濃度是這樣的25～200μM鎮(zhèn)草寧，15～25μM對(duì)草快和10～100μM莠去津。
在高濃度的這些物質(zhì)存在下較好生長(zhǎng)的培養(yǎng)物被選擇出來(lái)用于可繁殖植物的再生，可繁殖植物對(duì)于各種除草劑是有抵抗力的。對(duì)草快-耐受培養(yǎng)物進(jìn)一步試驗(yàn)，以測(cè)定對(duì)于一定量致病菌的抵抗力，與對(duì)草快耐受體相關(guān)的疾病被鑒定。
實(shí)例5耐逆境的抵抗力如實(shí)例1中描述的A3127和Williams 82的分離器官發(fā)生的愈傷組織，在熱至40℃，冷至4℃的時(shí)間變化周期下進(jìn)行生長(zhǎng)。處理后殘留的愈傷組織作脯氨酸增強(qiáng)試驗(yàn)，穩(wěn)定的培養(yǎng)物被選擇出來(lái)再生以形成對(duì)逆境有抵抗力的可繁殖植物。
實(shí)例6對(duì)不良土壤條件的抵抗力如實(shí)例1中描述的A3127基因型的分離器官發(fā)生的愈傷組織在濃度為0.001～0.3mM的鎘，pH約5.7;0.01～0.6mM銅，0.001～3.0mM鋅或0.001～3.0mM鉛，且銅、鋅和鉛溶液在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的pH約為～4.2;或0.1%～10% NaCl存在下生長(zhǎng)。表現(xiàn)出改善生長(zhǎng)的培養(yǎng)物被選擇出來(lái)進(jìn)行對(duì)各種不良土壤條件具有抵抗力的可繁殖的植物的再生。
實(shí)例7提高的氨基酸的過(guò)量產(chǎn)生如實(shí)例1中描述的A3127和Williams 82分離器官愈傷在組織對(duì)氨基酸進(jìn)行毒性模擬的條件下生長(zhǎng)4～8星期，氨基酸的濃度列于表11中。
表11氨基酸的過(guò)量產(chǎn)生氨基酸 毒性模擬物 濃度脯氨酸 羥脯氨酸 0.2～1.2mM氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸鹽 0.01～0.03mM蛋氨酸 乙硫氨酸 0.01～0.3mM色氨酸 5-甲基色氨酸 0.01～0.3mM苯丙氨酸 P-氟代苯丙氨酸 0.01～3mM在毒性模擬物下很好生長(zhǎng)的培養(yǎng)物被選擇出來(lái)進(jìn)行可繁殖植物的再生，這些可繁殖植物經(jīng)過(guò)毒性模擬的選擇，具有提高的氨基酸水平。所選出的具對(duì)位-氟代苯丙氨酸的培養(yǎng)物進(jìn)一步進(jìn)行多酚過(guò)量生產(chǎn)試驗(yàn)，陽(yáng)性物再進(jìn)一步進(jìn)行對(duì)各種昆蟲和疾病抵抗力的試驗(yàn)。表現(xiàn)出這樣的抵抗力的這些培養(yǎng)物進(jìn)行具有所試驗(yàn)的抵抗力的可繁殖的植物的再生。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生包括大豆屬物種細(xì)胞的器官發(fā)生組織培養(yǎng)物的方法，該法包括在含有細(xì)胞激動(dòng)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所說(shuō)大豆屬物種的未成熟胚，而所說(shuō)細(xì)胞激動(dòng)素的濃度應(yīng)足夠高，以防止胚發(fā)芽，并促使器官發(fā)生芽的產(chǎn)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說(shuō)的細(xì)胞激動(dòng)素是BAP。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于所說(shuō)BAP的濃度約在10μM和15μM(每升)之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說(shuō)培養(yǎng)基還包括MS培養(yǎng)基的微量營(yíng)養(yǎng)物，其濃度約為正常濃度的4至6倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說(shuō)的大豆物種是Glycine max。
6.一種在權(quán)利要求
1的培養(yǎng)基上所產(chǎn)生的芽再生而成的植物或其子代。
7.一種從大豆屬物種的結(jié)枝組織再生成整株植物的方法，它包括將所說(shuō)的結(jié)枝組織移入包含Hoagland溶液的溶液培養(yǎng)基中，直至其明顯地生長(zhǎng)，然后將所說(shuō)的結(jié)枝組織移入包含土壤的培養(yǎng)基中，直至發(fā)育成整株植物，所說(shuō)的Hoagland溶液被稀釋至正常濃度的1/4，并對(duì)其成份進(jìn)行調(diào)整，以包括微量營(yíng)養(yǎng)物，而微量營(yíng)養(yǎng)物包括KCL，H3BO3，MnSO4，ZnSO4，CuSO4，和(NH4)6Mo7O24。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于所說(shuō)整株植物包括由體細(xì)胞克隆變異而誘發(fā)的遺傳性穩(wěn)定突變。
9.一種產(chǎn)生含有Glycine max細(xì)胞的組織培養(yǎng)物的方法，它包括在含有約10μM/1至15μM/l BAP和微量營(yíng)養(yǎng)物(其濃度為MS培養(yǎng)基中微量營(yíng)養(yǎng)物正常濃度的4至6倍左右)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)未成熟的Glycine max胚。
10.一種產(chǎn)生大豆屬物種的植物的方法，所說(shuō)植物包括由體細(xì)胞克隆變異所產(chǎn)生的遺傳性狀，該方法包括(a)將包含所說(shuō)物種細(xì)胞的組織培養(yǎng)物連續(xù)地維持足夠時(shí)間，以使所說(shuō)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生體細(xì)胞克隆變異;(b)從所說(shuō)組織培養(yǎng)物再生成整株植物;(c)獲得所說(shuō)整株植物的子代;(d)對(duì)至少二代所說(shuō)植物及其子代的所需性狀進(jìn)行觀察;和(e)選出顯示所需性狀的子代植物。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生大豆屬物種(最好是Glycine max)，的器官發(fā)生組織培養(yǎng)物，并再生成整株植物的方法，該法涉及使用器官發(fā)生的組織培養(yǎng)基，而所說(shuō)培養(yǎng)基中包括高濃度的細(xì)胞激動(dòng)素(最好至少約為10μM BAP)，而且最好還包括至少約為正常濃度3倍的MS微量營(yíng)養(yǎng)物。器官發(fā)生培養(yǎng)基適用于產(chǎn)生具有由體細(xì)胞克隆變異而誘發(fā)的所需性狀的植物。
文檔編號(hào)A01H1/04GK87107227SQ87107227
公開日1988年9月28日 申請(qǐng)日期1987年12月2日
發(fā)明者厄沙B·巴韋爾, 杰克M·惠特霍姆 申請(qǐng)人:盧布里紹爾遺傳學(xué)公司(內(nèi)華達(dá)公司), 伊利諾斯州立大學(xué)理事會(huì)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan